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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2015, 31(12):256-261
单抗类药物的出现为人类一些自身免疫病、癌
症等疑难病的诊断与治疗开辟了广阔前景，在为人
类健康作出突出贡献的同时也为企业带来非常可观
的收入，已成为近年来销售额最高的一类生物技术
药物［1-3］。虽然哺乳动物细胞培养技术要求高、抗
体表达能力低、生产成本高，但具有其它表达系统
无法取代的优势 ：能够准确的完成糖基化、折叠、
链内及链间二硫键的形成等一系列翻译后修饰，因
此其表达的抗体在分子结构、理化特性和生物学功
能方面更接近天然产物［4］。自 1996 年以来，FDA
批准的生物技术产品中，有 2/3 以上是通过哺乳动
物细胞系统生产的［5］。中国仓鼠卵巢细胞（Chinese
hamster ovary，CHO）由于具有抗剪切力，易于放大
培养的优势，是目前使用最广泛的哺乳动物细胞表
达系统［6］。目前使用最广泛的 CHO 表达系统是二
氢叶酸还原酶（DHFR）和谷氨酰胺合成酶（Glutamine
收稿日期 ：2015-03-10
基金项目 ：广东省引进创新科研团队计划（201101Y0104990178）
作者简介 ：肖尚，男，硕士研究生，研究方向 ：动物细胞大规模培养 ；E-mail ：xiaoshang@hecpharm.com
通讯作者 ：杨彬，男，工程师，硕士研究生，研究方向 ：单抗生产 ；E-mail ：547860796@qq.com
pH 对重组 CHO 细胞生长、单抗表达及质量的影响
肖尚  邓崇飞  柯军  鄢成伟  孙文正  杨彬 
（广东东阳光药业有限公司，东莞 523000）
摘 要 ： 在 1 L 反应器中探究 pH 对 CHO 细胞生长、单抗表达及质量的影响。在 1 L 反应器中对 pH 进行探究，实验研究表
明当 pH 为 7.05 时最适合 CHO 细胞生长和抗体表达，在此条件下培养时第 9 天获得最高细胞密度 1.54×107cells/mL，在第 11 天获
得最高抗体浓度 1 355.71 mg/L。pH 对 pCO2、乳酸积累、抗体的单体含量、电荷异质性和糖基化也有较大影响，当 pH 在 6.95 至 7.25
之间时，高 pH培养能够降低乳酸积累和 pCO2，但是会导致抗体的碱性峰增加。pH两项培养能够降低细胞活力，从而提高抗体表达量。
关键词 ： pH ；CHO 细胞 ；抗体 ；pCO2 ；电荷异质性
DOI ：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.12.037
The Effects of pH on Cell Growth，Monoclonal Antibody Expression
and Quality of a Recombinant CHO Strain
Xiao Shang Deng Chongfei Ke Jun Yan Chengwei Sun Wenzheng Yang Bin
（Sunshine Lake Pharma Co.，Ltd，Dongguan 523000）
Abstract: It was to study the effect of pH on the growth, monoclonal antibody expression and produce quality of a rewmbinant CHO
strain. The results showed that the optimal pH for cell growth and the production of monoclonal antibody（mAb）was 7.05. Under this pH, a
peak viable cell density was 1.54×107 cells/mL at day 9 and the highest harvested antibody concentration was 1 355.71 mg/L after cultivating for
11 days. In addition, pH significantly affected the accumulation of pCO2 and lactate in cell cultures, as well as the expressed product’s quality
including its monomer ratio, charge variant species, and glycosylation pattern. While pH ranging from 6.95 to 7.25, cell cultures at higher pH
reduced pCO2 and the accumulation of lactate, but led the alkaline peak of antibody increase. Cultures at 2 sets of pH decreased the cell activity,
therefore increased the expression of antibody.
