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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2015, 31(5):173-178
超氧化物歧化酶（SOD）是一种普遍存在于植
物界中的含金属原子的抗氧化酶，常被作为研究植
物抗逆性的指标［1］。据 SOD 所结合金属原子的不同，
植物 SOD 可分为 3 种类型 ：MnSOD、Cu/ZnSOD 和
FeSOD，在低等植物中以 FeSOD 和 MnSOD 为主［2］。
SOD 作为生物体内第一个参与活性氧清除反应的
重要保护酶［3］，可将超氧阴离子（O2·
-）转化为
H2O2，H2O2 再在过氧化物酶（POD）和过氧化氢酶
（CAT）等作用进一步还原为 H2O 和 O2，从而清除
植物体内过多的自由基，以减少自由基对植物的毒
收稿日期 ：2014-09-05
基金项目 ：浙江省自然科学基金项目（LY13D060007），浙江省科技创新团队（2010R50025-25）
作者简介 ：沈佳，女，硕士研究生，研究方向 ：藻类生化与分子生物学 ；E-mail ：sj677501@163.com
通讯作者 ：孙雪，女，博士，副研究员，研究方向 ：藻类生化与分子生物学 ；E-mail ：sunxue@nbu.edu.cn
蛋白核小球藻 Fesod 基因的克隆及表达分析
沈佳  江灵芝  孙雪
（宁波大学海洋学院 浙江省海洋生物工程重点实验室，宁波 315211）
摘 要 ： 利用 RACE 技术克隆了蛋白核小球藻 Fesod 全基因序列，得到 1 215 bp 序列，其 5 非翻译区长 52 bp，3 非翻译
区长 452 bp，共编码 236 个氨基酸。生物信息学分析结果表明，该 Fesod 基因编码蛋白的分子量为 26.42 kD，等电点为 6.98 ；位
于线粒体中的概率是 73.9% ；该蛋白没有信号肽序列 ；蛋白质二级结构预测结果表明 FeSOD 中 α-螺旋和无规卷曲分别占 53.39%
和 39.41%。再利用实时荧光定量 PCR 技术检测了不同盐度和水杨酸浓度对蛋白核小球藻 Fesod 基因表达的影响，结果表明 Fesod
表达量随着盐度升高而增加，45‰盐度表达量为 15‰盐度的 3.61 倍 ；而植物激素水杨酸的添加一定程度抑制了 45‰盐度培养藻
Fesod 基因的表达，并且随其浓度增加呈现先升后降的趋势。表明蛋白核小球藻 Fesod 受盐度诱导，而水杨酸对其影响不明显。
关键词 ： 蛋白核小球藻 ；铁超氧化物歧化酶 ；转录表达 ；盐度 ；水杨酸
DOI ：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.05.027
Gene Cloning and Expression Analysis of Fesod Gene from
Chlorella pyrenoidosa
Shen Jia Jiang Lingzhi Sun Xue
（Key Laboratory of Marine Biotechnology of Zhejiang Province，School of Marine Sciences，Ningbo University，Ningbo 315211）
Abstract: The Fesod gene of Chlorella pyrenoidosa was cloned by RACE method. Total 1 215 bp Fesod sequence was obtained, containing
52 bp 5 untranslated region, 452 bp 3 untranslated region, and an open reading frame of 711 bp. The bioinformatics analysis showed that the
molecular weight of FeSOD was 26.42 kD and isoelectric point was 6.98; the FeSOD protein located in the mitochondria with a probability of
73.9%; the FeSOD protein had no signal peptide; and the secondary structure prediction results showed that a-helix and random coil in FeSOD
accounted for 53.39% and 39.41%, respectively. Then, the transcriptional expression of Fesod at different concentrations of salinity and salicylic
acid was detected by real-time fluorescent quantitative PCR. The results showed that Fesod expression increased with the salinity varying from
15‰ to 45‰, and the expression quantity was 3.61 times under 45‰ salinity culture than that under 15‰ salinity. Moreover, salicylic acid
could inhibit the mRNA accumulation of Fesod to a certain extent under 45‰ salinity, and its accumulation firstly increased and then decreased
with the salicylic acid concentration from 0.1 to 2.0 mmol/L. In conclusion, the expression of Fesod was induced by salinity, while salicylic acid
showed no significant effect on its expression.
