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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2015, 31(5):214-223
传统化学农药由于操作简单、见效迅速、能快
速大规模生产而在农业生产中广泛使用，但其泛滥
使用会导致“3R”（抗性 Resistance、残留 Residue、
再猖獗 Resurgence）问题和生态环境恶化［1，2］。生
物防治（biological control）是利用天然产物，生物
体如细菌、真菌、线虫、昆虫或其代谢产物等对植
收稿日期 ：2014-10-18
基金项目 ：国家自然科学基金项目（31171640，31271888），无锡市科技项目（CLE01N1208），无锡中小企业创新基金项目（CBE01G1344）
作者简介 ：周文臣，女，硕士研究生，研究方向 ：发酵工程与农业生物技术 ；E-mail ：717244030@qq.com
通讯作者 ：詹晓北，男，教授，博士生导师，研究方向 ：生化工程与反应器等研究 ；E-mail ：xbzhan@yahoo.com
农药多抗性哈茨木霉的常压室温等离子体诱变
周文臣1  詹晓北1，2  朱莉2  郑志永1  吴剑荣1
（1. 江南大学生物工程学院 糖化学与生物技术教育部重点实验室，无锡 214122 ；2. 江苏瑞光生物科技有限公司，无锡 214125）
摘 要： 旨在为提高生防木霉菌对田间除草剂、杀虫剂以及杀菌剂共存的复杂环境的适应性，以生防菌哈茨木霉（Trichoderma
harzianum，GIM 3.442）为出发菌株，采用常压室温等离子体的方法对出发菌株进行诱变。结果显示，以杀菌剂代森锰锌和杀虫剂
呋虫胺为筛子，选育出对复合农药有良好抗性的诱变菌株。从中挑选双抗性最好的菌株 Th-36，以含有杀菌剂代森锰锌、杀虫剂呋
虫胺和除草剂乙氧氟草醚的 PDA 为诱变筛选培养基，再次进行诱变筛选，获得两株具有三抗特性菌株（Th-3-36 和 Th-4-B）。毒力
测试表明，抗性菌株 Th-3-36 和 Th-4-B 对代森锰锌、呋虫胺和乙氧氟草醚的 EC50 分别达到 5 089.2 μg a.i.·mL
-1 和 5 498.2 μg a.i.·mL-1、
758.5 μg a.i.·mL-1 和 785.9 μg a.i.·mL-1、198.2 μg a.i.·mL-1 和 200.3 μg a.i.·mL-1，均高于各农药的市售平均推荐使用浓度。筛选
到的突变株对农药抗性明显增强、遗传了亲本的广谱抗菌性并具有良好的遗传稳定性，生长繁殖能力和酶学性质优于亲本菌株。
关键词 ： 常压室温等离子体诱变（ARTP）；哈茨木霉 ；农药抗性 ；驯化选育
DOI ：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.05.033
Mutagenesis of Trichoderma harzianum with Pesticide Mutiple-
resistance by Atmospheric and Room Temperature Plasma
Zhou Wenchen1 Zhan Xiaobei1，2 Zhu Li2 Zheng Zhiyong1 Wu Jianrong1
（1. Key Laboratory of Carbohydrate Chemistry and Biotechnology of Ministry of Education，School of Biotechnology，Jiangnan University，
Wuxi 214122 ；2. Jiangsu Rayguang Biotechnology Co.，Ltd. Wuxi 214125）
Abstract: This study aimed to improve the adaptability of biocontrol Trichoderma in the complicated agricultural environment in where
herbicides, insecticides, and fungicides co-exist. Trichoderma harzianum was used as initial strain and induced by atmospheric and room
temperature plasma（ARTP）. The Trichoderma harzianum mutants resistant to both fungicides mancozeb and insecticide dinotefuran were
obtained and one with the most double-resistance was named as Th-36. The mutant was subject to further mutation by ARTP and screened on
the medium with mancozeb, dinotefuran and herbicide oxyfluorfen. Two mutants with triple-resistance were obtained and named as Th-3-36
and Th-4-B. The toxicity resistance test showed that EC50s of mancozeb for Th-3-36 and Th-4-B were up to 5089.2 μg a.i.·mL
-1 and 5498.2
μg a.i.·mL-1 ；for dinotefuran up to 758.5 μg a.i.·mL-1 and 785.9 μg a.i.·mL-1 ；for oxyfluorfen up to 198.2 μg a.i.·mL-1 and 200.3 μg
a.i.·mL-1 respectively. The above values were all higher than the average commercially recommended doses of these pesticides. The screened
mutants showed the significant increasing resistance to pesticide, inherited parental broad-spectrum antibacterial property, and presented genetic
stability. Furthermore growth capacity and enzyme characteristics of the mutants were better than those of the parental strains.
Key words: atmospheric and room temperature plasma（ARTP）; Trichoderma harzianum; pesticide resistance; domestication.