Key words: pH ；CHO cell ；antibody ；pCO2 ；charge variants
2015,31(12) 257肖尚等：pH对重组 CHO细胞生长、单抗表达及质量的影响
synthetase，GS）表达系统。
目前国内很多科研院校和企业的宿主细胞抗体
表达水平都很低，抗体浓度多处于 1 000 mg/L 以内［7］，
很难用于实际生产。而在发达国家，宿主细胞抗体
表达量往往都在 1 000 mg/L 以上［8-10］。其次，我国
动物细胞培养技术还不成熟，与发达国家差距较大。
目前我国动物细胞培养更多的工作是为了提高抗体
的表达量而很少关注抗体的质量。动物细胞培养技
术已成为我国抗体类药物走向产业化、实现其经济
价值，满足市场需求的瓶颈［3］。
目前动物细胞大规模培养的主流方式是利用搅
拌式生物反应器进行流加培养，相应的反应器放大
设计和操作成为新的挑战，这其中的主要关键技术
涉及剪切力、氧传递、均一性、二氧化碳分压（pCO2）
控制、pH 控制、渗透压及抗体的质量等问题［11-15］。
本研究主要探究 pH 对 CHO 细胞生长、抗体表达及
质量、pCO2 等的影响，以期为国内细胞培养工艺和
QbD 方法运用时风险评估提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料　
1.1.1 CHO 细胞 所用 CHO 细胞为 GS-CHO，表达
抗 TNFα 抗体，由本实验自主构建并保藏。
1.1.2 培养基 所用基础培养基为CD EfficientFeedTM
B，购买至 Gibco 公司。所用流加培养基为 Acti CHO
Feed-A CD 和 Acti CHO Feed-B CD， 均 购 买 至 PAA
公司。
1.1.3 主要仪器 细胞活力分析仪（上海睿钰生物
科技有限公司）；1 L 生物反应器（荷兰 Applikon 生
物技术公司）；NOVA 多参数生化分析仪（美国 Nova
生物有限公司）；高效液相色谱安（安捷伦科技有限
公司）。
1.2　方法
1.2.1 培养方法 将液氮冷冻保藏的 CHO 细胞复苏
后，装入一次性摇瓶在 37℃、130 r/min、8% 的 CO2
条件下进行扩大培养，每 3 d 传代 1 次，传代密度
为 5×105 个 /mL。最后将细胞以 10×105 个 / mL 的
密度接入 1 L 反应器进行发酵培养。
1.2.2 细胞计数及活力分析 台盼蓝染色后由细胞
活力分析仪自动计数及分析活力。
1.2.3 葡萄糖、谷氨酸、管氨酰胺、乳酸、铵根、
pCO2 测定 使用 NOVA 多参数生化分析仪测定。
1.2.4 HPLC 法检测抗 TNFα 抗体浓度 用 0.1 mol/L
磷酸缓冲液以 2 mL/min 流速平衡 HPLC 系统 15 min
至基线平稳，于系统程序中设置标准曲线法程序。
进样 50 μL 于进样器，以 2 mL/min 流速洗脱，记录
有关数据，并进行处理。
1.2.5 HPLC 法检测抗 TNFα 抗体电荷异质性 进样
体积 100 μL，流速 1 mL/min，检测波长 280 nm，样
品盘温度 8℃，柱温 40℃，运行时间 22 min。
1.2.6 毛细管电泳测定抗 TNFα 单抗纯度 毛细管
电泳系统分别用 1 mol/ L NaOH 洗 5 min、水洗 5 min
及分离缓冲液洗 10 min。每次进样前，分别用 0.1
mol/L NaOH 及分离缓冲液洗 1 min 后即可进样。毛
细 管 长 30.2 cm， 有 效 长 度 20 cm， 检 测 波 长 220
nm，柱温 25℃，样品盘 15℃。
1.2.7 HPLC-MS 检测抗 TNFα 抗体糖基化 色谱条
件（色谱柱：Agilent-C8，75×2.1 mm，5 μm，300 埃）：
进样体积 2 μL，检测波长 280 nm，流速 0.5 mL/min，
柱温 75℃，样品盘温度 8℃ ；
质谱条件 ：仪器模式 Auto MS/MS，离子模式
Dual AJS ESI 源，阳离子，干燥气体 N2，12 L/min，
325℃ ；碰撞电压 260 V ；工作电压 65 V ；毛细管电
压 4 000 V；夹套气体温度（流速）：350℃，12 L/min；
气体温度 325℃ ；VCap ：3 500 V ；喷头电压 1 000 V ；
分离器电压 65 V ；OCT 1 RF Vpp 电压 750 V ；质量
范围 500-3 200 m/z。
1.2.8 HPLC 法检测抗 TNFα 抗体多聚体含量 取
25 μL 样品加缓冲液 1 mL 稀释，上样 10 μL，流速
0.5 mL/min ；检测波长为 280 nm。
2 结果
2.1 单相pH培养对CHO细胞的影响
在 1 L 反应器中探究 pH 对 CHO 细胞生长、抗
体表达等生理代谢的影响，选择研究的 pH 范围为
6.95 至 7.25，用 CO2 和 7.5% 的碳酸氢钠来控制 pH，
