全 文 ：·研究报告·
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2015, 31(5):134-139
收稿日期 ： 2014-11-24
基金项目 ：国家自然科学基金项目（30860049，31460235）
作者简介 ：呼吉雅，女，硕士研究生，研究方向 ：植物及真菌分子生物学 ；E-mail ：hujiya@yeah.net
通讯作者 ：卢萍，女，博士，教授，研究方向 ：植物及真菌分子生物学 ；E-mail ：luping@imnu.edu.cn
小花棘豆（Oxytropis glabra）属于豆科棘豆属的
多年生有毒草本植物，主要分布于我国内蒙古、甘肃、
新疆、陕西、青海、宁夏等地区的荒漠化草原及山
地。小花棘豆生命力旺盛、适应性很强，已成为我
国西部荒漠化草原优势种群。但是牲畜采食后会引
起慢性中毒，给草原畜牧业造成严重损失［1，2］。其
有毒成分为苦马豆素，同属的其他植物，如甘肃棘豆、
黄花棘豆中的主要有毒成分也是苦马豆素［3，4］，它
小花棘豆 Embellisia 内生真菌原生质体的制备与
再生研究
呼吉雅 卢萍 牛艳芳
（内蒙古师范大学生命科学与技术学院，呼和浩特 010022）
摘 要 ： 旨在获得数目多且活力高的小花棘豆 Embellisia 内生真菌的原生质体，分析和探讨该内生真菌原生质体制备与再生
的最佳条件，为后续外源基因转化奠定基础。利用酶解法对制备小花棘豆 Embellisia 内生真菌菌丝的原生质体，研究酶解液成分、
pH、温度、渗透压稳定剂、酶解时间及菌龄对原生质体制备和再生的影响 ；原生质体在 TB3 培养基上再生后，研究酶解时间对原
生质体再生的影响。结果显示，2.5%（W/V）lysing enzymes、2%（W/V）纤维素酶和 3%（W/V）蜗牛酶 3 种混合酶处理，菌龄为
10 d，当酶解温度为 30℃、pH5.8、1.2 mol/L MgSO4 为渗透压稳定剂，在 80 r/min 水平摇床酶解 8 h 时，原生质体浓度较高，达 4.42×10
5
个 /mL ；酶解时间 6 h 时再生率最高，达 46.7%。
关键词 ： 小花棘豆 ；内生真菌 ；原生质体 ；原生质体制备与再生
DOI ：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.05.021
Preparation and Regeneration of Protoplasts Isolated from Embellisia
Fungal Endophyte of Oxytropis glabra
Hu Jiya Lu Ping Niu Yanfang
（College of Life Science and Technology，Inner Mongolia Normal University，Hohhot 010022）
Abstract: The aim of this research is to obtain more active and larger amount of protoplasts of Embellisia fungal endophyte from Oxytropis
glabra, investigate the optimal conditions of protoplast preparation and regeneration, and lay foundation for setting up later exogenous gene
transformation system. The protoplasts are made by enzymes, and the influences on protoplast yield regarding different combined enzymes and
their concentration, pH, temperatures, osmotic solutions, enzymolysis time and hyphal culture time were discussed. The protoplasts regenerated
on TB3 medium were analyzed for understanding the impacts of different enzymolysis time on the regeneration. The protoplast concentration
reached to 4.42×105 /mL when medium mass was hydrolyzed by enzymes consisting of 2.5%（W/V）lysing enzymes, 2%（W/V）cellulose and
3%（W/V）helicase, the culture time was 10 days, the enzymolysis temperature was set to 30℃ , the pH was 5.8, the 1.2 mol/L MgSO4 solution
was selected as osmotic stabilizer and the cultures were incubated in a flat shaker（80 r/min）for 8 h. The protoplast regeneration rate reached
to 46.7% when enzymolysis time was 6 h.