2015,31(5) 215周文臣等：农药多抗性哈茨木霉的常压室温等离子体诱变
物病害进行有效防治的技术与方法［3］，而生防制剂
（biological control agents，BCAs），即生物杀菌剂是
利用天然产物、微生物活体及其代谢产物所生产的、
对植物病害起防治作用的制剂。它不仅可以减少传
统农药对环境的危害、在动植物体中的残留，还可
以避免病菌对农药产生抗性而导致的农药失效［4］。
典型的生防菌，如木霉菌（Thchoderma spp.），由于
其生存范围广泛、拮抗病原菌广谱（至少对 18 个属，
29 种病原真菌具有拮抗性）［5，6］，对温度、pH、氧
浓度和紫外照射等不利环境条件耐受性强［7］，防病
机制多样，低毒且对环境友好，已经应用于许多大
田作物和园艺作物的土传真菌病害的防治［8］。目前
全球已经约有 50 多种木霉制剂在售［9］。根据最新
报道，许多生防木霉菌还能起到改善土壤环境［10］，
降解残留农药的作用［11］。
哈茨木霉是目前使用最多的生防木霉菌，可以
用于防治如丝核菌、疫霉菌、腐霉菌等植物病原真
菌［12］。早在 1981 年，哈茨木霉防治李属果栩银叶
病（Chondrostereum purpureum）的木霉生防制剂已经
在西欧商品化生产［13］，近年来，以色列、美国拜耳
公司也推出哈茨木霉生防制剂产品［14］。但是，在实
际农业生产过程中，植物病原菌、杂草、虫害等有
害生物共存于农田生态环境之中，某些杀虫剂、除
草剂以及其他化学杀菌剂的使用和残留会对生防木
霉的生长、产孢量产生不良的影响，也导致木霉生
防作用下降，限制了其田间单独使用的效果和范围。
因此，生防木霉菌与农药的关系［15］，通过诱变育
种、原生质体融合、遗传改造等手段改良野生生防
菌的特性［16-18］、提高其耐药性和与其他杀菌剂的混
用［19-22］，已经引起人们的兴趣与重视。但是，目
前的研究多集中在生防菌对杀菌剂的抗性提高，有
关木霉菌对除草剂和杀虫剂的抗性提高的报道很
少，还未有对除草剂和杀虫剂抗性菌株的选育的报
道。由清华大学开发的常压室温等离子体诱变系统
（ARTP）能够在大气压下产生温度在 25-40℃之间、
具有高活性粒子（包括处于激发态的氦原子、氧原子、
氮原子、OH 自由基等）浓度的等离子体射流，改
变细胞膜或者细胞壁通透性、DNA 和蛋白质等大分
子结构，造成基因损伤从而引起微生物发生突变［23］。
近年来，该项突变技术已经被成功应用于突变细菌、
微藻、酵母等微生物［24-26］。生防木霉菌对农药的敏
感性与细胞骨架的重要组成成分微管有关，微管的
主要成分为微管蛋白，微管蛋白和农药的亲和力下
降，造成真菌耐药［27］。ARTP 对蛋白质等大分子的
结构影响以及前人应用该项技术突变微生物的成功
案例使得 ARTP 在改造生防菌耐药性能方面潜力巨
大，但目前为止还未见到有应用此项技术改良生防
木霉菌性能的报道。本研究以哈茨木霉（Trichoder-
ma harzianum GIM 3.44）为出发菌株，采用常压室
温等离子体诱变（ARTP）和含复合农药培养基相结
合的方法筛选对农药有交叉抗性的生防木霉菌，挑
选出两株对杀虫剂呋虫胺、除草剂乙氧氟草醚和杀
菌剂代森锰锌具有综合抗性的抗药性菌株，并检测
其各项生理指标，旨在为提高生防木霉菌对田间除
草剂、杀虫剂及杀菌剂共存的复杂环境适应性提供
参考。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌 种 哈 茨 木 霉（Trichoderma harzianum
Rifai）GIM 3.442，购于中国广东省微生物菌种保
藏中心。棉花枯萎病菌（Fusarium oxysporum f. Sp）
ACCC 36882、 棉 花 黄 萎 病 菌（Verticillium dahliae
Kleb）ACCC 36211、核盘菌（Sclerotinia sclerotiorum）
ACCC 36908，购于中国农业科学院植物保护研究所。
马铃薯早疫病菌（Alternaria solani），由江南大学生
化工程与生物反应器实验室活化并保藏。
1.1.2 培养基 保藏和孢子制备 ：马铃薯综合培
养 基（PDA）（g/L）：马 铃 薯 汁 200， 葡 萄 糖 20，
KH2PO4 3，MgSO4·7H2O 1.5， 硫 胺 素 0.008， 琼 脂
20，pH6.0，于 121℃灭菌 20 min。
含药 PDA 培养基的制备 ：先把农药用无菌水