pH 控制的死区范围为 ±0.05，实验平行数为 2。1 L
反应器初始培养体积为 400 mL，接种密度为 1.0E+
06 cells/mL，OD 控制在 40% ；转速第 0 天到第 5 天
为 150 r/min，之后为 196 r/min，培养温度均为 37℃
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.12258
恒温。培养初期用空气调节 OD，当通入的空气量
超过 0.1V VM 之后改通纯氧。培养至第 3 天后每
隔 24 h 流 加 9.6 mL cti CHO Feed-A CD 和 0.96 mL
Acti CHO Feed-B CD。共培养 11 d，实验结果如图 1
所示。
一般 pH 低于 6.8 或者大于 7.3 不适于 CHO 细
0 2 4 6 8 10 12
0
300
600
900
1200
Titer 6.95 7.05 7.15 7.25
Ti
te
r/mg·L-1 
culture days/d
-10
0
10
20
30
SPR 6.95 7.05 7.15 7.25
SP
R
pg·cell·day-1 
图 2 pH 对 CHO 细胞抗体表达的影响
0 2 4 6 8 10 12
0.0
2.0×106
4.0×106
6.0×106
8.0×106
1.0×107
1.2×107
1.4×107
1.6×107
V
ia
bl
e
C
el
l D
en
si
ty
/cells·mL-1 
culture days/d
Viable Cell Density 6.95 7.05 7.15 7.25
70
80
90
100
110
Viability 6.95 7.05 7.15 7.25
V
ia
bi
lit
y/
%
0
17
34
51
68
85
IVCD 6.95 7.05 7.15 7.25
IV
C
D
/E6 cells·day·mL-1 
图 1 pH 对 CHO 细胞生长的影响
胞的生长。通过图 2 发现随着 pH 的增加活细胞密
度和抗体表达量都呈现出先增大后降低的趋势。对
于本实验所用 CHO 细胞，最优 pH 为 7.05，在此条
件下培养第 9 天获得最大细胞密度 1.54×107 个 /mL，
第 11 天获得最高抗体浓度 1 355.71 mg/L，但当 pH
为 6.95 时在第 9 天获得最大的每天单细胞抗体表达
量（SPR）为 26.04 pg。
在培养的过程中 pCO2 呈现出先下降后上升的趋势
（图 3），这主要是由于 CHO 细胞培养时前期产生乳
酸，中和培养基中碱性物质，导致 pCO2 降低（图 4）。
后期由于营养需求较大，乳酸产生的速率较低甚至
被消耗，且细胞密度较高，细胞代谢产生大量 CO2，
无法及时排出，导致 pCO2 上升。对于相同的培养基，
当培养时设定的 pH 值越低，pCO2 值越大，可能是
由于需要更多的 CO2 去降低培养基的 pH。
从表 1 中可以看出 pH 对抗体的非还原纯度和
电荷异质性有影响，对多聚体影响不大。随着 pH
的增大，抗体非还原纯度呈现先上升后下降的趋势，
在 pH 为 7.05 时获得最大抗体非还原纯度 96.85% ；
随着 pH 的增加，抗体主峰在下降，碱性峰在上升，
酸性峰总体呈现下降的趋势，但变化量很小。表 2
说明 pH 对抗体的糖基化有影响，随着 pH 的增大
G2F、G1F 含量在下降，G0F、G1F-GN 含量在上升。
2.2 两相pH对CHO细胞的影响
在 1 L 反应器中探究在第 9 天将 pH 从初始 7.05
转成 6.95 时对细胞抗体表达的影响，结果如图 5 所
示。pH 能够影响许多酶的活性，从而对细胞的生长、
抗体表达、抗体质量等有比较大的影响。图 6 显示
出当 pH 从 7.05 调至 6.95，活细胞密度和细胞活率
动物细胞培养时 pCO2 受各种因素的影响 ：pH、
通气、培养基成分、细胞代谢等。在本实验中发现
2015,31(12) 259肖尚等：pH对重组 CHO细胞生长、单抗表达及质量的影响
都有所下降，但由于 pH 变化幅度比较小，所以对
细胞没有造成严重的损伤，活细胞密度和细胞活率
0 2 4 6 8 10 12
0
20
40
60
80
100
120
pC
O
2mmHg
culture days/d
pH:6.95 pH:7.05 pH:7.15 pH:7.25
0 2 4 6 8 10 12
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
La
ct
at
e/
g·L-1 
culture days/d
pH:6.95 pH:7.05 pH:7.15 pH:7.25
图 3 pH 对 pCO2 的影响 图 4 pH 对乳酸积累的影响
表 1 pH 对抗体纯度及电荷异质性的影响
设定 pH 抗体浓度 /（mg·L-1） 非还原纯度 /%
电荷异质性 多聚体