Key words: Oxytropis glabra ；fungal endophytes ；protoplast ；preparation and regeneration
2015,31(5) 135呼吉雅等：小花棘豆 Embellisia内生真菌原生质体的制备与再生研究
可抑制动物细胞内 α-甘露糖苷酶活性，使糖代谢受
阻，致使神经细胞功能紊乱，出现中毒症状，毒素
积累到一定程度可引起死亡。苦马豆素具有抗肿瘤
活性，可抑制肿瘤细胞 N-连接寡糖的合成，从而抑
制其生长及扩散［5，6］。卢萍等［7-9］研究发现，小花
棘豆毒性与其感染 Embellisia 内生真菌密切相关，该
内生真菌在分类上属于子囊菌门、腔菌纲、格孢腔
菌目、格孢腔菌科、埃里砖格孢属的丝状真菌，体
外培养该内生真菌会产生苦马豆素。小花棘豆中的
营养成分及含量与其他豆科植物和禾本科牧草相当，
是一种具有潜在利用价值的牧草［10，11］。因此，深入
研究该内生真菌，对于小花棘豆的治理利用、苦马
豆素微生物工业化生产等方面都有重要意义。
原生质体是外源 DNA 转化、质粒转移、病毒转
染的良好受体，再生后可表达外源基因。真菌原生
质体转化技术已得到广泛应用［12-14］。丝状真菌有多
组分复杂细胞壁结构，与细菌、酵母、放线菌的细
胞壁结构相比更加复杂，相近丝状真菌物种间的细
胞壁多糖组分和比例也不同［15-17］，丝状真菌原生质
体制备难度较高。原生质体的高效制备是完成外源
基因转化的前提，探索其制备与再生条件非常必要。
分离原生质体的方法有酶解法和机械法等，其中酶
解法简便高效，因而被广泛使用。本研究拟探索小
花棘豆 Embellisia 内生真菌的原生质体制备与再生的
最适条件，旨在为外源基因转化和分析基因在真菌
苦马豆素代谢中的作用奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实 验 菌 株 小 花 棘 豆 Embellisia 内 生 真 菌
OW7.8 菌株，菌种于本实验室保存。
1.1.2 试 剂 及 培 养 基 1.2 mol/L 渗 透 压 稳 定 剂 ：
KCl，MgSO4，山梨醇，蔗糖（pH 由磷酸缓冲液调
制）。PDA 培养基（g/L）：马铃薯 200、蔗糖 20、琼
脂粉 20 ；PDB 培养基（g/L）：马铃薯 200、葡萄糖
20、蛋白胨 10 ；原生质体保存液（STC buffer）［18］：
1 mol/L 山梨醇、100 mmol/L Tris-HCl（pH8.0）、100
mmol/L CaCl2 ；TB3 原生质体再生培养基 ：20% 蔗糖、
0.3% 酵母提取物、0.3% 酸水解酪蛋白 ；双层再生培
养基：TOP 培养基：TB3 再生培养基中加入 0.6% 琼脂；
Bottom 培养基 ：TB3 再生培养基中加入 1.5% 琼脂。
1.1.3 酶 的 种 类 蜗 牛 酶（Snailase）， 纤 维 素 酶
（Cellulase）购自内蒙古鸿之惠商贸有限公司 ；溶
壁酶（Lysing enzymes）购自 Sigma 公司。纤维素酶
4 000 r/min 离心 2 min，取上清。酶溶液用 1.2 mol/L
渗透压稳定剂配制，用 0.22 μm 微孔滤膜过滤除菌，
现用现配。
1.2 方法
1.2.1 真 菌 原 生 质 体 制 备 在 PDA 平 板 上 接 种
OW7.8 菌株，培养 15 d，用灭菌牙签刮下菌丝体，
置于 50 mL PDB 液体培养基中，于 25℃、200 r/min
震荡培养 14 d 后，用宽口枪头取出适量菌丝团置于
10 mL 离心管中，4 000 r/min 离心 5 min，弃上清，
用超纯水洗去残留培养基，用渗透压稳定剂冲洗一
次。称量得到白色菌丝团鲜重，按每克菌丝加 20
mL 酶液添加进行酶解反应，每隔 30 min 检测原生