配制成母液，再用灭菌水稀释成一定倍数，添加到
40-50℃的综合 PDA 培养基中。
液体培养基（g/L）：葡萄糖 20，酵母浸粉 15，
（NH4）2SO4 2.5，KH2PO4 6.0，MgSO4·7H2O 0.8，
pH6.0，25℃。
1.1.3 试剂 除草剂 ：果儿（乙氧氟草醚 23.5% 乳
油），上海惠光有限公司；锄当家（30% 草甘膦水型），
深圳诺普信农化有限公司；盖能草（高效氟吡甲禾灵，
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.5216
108 g/L 乳油），美国陶氏益农。
杀菌剂 ：75% 百菌清可湿性粉剂，利民化工股
份有限公司 ；80% 代森锰锌可湿性粉剂，印度联合
磷化有限公司 ；99%噁霉灵可湿性粉剂，山东天达
股份有限公司。
杀虫剂 ：20% 呋虫胺可湿性粉剂，日本三井化
学 AGRO 株式会社 ；快绝特（0.3% 苦参碱水型），
南通新华农药有限公司。
N-乙酰 - 氨基葡萄糖和海带多糖购于 Sigma 公
司，其余试剂均为国药生产。
1.1.4 诱变系统 ARTP（常压室温等离子体）诱
变育种仪，江南大学生物工程学院购于清华大学无
锡应用技术研究院生物育种研究中心，产品型号 ：
ARTP- Ⅱ。
1.2 方法
1.2.1 ARTP 诱变哈茨木霉 将保存在斜面的哈茨
木霉菌株经过液体培养基 25℃，110 r/min 震荡培
养活化后涂布到 PDA 培养基上，25℃恒温培养 5-7
d 至孢子成熟。用 30 mL 左右的无菌生理盐水冲洗
孢子，冲洗液经灭菌纱布（4 层）过滤除去菌丝体，
用无菌生理盐水稀释成 OD500 的值在 0.54-0.88（孢
子浓度在 108 cfu/mL）之间的孢子悬浮液。诱变方法
参照邱雯雯等［24］的诱变处理，稍加改动，分别取
20 μL 孢子悬浮液至 7 个载片涂抹均匀，载片置于灭
菌平板内，分别经 ARTP 诱变系统（室温常压，氦
气流量为 10 SLM，功率为 100 W）处理 0、30、60、
100、140、180 和 220 s。处理后的载片经灭菌生理
盐水冲洗稀释至合适倍数后涂布到含有代森锰锌 16
μg a.i.·mL-1，呋虫胺 4.5 μg a.i.·mL-1 的复合诱变培
养基上，25℃恒温培养 5-6 d 后菌落计数，计算致
死率，选取致死率 95% 以上的诱变剂量为处理剂量。
在选定诱变剂量下，将处理后的孢子悬浮液分别稀
释的合适倍数后涂布到含有两种目标农药的梯度复
合含药培养基上，25℃恒温培养箱内黑暗培养 5-6
d 后将形成的菌落边缘用 8 mm 打孔器切取菌饼转接
到复合含药 PDA 上，25℃恒温培养，生长势法挑选
生长较快的菌株，转接到 PDA 斜面上保存待分析。
挑选双抗菌株后，按照双抗菌株的筛选方法筛选对
3 种农药（呋虫胺、代森锰锌、乙氧氟草醚）抗性
均提高显著的目标菌株。
1.2.2 农药对突变株室内毒力的测定 采用含毒介
质培养法［28］，梯度稀释。
用无菌打孔器从培养 3 d 的哈茨木霉突变株和
原始菌株菌落边缘截取直径 8 mm 的菌块，将其移
植到含不同浓度的代森锰锌（300、1 000、2 000、
3 000 和 5 000 μg a.i.·mL-1）、 呋 虫 胺（165、500、
1 000、1 650 和 1 900 μg a.i.·mL-1）、乙氧氟草醚（60、
120、240、480 和 700 μg a.i.·mL-1）的 PDA 平板中央，
每个培养皿接 1 个菌饼，每个浓度 3 次重复，设空白
平板为对照，置于 25℃恒温培养箱培养。
农药对突变株菌丝生长速率的室内毒力测定 ：
供试菌株在上述条件下培养 2 d，用十字交叉法测量
菌落直径。并按式（1）计算其生长抑制率。
I=［（R0-R）／ R0］×100% （1）
式中 ：I 为抑制率，R0 为对照菌落直径，R 为
处理菌落直径。
将各抑制率换算成抑制率概率值，以各处理中
农药浓度对数值作为自变量 x 值，以相应处理对菌
丝的抑制率概率值为依变量 y 值，用线性回归法求
出供试杀菌剂的毒力曲线方程 y=a+bx，计算 EC50（抑
制中浓度）。
农药对突变株产孢子能力的室内毒力测定 ：供
试菌株在上述条件下培养 6 d，用 30 mL 无菌生理
盐水冲洗，玻璃珠打散，光电比浊法测定各农药梯
度下的产孢子能力，按照测定农药对菌株菌丝生长
EC50 的方法测定各农药对菌株产孢子能力的 EC50。
农药对突变株孢子萌发的室内毒力测定［29］：将