酸性峰 /% 主峰 /% 碱性峰 /% HMW/% MP/% LMP/%
6.95 1162.30 95.98 21.47 61.04 17.49 0.06 99.91 0.03
7.05 1355.71 96.85 20.95 61.36 17.69 0.02 99.98 0
7.15 995.57 95.12 19.81 56.69 23.50 0.05 99.93 0.02
7.25 963.75 94.94 20.08 55.82 24.11 0.08 99.92 0
表 2 pH 对抗体糖基化的影响
设定 pH G2F/% G1F/% G0F/% G1F-GN/%
6.95 8.53 39.85 48.97 2.65
7.05 7.03 39.12 51.04 2.81
7.15 6.99 38.52 51.39 3.10
7.25 6.84 37.43 52.25 3.49
9 10 11
10
12
14
16
Viable Cell Density pH single pH shift
V
ia
bi
lit
y/
%
V
ia
bl
e
C
el
l D
en
si
ty
/106 cells/mL
culture days/d
80
85
90
95
Viability pH single pH shift
图 5 pH 两项培养对细胞生长的影响
9 10 11
800
1000
1200
1400
1600
SP
R
Titer pH single pH shift
Ti
te
r
culture days/d
12
18
24
30
SPR pH single pH shift
图 6 pH 两项培养对抗体表达的影响
下降程度不大。
pH 调整后 SPR 值有所上升，使得最后获得的
抗体浓度比单项 pH 培养时要高。这些可能是由于
细胞自身的代谢和抗体表达都需要消耗营养物质和
能量，而抗体在后期大量表达，导致后期营养和能
量需求比较大，流加的营养和细胞自身所产生的能
量不能同时满足细胞生长和抗体表达所需。当 pH
调至 6.95 后细胞密度和活率有所降低，减少了由于
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.12260
细胞自身生理代谢所消耗的营养和能量，就使得有
更多的营养和能量用于抗体合成。
3 讨论
以动物细胞为载体生产单克隆抗体已越来越受
到重视，但目前国内的研究更多的停留在培养基开
发［20］和工艺开发［7］上，很少关注单抗的质量属性。
目前国际制药巨头已经深入理解和实施 QbD 理论，
将工艺与药品的质量联系起来，做到药品的质量是
生产出来的而不是检测出来。而国内的企业对工艺
与产品质量之间的联系研究不够深入，不能很好的
实施 QbD 理论。本研究考察了 pH 对 CHO 的生长、
活力及单抗的表达量、非还原纯度（纯化后）、电荷
异质性、糖基化、多聚体的影响，将生产工艺与单
抗质量建立联系。
pH 设定点的不同会对细胞内许多酶的活性产生
重要影响从而对细胞的生长、活力以及单抗表达有
很大的影响，这在国内外有很多文献报道。pH 两相
培养能够降低细胞活力，从而将更多地营养和能量
提供给抗体合成，提高单抗表达量。
由于 CHO 细胞培养时前期产生大量乳酸，中
和培养基中碱性物质，使得 CO2 溢出培养基，导致
pCO2 降低。后期细胞培养营养需求大，乳酸从积
累变成消耗，且细胞密度较高，细胞代谢产生大量
CO2，无法及时排出，导致 pCO2 上升，所以 pCO2
呈现先上升后下降的趋势。
研究结果表明 pH 对单抗的电荷异质性和半
乳糖糖基化有较大影响，半乳糖糖基化对抗体的
ADCC 和 CDC 效应有重要影响。随着 pH 的增加，
抗体主峰在下降，碱性峰在上升，酸性峰总体呈
现较小趋势的下降，G2F、G1F 含量在下降，G0F、
G1F-GN 含量在上升。抗体非还原纯度对单抗的免疫
源性有重要影响，pH 对单抗的非还原纯度（纯化后）
有影响，随着 pH 的增大，呈现先上升后下降的趋势，
在 pH 为 7.05 时获得最大抗体非还原纯度 96.85%。
由于 pH 对单抗的质量有重要影响，并且细胞
培养时 pH 值偏离设计空间的可能性较大，因此在
运用 QbD 方法生产单抗药物时，对 pH 进行风险评
估可将 pH 列为关键工艺参数。
4 结论
当 pH 为 7.05 时最适合本实验室 CHO 细胞生长
和抗体表达。在本研究的 pH 范围内，高 pH 培养能
够降低 pCO2，但是却促进了乳酸的积累 ；抗体的非
还原纯度随着 pH 的增加呈现先增高后降低的趋势 ；
较高的 pH 会导致碱性峰增高，主峰降低，但对酸
性峰影响不大 ；当培养的 pH 增加时 G2F、G1F 含
量在下降，G0F、G1F-GN 含量在上升。pH 两项培
养能够降低后期细胞活力和促进抗体表达。。
参 考 文 献
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（责任编辑　李楠）