质体释放情况。酶解结束后，用血球计数板计数原
生质体，6 次重复，计算原生质体释放率。用 4 层
擦镜纸过滤菌丝体酶解液，去掉残余菌丝体，用渗
透压稳定剂冲洗一次，于 4℃、6 000 r/min 离心 10
min，弃上清，加入 0.5 mL STC buffer，再次离心后
弃上清，加适量 STC buffer 混匀，收集纯化的原生
质体，用血球计数板进行计数，6 次重复，得到原
生质体浓度值。
1.2.1.1 酶组合及其浓度 用溶壁酶（含几丁质酶、
葡聚糖酶、纤维素酶和蛋白酶）、蜗牛酶（含葡聚糖
酶、昆布多糖酶、纤维素酶和多聚半乳糖酶等 20 多
种酶）和纤维素酶（含外切 β-葡聚糖酶、内切 β-葡
聚糖酶和 β-葡萄糖苷酶），设计单酶、不同酶组合
及酶浓度梯度实验（表 1）。其他条件为菌龄 12 d，
pH6.0，30℃，以 MgSO4 为渗透压稳定剂，酶解 6 h，
计算原生质体释放率，确定最佳酶浓度及酶组合。
1.2.1.2 酶解反应 pH 值 酶组合及浓度确定后，用
磷酸缓冲液分别配制 pH 分别为 5.5、5.8、6.1、6.4、6.7
和 7.0 的 MgSO4 溶液，其他条件不变，进行酶解反应，
分别计算原生质体释放率。
1.2.1.3 酶解温度 采用上述实验确定的酶组合
和 MgSO4 浓度的条件，设置酶解温度分别为 20℃、
25℃、30℃和 35℃，其他条件不变，进行酶解反应，
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.5136
分别计算原生质体释放率。
1.2.1.4 渗透压稳定剂 采用上述实验确定的酶组
合、MgSO4 浓度和温度条件，分别以 MgSO4、KCl、
山梨醇和蔗糖为渗透压稳定剂，进行酶解反应，分
别计算原生质体释放率。
1.2.1.5 酶解时间 将酶解反应时间设置在 2、4、
6、8 和 10 h，分别计算原生质体释放率。收集原生
质体，在 TB3 培养基上再生，于 25℃恒温培养 5 d，
分别计算酶解反应时间在 2、4、6、8 和 10 h 时的
原生质体再生率。
1.2.1.6 菌龄 将菌丝接种到 PDB 培养基上，在恒
温振荡器上以 80 r/min 分别震荡培养 8、10、12、14
和 16 d 后，制备原生质体，计算原生质体释放率。
1.2.2 真菌原生质体的释放形式 在酶解过程中，
每隔 30 min 取样制片，在显微镜下观察原生质体的
释放。
1.2.3 原生质体再生 将收集纯化的原生质体接种
到双层平板中。先在培养皿底部铺一层 Bottom 培养
基，待其凝固，将收集纯化并用 STC buffer 适当稀
释的原生质体与冷却至 40℃左右的 TOP 培养基轻轻
混匀，倒入上述平板中，于 25℃恒温培养 5 d，计
数再生菌落数。收集原生质体时会有酶解不完全的
菌丝，为消除其对计算原生质体再生率带来的误差，
将相同量原生质体收集液用去离子水稀释，室温放
置 20 min，使原生质体充分胀破，也以上述再生方
式培养，进行计菌落数。
原生质体再生率（%）=（STC buffer 稀释生长
的菌落数 - 去离子水稀释生长的菌落数）/ 原生质体
总数 ×100%
2 结果
2.1 影响小花棘豆Embellisia内生真菌原生质体制
备的因素
2.1.1 酶组分及浓度 制备小花棘豆 Embellisia 内生
真菌的原生质体时，3 种酶的混合酶解效果明显优
于单酶及双酶混合的效果，原生质体产量起初随着
溶壁酶浓度的增加而明显提高，但增至 3% 时，原
生质体产量增加不再显著（表 2）。综合考虑酶浓度
与产量比，后续实验选择 2.5% 溶壁酶、3% 蜗牛酶
和 2% 纤维素酶三种酶的混合进行酶解反应。
表 1 不同酶组合及浓度实验设计
实验号 不同酶组合及浓度
1 1.5% 溶壁酶
2 3% 蜗牛酶 +2% 纤维素酶