供试菌株和亲本菌株将在 PDA 生长 5-6 d 用 30 mL
灭菌生理盐水冲洗打散，经灭菌纱布过滤除去菌丝
体，稀释到合适倍数吸取 200 μL，以 6×106 cfu/mL
的接种量接种到含有 1.3 mL 的含有梯度农药的液体
PDA 的 24 孔培养板中。混匀后用酶标仪测定初始
OD500，25℃恒温培养箱培养培养 12 h 后酶标仪测定
OD500，用空白 PDA 作对照，按照公式（2）计算孢
子萌发抑制率，并按照上述方法计算各农药对供试
菌株的 EC50。
I=［（OD0-OD1）-（ODC-OD2）］/（OD0-OD1）×100% （2）
式中 ：I 为孢子萌发抑制率，OD1 为对照 0 h 的
OD500，OD2 为处理 0 h 的 OD500，OD0 为对照 12 h 的
2015,31(5) 217周文臣等：农药多抗性哈茨木霉的常压室温等离子体诱变
OD500，ODC 为处理 12 h 的 OD500。
1.2.3 突变株生长繁殖能力
1.2.3.1 菌丝平均生长速率 将抗性突变体菌株和
亲本菌株在 25℃下培养 3-4 d，用直径 8 mm 的打
孔器沿菌落边缘截取菌块接种于 PDA 培养基上，在
25℃恒温黑暗条件下培养，每 6 d 测定菌落直径。
选取 12 h 的直径 D1 和 36 h 的直径 D2，按照式（3）
计算菌丝平均生长速率，每处理 3 次重复。
v=（D2-D1）/24 （3）
式中 ：v 为菌丝平均生长速率（mm/h），D1 为
12 h 菌落直径，D2 为 36 h 菌落直径。
1.2.3.2 产孢子能力 采用光电比浊法。
1.2.3.3 标准曲线绘制 将在 PDA 生长 5-6 d 的哈
茨木霉用 30 mL 灭菌生理盐水冲洗打散，经灭菌纱
布过滤除去菌丝体，稀释 10、20、30、40、50 和 60 倍，
血球计数板准确计数孢子个数，用分光光度计测定
各个梯度的 OD500 值。以 OD500 为横坐标，孢子浓度
为纵坐标制作标准曲线。
哈茨木霉和突变株在 PDA 平板上生长 6 d 后，
按上述方法，测定产孢子能力。
1.2.3.4 分生孢子萌发率 将各突变株和原始菌株
培养 5-6 d 后用 30 mL 液体 PDA 冲洗打散，稀释到
107 cfu/mL，各吸取 50 μL，滴加于凹玻片上，25℃
保湿培养，每隔一段时间显微镜下镜检，计算孢子
萌发率。
1.2.3.5 种子生长曲线测定 刮取 PDA 培养基上的
孢子接入到装有无菌水的 150 mL 三角瓶（带无菌玻
璃珠）中，25℃，摇床振荡培养 2 h，使其混合均匀。
吸取 5 mL 孢子悬浮液接种到装有 50 mL 液体培
养基的 250 mL 三角瓶中培养（接种量 10%），25℃，
往复式摇床 110 r/min 培养。每隔 6 h 取 5 mL 发酵液，
8 000 r/min，离心 10 min，倒掉上清液取沉淀，水洗
涤 2-3 次，105℃烘箱烘干至恒重。以摇床培养时间
（h）为横坐标、菌体干重（g/L）为纵坐标绘制种子
生长曲线。
1.2.4 突变株酶学性质 反应体系总体积 600 μL 包
括 ：200 μL 底物，200 μL pH6.0、0.025 mol/L 磷酸钠
缓冲液，200 μL 粗酶液（pH6.0，50℃），恒温水浴
反应 2 h。反应结束后，沸水浴 10 min 终止反应。
几丁质酶酶活力定义 ：在上述反应条件下，每
分钟水解生成 1 μg N-乙酰 - 氨基葡萄糖为一个酶活
力单位 U。
β-1，3 葡聚糖酶酶活力定义：在上述反应条件下，
每分钟水解生成 1 μg 葡萄糖为一个酶活力单位 U。
1.2.5 突变株拮抗性 采用对峙培养法，将亲本木
霉菌株和耐药性木霉菌株分别与核盘菌、马铃薯早
疫病菌、棉花枯萎病菌和棉花黄萎病菌，对峙接种
在 PDA 平板上，两接菌点相距 30 mm，菌块直径 8
mm。同时单独接种作对照。每处理重复 3 次，在
25℃恒温培养。逐日观察各菌落的生长和木霉菌对
灰霉菌的抑制作用情况，连续观察 6 d，记录 R1 和
R2 数据并拍照计算木霉菌平板覆盖率。按照式（4）
计算各木霉菌株对病原菌的抑制率。
I=［1-R2 / R1］×100% （4）
式中 ：I 为木霉的抑制率，R1 为对照病菌落直
径，R2 为病菌菌落中心到木霉菌落边缘的距离。
木霉覆盖植物病原菌的分级标准为 ：I ：木霉
菌丝占据培养皿 100% ；Ⅱ ：木霉菌丝占据培养皿
>2/3 ；Ⅲ ：木霉菌丝占据培养皿 1/3-2/3 ；IV ：木霉
菌丝占据培养皿 <1/3 ；V ：病原菌菌丝占据培养皿
100%。
1.2.6 突变株遗传稳定性 突变型木霉菌株接种在
PDA 平板上，在 25℃恒温培养箱中培养。每 5 d 转
接 1 次，连续转接 10 次。观察这些菌株每次转接后
的生长特性，测定突变株对抗性农药的 EC50，每处
理重复 3 次。将其与亲本相比较。
1.2.7 突变株对其他农药的抗性 配制分别含有
300 μg a.i.·mL-1 的快绝特、百菌清、盖能草和草甘
膦配的含药 PDA，切取培养 2-3 d 的供试菌株 8 mm
菌块转接到含药 PDA 中，25℃恒温培养 2 d，按照（1）
式计算各农药对各突变株的菌丝生长抑制率。
1.2.8 数据统计分析 用 SPSS Statistics 软件和 Dun-
can’s 新复极差法比较 Th 和各突变株以及各突变株
之间在各指标上的显著性差异（P=0.05）。用 Image
Optimizer 软件分析木霉菌拮抗各病原真菌的平板覆
盖率，用 EXCEL 计算毒力回归方程和 EC50
［30］。
2 结果
2.1 哈茨木霉的ARTP诱变及复合农药抗性菌株筛选
通过 ARTP 诱变和药剂反复驯化，选取致死率
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.5218
在 95% 以上的 100 s 为诱变剂量，以 T. harzianum 为
出发株，以农药对菌株的菌丝生长 EC50 为目标，从
200 株疑似株中挑选得到 5 株双抗菌株（Th-17、Th-
36、Th-37、Th-41 和 Th-60，对代森锰锌和呋虫胺
有抗性），结果如图 1 所示。其中，Th-36 号菌株的
代森锰锌和呋虫胺 EC50 分别比出发菌株提高 6.95 倍
和 4.40 倍。以双抗菌株 Th-36 为诱变突发株，选取
致死率为 90% 以上的 90 s 为处理剂量，在梯度综
合含药平板上筛选，从 180 株疑似菌株中挑选得到
两株三抗（Th-3-36 和 Th-4-B，对代森锰锌、呋虫
胺和乙氧氟草醚有综合抗性）菌株，结果如图 2 所
示。代森锰锌对三抗菌株 Th-3-36 和 Th-4-B 的菌丝
生长 EC50 相比 Th-36 略有提高，分别达到 5 089.2 μg
a.i.·mL-1 和 5 498.2 μg a.i.·mL-1，是市售平均推荐
使用浓度的 5 倍左右。相比 Th-36，呋虫胺对两株三
抗突变株的菌丝生长 EC50 的变化不大。经过诱变后，
突变株对乙氧氟草醚抗性明显提高，乙氧氟草醚
对 Th-3-36 和 Th-4-B 菌丝生长 EC50 分别达到 198.2
μg a.i.·mL-1 和 200.3 μg a.i.·mL-1，达到市售使用浓
度（表 1）。
2.3 突变株和出发菌株生长特性比较
将突变株和亲本菌株在 PDA 平板上培养，比较
其菌丝生长和产孢能力，结果如表 3 所示。抗性突
变株的菌丝生长速率相对 Th 略有提高，变化较小。
Th-3-36、Th-4-B 和 Th-36 产孢子能力分别比出发菌
株提高 45%、39% 和 33% 左右。在液体 PDA 培养
Th-17 Th-36 Th-37 Th-41 Th-60 Th
0
1000
2000
3000
4000
5000 ԓ἞䭠䬼੻㲛㜪
EC
50
/μg a.i.·mL-1  ׋䈅㧼Ṛ
Th 表示出发菌株，下同
图 1 双抗性菌株筛选结果
2.2 抗药性菌株遗传稳定性
将传代前和传代后菌株进行室内毒力测定，结
果如表 1、表 2 所示。相比亲本菌株，杀菌剂代森锰
锌、除草剂乙氧氟草醚和杀虫剂呋虫胺对突变株的
菌丝生长 EC50、孢子产量 EC50 和孢子萌发 EC50 都
比出发菌株有显著提高，并且没有随传代次数发生
太大的改变，性状遗传稳定。
Th-3-36 Th-4-B Th-36 Th
0
200
400
600
800
EC
50
/μg a.i.·mL-1  ׋䈅㧼Ṛ ੻㲛㜪
Th-3-36 Th-4-B Th-36 Th
0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
EC
50
/μg a.i.·mL-1  ׋䈅㧼Ṛ ԓ἞䭠䬼
Th-3-36 Th-4-B Th-36 Th
0
40
80
120
160
200
240
EC
50
/μg a.i.·mL-1  ׋䈅㧼Ṛ ҉≗≏㥹䟊
图 2 供试菌株的菌丝生长对抗性药物的敏感性