3 1.5% 溶壁酶 +3% 蜗牛酶 +2% 纤维素酶
4 2% 溶壁酶 +3% 蜗牛酶
5 2% 溶壁酶 +2% 纤维素酶
6 2% 溶壁酶 +3% 蜗牛酶 +2% 纤维素酶
7 2.5% 溶壁酶 +3% 蜗牛酶 +2% 纤维素酶
8 3% 溶壁酶 +3% 蜗牛酶 + 2% 纤维素酶
表 2 酶的不同组合及浓度对原生质体产量的影响
实验号 溶壁酶 /（W·V-1） 蜗牛酶 /（W·V-1） 纤维素酶 /（W·V-1） 原生质体产量 /（×105 个·mL-1）
1 0 3% 2% 无
2 1.5% 0 0 0.83
3 1.5% 3% 2% 2.08
4 2% 0 2% 2.17
5 2% 3% 0 2.67
6 2% 3% 2% 2.92
7 2.5% 3% 2% 3.25
8 3% 3% 2% 3.33
2.1.2 pH 值 原 生 质 体 产 量 随 pH 增 高 而 增 多，
pH5.8 时原生质体产量最高，达 3.33×105 个 /mL，
之后随 pH 值升高，原生质体产量下降（图 1）。
2.1.3 酶解反应温度 原生质体产量随着酶解反应
温度的提高而增加，当反应温度为 30℃时，原生质
体产量最高，为 3.75×105 个 /mL，之后随反应温度
的提高，原生质体产量下降（图 2）。
2.1.4 不同渗透压稳定剂 用 4 种缓冲液均可形成
一定数量的原生质体，其中山梨醇和蔗糖缓冲液中
的原生质体数量较少，而 MgSO4 渗透压稳定剂缓冲
2015,31(5) 137呼吉雅等：小花棘豆 Embellisia内生真菌原生质体的制备与再生研究
液中的原生质体数量明显增多，达 3.83×105 个 /mL
（表 3）。
表 3 不同渗透压稳定剂对原生质体产量的影响
渗透压稳定剂种类 原生质体产量 /（×105 个·mL-1）
KCl 1.42
MgSO4 3.83
山梨醇 0.25
蔗糖 0.17
2.1.5 酶解时间 酶解 2 h 到 3 h，菌丝断裂并膨胀，
只有少数原生质体产生，之后原生质体产量随酶解
时间延长而增加，直到酶解 10 h 时，原生质体产量
达 4.5×105 个 /mL（图 3）。但因酶解 8 h 时有些许
原生质体已开始破裂，故酶解 10 h 后不继续检测。
2.1.6 菌龄 菌丝团随培养时间的延长逐渐变得致
密，14 d 有黑色素生成。起初原生质体产量随着
菌龄延长而增加，10 d 时原生质体产量最多，达
4.42×105 个 /mL。然而继续延长菌龄，原生质体产
量急剧下降（图 4）。
0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
5.2 5.5 5.8 6.1 6.4 6.7 7 7.3
pH
⭏䍘փӗ䟿 ×105 њ·mL-1
图 1 酶解 pH 对原生质体产量的影响
0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
4.0
15 20 25 30 35 40䞦䀓ᓖ / ć⭏䍘փӗ䟿 ×105 њ·mL
-1
图 2 酶解温度对原生质体产量的影响
0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
4.0
4.5
5.0
0 2 4 6 8 10 12䞦䀓ᰦ䰤 / h⭏䍘փӗ䟿 ×105 њ·mL-1
图 3 酶解时间对原生质体产量的影响
0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
4.0
4.5
5.0
6 8 10 12 14 16 18㧼喴 / d⭏䍘փӗ䟿 ×105 њ
·m
L-
1
图 4 菌龄对原生质体产量的影响
2.2 原生质体释放方式
小花棘豆 Embellisia 内生真菌释放原生质体的
方式有顶端释放、侧位释放和原位释放 3 种（图 5）。