2015,31(5) 219周文臣等：农药多抗性哈茨木霉的常压室温等离子体诱变
基上培养 6 h 后，三抗性突变株的萌发率高于出发
菌株，均在 20% 左右，Th 为 15%，但在培养 12 h
和 24 h 后突变株和出发株无显著性差异。
对比突变株和亲本菌株的种子液生长曲线（图
3），突变株进入稳定期相对亲本菌株明显缩短（突
变株为 24 h，Th 为 48 h），保持稳定期的时间明显
延长（突变株为 36 h 以上，Th 为 24 h）。此外，突
变株最大生物量也高于出发菌株，三抗菌株可以达
表 3 突变株和亲本菌株 Th 生长特性比较
编号 6 d 产孢子能力 /1011 培养 6 h 孢子萌发率 /%* 菌丝平均生长速率 /（mm·h-1）*
Th-3-36 1.8±0.2d1 22.7±0.9c2 1.6±0.3c3
Th-4-B 1.7±0.2c1 21.2±3.3b2c2 1.8±0.2b3c3
Th-36 1. 7±0.1b1 18.4±2.0a2b2 1.8±0.1a3b3
Th 1.2±0.1a1 15.4±0.9a2 1.5±0.1a3
注 ：同组数据不同字母表示差异显著性（P < 0.05），下同 ；* 代表数值表示方式为 ：x-±s，下同 ；6 d 产孢子能力为每个培养皿上的孢子总数
表 1 突变株的菌丝抑制 EC50 遗传稳定性
农药 编号
菌丝生长 EC50/（μg a.i.·mL
-1）
相对 Th-36 提高倍数 相对出发菌株提高倍数 市售推荐使用浓度的倍数
1 代 10 代
代森锰锌 Th-3-36 5 026.5 5 089.2 0.1 8.6 5.1
Th-4-B 5 449.6 5 498.2 0.2 9.3 5.5
Th-36 4651.3 4 597.1 0.0 7.6 4.6
呋虫胺 Th-3-36 769.8 758.5 0.1 4.6 4.6
Th-4-B 791.0 785. 9 0.2 5.4 4.8
Th-36 681.8 644. 8 0.0 4.2 3.9
乙氧氟草醚 Th-3-36 198.2 200.3 1.6 1.9 1.0
Th-4-B 203.9 207.2 1.7 2.0 1.1
Th-36 78.0 76.2 0.0 0.1 0.4
注 ：相对 Th36 提高倍数 =10 代的 EC50/ 相应农药对 Th-36 菌株菌丝生长的 EC50-1 ；相对 Th 提高倍数 =10 代的 EC50/ 相应农药对 Th 菌株菌丝生长的 EC50-1 ；
市售推荐使用浓度的倍数 =10 代的 EC50/ 相应杀农药的市推荐平均使用量 ；市推荐平均施用量（μg a.i.·mL
-1）：代森锰锌 1000 ；呋虫胺 165 ；乙氧氟草醚 190
表 2 突变株和出发菌株产孢子量和孢子萌发 EC50
农药 编号
产孢子能力 EC50/（μg a.i.·mL
-1） 孢子萌发 EC50/（μg a.i.·mL
-1）
1 代 10 代 1 代 10 代
呋虫胺 Th-3-36 492.7 489.6 187.4 191.4
Th-4-B 695.3 690.2 239.7 236.0
Th-36 342.3 323.8 172.5 167.1
Th 87.6 88.9 72.2 73.3
代森锰锌 Th-3-36 1 725.6 1727.0 765.7 761.7
Th-4-B 1 038.5 1 032.6 869.7 878.9
Th-36 700.1 704.2 442.1 433.6
Th 389.2 386.6 59.7 61.0
乙氧氟草醚 Th-3-36 149.9 154.9 137.1 138.0
Th-4-B 176.3 172.3 178.5 176.6
Th-36 69.7 75.5 48.6 47.6
Th 45.2 42.0 44.8 45.0
注 ：EC50 相对出发菌株倍数 =10 代的 EC50/ 相应农药对 Th 菌株的 EC50
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到 16 g/L，双抗菌株可以达到 15 g/L 以上，而亲本
菌株只有不到 12 g/L。突变株更为旺盛的生命力可
能与其更强的抗药性之间存在某种关系。
2.4 突变株和Th的酶学性质比较
几丁质酶和 β-1，3 葡聚糖酶能够降解病原真菌
的细胞壁的主要成分几丁质和 β-1，3 葡聚糖，在生
防菌拮抗病原真菌中作用重大。对突变株和出发菌
株进行上述两种酶产酶能力测定，结果如表 4 所示。
突变株和 Th 均在培养 60 h 后开始产酶，但抗性突
变株的 β-1，3 葡聚糖酶最大酶活力比亲本菌株有所
提 高，Th-3-36 是 亲 本 菌 株 的 1.87 倍 左 右，Th-4-B
和 Th-36 菌株是 Th 的 1.71 倍左右。抗性突变株产
几丁质酶的能力和发酵液总蛋白含量相对出发株稍
有提高，但相差较小。
2.5 非抗性农药对突变株和Th的菌丝生长抑制率
比较
通常农业生产中会使用各种不同的农药，因此
选择了其他 5 种农作物种植中常用农药，测试突变
株对其耐受性。在剂量为 300 μg a.i.·mL-1 条件下
测定菌丝生长抑制率，结果如表 5 所示。其中，突
变株对噁霉灵的敏感性降低最大 ：三抗菌株 Th-3-36
和 Th-4-B 分别比亲本菌株降低 74.76% 和 96.35% 左
右，双抗菌株比亲本菌株降低 88.93% 左右，而且噁
霉灵对 Th-4-B 的菌丝生长抑制率仅为 1.03%。突变
株对草甘膦、盖能草的敏感性比亲本菌株降低程度
没有噁霉灵显著，平均只比亲本菌株降低 19%（Th-
36 除 外 ） 和 30% 左 右。 两 株 三 抗 突 变 株 对 草 甘
0 20 40 60 80 100 120 140 160
0
4
8
12
16⭏⢙䟿g·L-1  ᰦ䰤h
Th
Th-36
Th-3-36
Th-4-B
图 3 突变株和 Th 生长曲线比较
表 4 突变株和亲本菌株（Th）发酵产几丁质酶和 β-1，3 葡聚糖酶总结
编号 最大产蛋白量 * 最大 β-1，3 葡聚糖酶酶活 * 最大几丁质酶活 *
Th-3-36 613.9±7.2a1 34.7±1.3a2 14.3±0.6a3
Th-4-B 610.7±4.2a1 31.9±0.9a2b2 13.0±0.5a3b3
Th-36 576.5±4.2b1 31.8±0.7b2 12.6±0.3b3
Th 447.8±4.2c1 18.5±0.5c2 10.9±0.3c3
表 5 非抗性农药对突变株和亲本菌株（Th）的菌丝生长抑制率（%）
编号
杀菌剂 除草剂 杀虫剂
百菌清 噁霉灵 盖能草 草甘膦 快绝特
Th-3-36 90.6 7.2 66.4 69.3 95.7
Th-4-B 85.4 1.0 68.4 69.4 97.9
Th-36 87.0 3.1 69.7 84.3 97.9
Th 96.0 28.4 96.8 86.2 100.0
注 ：300 μg a.i.·mL-1 下菌丝生长抑制率
膦、百菌清和快绝特的敏感性和亲本菌株差异较
小，且这 3 种农药对木霉菌株抑制作用较大，300
μg a.i.·mL-1 的浓度对木霉的抑制率就可以达到 80%
以上。
2.6 突变株的拮抗作用
为了进一步验证所获得的多抗性木霉菌株的生
防抗菌能力，将病菌和木霉菌株进行对峙培养。对
峙培养过程中，木霉菌株和植物病菌先分居平板两
2015,31(5) 221周文臣等：农药多抗性哈茨木霉的常压室温等离子体诱变
侧各自生长，2 d 左右，棉花黄萎病菌基本停止生长，
并在与木霉菌的接触处出现抑菌带，之后菌落逐渐
萎缩消亡。棉花枯萎病菌、核盘菌和土豆早疫病菌
在对峙培养 3 d 左右后，菌落停止生长，之后逐渐
萎缩。木霉菌迅速占领生长空间，对病原真菌起到
竞争性抑制作用。对峙培养 6 d 后，平板上生长空间
大部分被绿色木霉菌覆盖，以 Th-4-B 突变株和棉花
枯萎病菌的对峙效果为例，如图 4-A 所示。4 种病
菌的菌丝生长抑制率结果（图 4-B）显示，原始菌
化学农药具有显著的优势，并已经被许多学者在中
药［31］、小麦［32］等田间防治病害试验中证明。但在
国内传统作物栽培中，杀虫剂、杀菌剂和除草剂等
化学农药的常年大量使用使得木霉菌在实际使用和
商业化中受到限制。不同种类的杀菌剂对不同的生
防木霉具有不同的抑制作用，从 19 世纪末 20 年代
初起，常用农药对木霉的抑制作用已经引起学者的
兴趣［33］；杀虫剂和土壤处理除草剂对生防木霉也有
不同程度的影响，但近几年才有少数相关报道［34］，
并且并未见到采用诱变措施提高木霉对除草剂、杀
虫剂的耐药性，降低其敏感性的报道。
与前人诱变筛选提高木霉耐药性相比，本研究
首次尝试采用常压室温等离子体诱变的方法提高木
霉耐除草剂、杀虫剂和杀菌剂的综合能力。以含有
杀虫剂（呋虫胺）、杀菌剂（代森锰锌）和除草剂
（乙氧氟草醚）的复合含药培养基为筛子，成功筛选
出对上述 3 种农药有高度耐受性的突变型木霉菌株