顶端释放和侧位释放多发生在酶解反应初期，在菌
丝体细胞壁较薄处出现孔洞，原生质体从此溢出。
原位释放发生在酶解后期，菌丝段整个在原位形成
球状体，单个或数个呈串珠状排列。
2.3 原生质体的再生
小花棘豆 Embellisia 内生真菌的原生质体在 TB3
再生培养基上生长良好。原生质体再生率与酶解反
应时间的关系，见图 6。酶解 2 h 时原生质体产量甚
少，随酶解反应时间延长，再生率明显提高，酶解
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.5138
6 h 时再生率最高，达 46.7.3%，继续延长酶解反应
时间，再生率下降。
低［15，21］。然而本研究的酶解反应达 10 h，原生质
体数量依然增加，但酶解反应 8 h 后，一些原生质
体已开始破裂，再生率下降 ；培养的内生真菌的菌
龄超过一定时间后，其原生质体产量也明显下降，
可能因为幼龄菌丝细胞壁成分及结构较简单，随菌
龄增加，则细胞壁结构变得复杂化，且细胞开始分
泌色素及其他次生代谢物质，影响了酶解反应效
果，也可能降低了酶活性，从而使原生质体数量
减少［24，25］。
原生质体再生率随原生质体浓度增加而提高，
有些原生质体无再生能力，其原因一方面可能是在
形成过程中内部物质分配不均匀，导致出现缺乏细
胞核或其他细胞质物质，使原生质体无法再生 ；另
一方面可能是原生质体酶解过于彻底，丧失了再生
基础或原生质体在酶解过程中受到损伤［26，27］。
内生真菌如果培养在 PDA 液体菌丝培养基中，
则获得的菌丝紧密抱团，不利于酶解反应进行和释
放原生质体，且菌丝生长也比较缓慢。而在 PDB 培
养基中真菌生长旺盛且菌丝团松散，菌丝体量足，
即便不对菌丝体进行预处理也能获得数目较多的原
生质体。本研究结果为后续外源基因的转化于表达
奠定了良好的基础。在本次对该菌原生质体制备与
再生条件优化基础上可进一步进行外源基因转化
研究。
4 结论
不同酶解液成分、pH、温度、渗透压稳定剂、
酶解时间及菌龄对小花棘豆 Embellisia 内生真菌原生
质体产量有显著影响，各影响因子的最优条件组合
可获得数目较多的原生质体。酶解时间显著影响原
生质体再生率，酶解 8 h 时，获得的原生质体数量
及其再生率均较高，故确定最佳酶解时间为 8 h。
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A B
C D
A ：Protoplasts release at top position ；B ：Protoplasts release at side position ；
C ：Protoplasts release at original position ；D ：Protoplasts collected and purified
图 5 原生质体释放方式及收集纯化的原生质体
3 讨论
研究发现制备丝状真菌的原生质体时，混合酶
的使用效果明显好于单一酶［19-21］，本研究结果也支
持该结论，小花棘豆 Embellisia 原生质体产量在一定
范围内与酶浓度成正比，超过该浓度后，产量增加
不明显，过高酶浓度则影响后续转化及再生［22，23］。
一些研究认为，制备原生质体的酶解反应时
间 超 过 3 h， 原 生 质 体 产 量 开 始 下 降， 再 生 率 降
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
2 4 6 8 10 12䞦䀓ᰦ䰤 / h⭏䍘փ⭏⦷ / %
图 6 酶解时间对原生质体再生率的影响
2015,31(5) 139呼吉雅等：小花棘豆 Embellisia内生真菌原生质体的制备与再生研究
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（责任编辑 李楠）