Th-3-36 和 Th-4-B。杀菌剂和木霉生防菌联用可以降
低杀菌剂的使用浓度，并提高木霉菌的防效。牛胜
芳等［19］发现啶酰菌胺和哈茨木霉联用可以防治番
茄灰霉病菌且协同效果良好 ；Nallathambi 等［35］将
木霉菌 T.v-CIAH240 和多种杀菌剂联用以防治果腐
病，可降低化学农药的使用浓度，其中代森锰锌的
使用浓度降低到 100 μg/g。本实验中代森锰锌对突
变 株 Th-3-36 和 Th-4-B 的 菌 丝 生 长 EC50 分 别 达 到
5 089.2 μg a.i.·mL-1 和 5 498.2 μg a.i.·mL-1， 是 市
售平均推荐使用浓度的 5 倍左右，是尹婷等［16］诱
变得到的耐药性木霉 T2 对代森锰锌的耐受性的 20
倍以上（EC50 值为 221 μg a.i.·mL
-1），为突变木霉
菌和代森锰锌联用奠定了基础 ；呋虫胺对两株突变
株的菌丝生长 EC50 分别达到 758.5 μg a.i.·mL
-1 和
785.9 μg a.i.·mL-1，是市售推荐使用浓度的 4 倍以上；
乙氧氟草醚对两株突变株的菌丝生长 EC50 分别达到
198.2 μg a.i.·mL-1 和 200.3 μg a.i.·mL-1，达到市售
推荐使用浓度。筛选结果表明，通过 ARTP 和药剂
驯化培养的手段可以显著提高木霉菌对农药的抗性，
在使用诱变木霉菌作为生防农药的农田，可以相应
使用呋虫胺和乙氧氟草醚除虫除草。
对其他农药的耐药性测定表明，300 μg a.i.·mL-1
的使用浓度下，噁霉灵对突变株的抑制率很小，木
Th Th-36׋䈅㧼Ṛ Th-3-36 Th-4-TB60708090100110
120
B
A
㧼э⭏䮯ᣁࡦ⦷ /% ỹ㣡ᷟ㨾⯵㧼 ỹ㣡哴㨾⯵㧼傜䫳㯟ᰙ⯛⯵㧼 Ṩⴈ㧼
A ：棉花枯萎（左），对峙培养（右）；B ：木霉对 4 株病菌对峙培养 6 d 的
菌丝抑制率
图 4 木霉菌对植物病菌的拮抗能力
株和突变株对土豆早疫病菌和棉花黄萎病菌的抑制
率达到 90% 以上，抗病等级为 I 级 ；对棉花枯萎病
菌和核盘菌的抑制率达到 70% 以上，抗病等级为Ⅱ。
突变菌稳定遗传原始菌株对植物病菌的拮抗性并对
植物病原菌表现出良好的拮抗能力。
3 讨论
木霉菌作为生防因子作用于植物病虫害，相比
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.5222
霉菌可以和噁霉灵混用防治植物病原真菌 ；在除草
剂盖能草和草甘膦存在的环境中，木霉菌可以生长
但生长速度受到明显的影响，生物拮抗能力可能被
削弱 ；杀菌剂百菌清和杀虫剂快绝特对木霉菌株强
烈抑制。对峙培养实验表明突变株稳定遗传亲本对
植物病原菌的生物拮抗性，能使病菌菌丝停止生长，
菌落消亡，培养 6 d 后木霉菌落覆盖的抗病等级均
在Ⅰ、Ⅱ级。突变株较出发菌株对棉花黄萎病菌和
马铃薯早疫病菌的差别不大，对峙培养 6 d 后木霉
长满病菌菌落，但对核盘菌和棉花枯萎病菌的抑制
率提高，同时突变株的生长繁殖能力和产 β-1，3 葡
聚糖酶和几丁质酶的能力均高于出发菌株。生长速
率快可以更快地占领生长空间、木霉产生的细胞壁
降解酶可以降解病菌的细胞壁从而导致病原真菌不
能正常生长，试验结果很好地说明了突变株拮抗能
力提高的原因与其更高的生长速率和更强的产胞壁
降解酶能力有关。突变株更优的抗药性和菌种特性
使其比 T. harzianum 更能适应田间复杂的环境，具
有良好的应用前景。但本试验的研究只处于初试阶
段，并未对突变株活体植物拮抗能力以及菌药协同
对植物抗病能力作用的影响进行探究。
4 结论
本研究采用常压室温等离子体诱变的方法，以
含有杀虫剂（呋虫胺）、杀菌剂（代森锰锌）和除草
剂（乙氧氟草醚）的复合含药培养基为筛子，成功
筛选出上述 3 种农药有高度耐受性的突变型木霉菌
株 Th-3-36 和 Th-4-B，其对代森锰锌、呋虫胺和乙
氧氟草醚的 EC50 分别达到 5 000 μg a.i.·mL
-1 以上、
750 μg a.i.·mL-1 以上和 190 μg a.i.·mL-1 以上。抗
药性菌株的生长繁殖能力与 β-1，3 葡聚糖酶、几丁
质酶生产能力均优于出发菌株 ；对峙培养试验表明
突变株稳定遗传亲本对植物病原菌的生物拮抗性，
能使病菌菌丝停止生长，菌落消亡，菌落覆盖抗病
等级均在 I、Ⅱ级。
参 考 文 献
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（责任编辑 马鑫）