Key words: Chlorella pyrenoidosa ；Fe-superoxide dismutase ；transcriptional expression ；salinity ；salicylic acid
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.5174
害［4］。因此植物可以通过提高 SOD 等抗氧化酶活性
来增强其抗逆性，使植物体在一定程度上能耐受或
抵抗高温、干旱、高盐等逆境胁迫带来的危害［1，5］。
但逆境胁迫对 SOD 的影响并不完全一致，如杜氏藻 D.
tertiolecta 在 3 mol/L NaCl 胁迫下的 SOD 和 CAT 等抗
氧化酶活性则没有明显变化［6］。
此外，植物激素如水杨酸（SA）和脱落酸（ABA）
等也能诱导 sod 基因的表达［7］。水杨酸是一种植物
内源信号物质和新型植物激素，大量试验证明水杨
酸具有提高植物抗病害等生物胁迫和盐度、高低温
等非生物胁迫的作用［8］。其中减轻逆境胁迫引起的
抗氧化损伤是水杨酸提高植物抗逆性的重要方式［9］。
SA 可以提高盐胁迫下的 SOD、POD 和 CAT 等抗氧
化酶的活性，从而逆转盐度压力对抗氧化酶的扰
乱［10-12］。
小球藻（Chlorella）是一类广泛应用于食品、
医疗、化工等方面的重要经济微藻，同时小球藻具
有较广泛的耐受性，因此经常用于重金属、污染物
及其它逆境胁迫的研究［13-15］。目前，在低等藻类中
关于 FeSOD 的研究不多，本研究以蛋白核小球藻（C.
pyrenoidosa）为材料，克隆该藻的铁超氧化物歧化酶
全基因序列，研究不同盐度以及水杨酸浓度对 Fesod
表达变化的影响，旨在丰富低等藻类植物中 Fesod
基因序列信息，并为 FeSOD 酶在转录水平上响应逆
境胁迫研究提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料
本实验所用藻种为蛋白核小球藻 820，来自宁
波大学海洋生物工程重点实验室藻种室。
1.2 方法
1.2.1 材料培养与处理 蛋白核小球藻 820 培养温
度为 25℃，光照强度约为 40 μmol/（m2·s），光暗
周期为 12 L/12 D。培养基为添加 f/2 的人工海水培
养基，通过控制 NaCl 的量来调节培养基盐度分别为
15‰、30‰和 45‰ ；在盐度为 45‰时，添加水杨酸
母液至水杨酸终浓度分别为 0、0.1、0.5、1.0 和 2.0
mmol/L。
1.2.2 Fesod 部分序列的克隆 根据 GenBank 数据
库中的蛋白核小球藻（DQ183067）、菜菌衣藻（Chl-
amydomonas reinhardtii，GQ413964、XM_001690539）
和 盐 生 杜 氏 藻（Dunaliella salina，AY847684） 的
Fesod 序列，运用 MEGA5.1 软件中的 ClustalW 程序
进行同源性比对，设计简并引物 sodF 和 sodR（表
1）。将离心收集的对数生长中期的藻细胞加液氮研
磨后，按照 Trizol 试剂（Invitrogen）说明进行 RNA
的提取。RNA 经过电泳检测与紫外微量分光光度计
（Nanodrop 1000）测定总 RNA 浓度和纯度，再按照
PrimeScript RT reagent kit with gDNA eraser 反转录试
剂盒（TaKaRa，大连）的说明转录成 cDNA，并以
该 cDNA 作为模板进行 PCR 扩增。扩增反应条件为：
94℃预变性 5 min ；94℃ 50 s，55℃ 1 min，72℃ 1
min，共 35 个循环 ；72℃延伸 8 min。将电泳检测
扩增大小正确的产物进行回收，用 pMD18-T 载体
（TaKaRa，大连）进行连接与转化，最后将经过挑
菌检测为阳性的重组克隆送去测序。所有引物序列
的合成和序列测定均由 Invitrogen（上海）公司完成。
1.2.3 Fesod 全基因序列扩增 测序得到的 Fesod 基
因部分序列，利用 Primer Premier 5.0 设计 RACE 扩
增引物（表 1）。用上述相同方法进行 RNA 提取，
以其反转录的 cDNA 为模板，进行 5-RACE 和 3-
RACE（RACE 试 剂 盒 来 自 TaKaRa， 大 连 ） 扩 增。
将扩增产物进行克隆后送去测序。最后将获得的
Fesod 部分序列、5-RACE 和 3-RACE 序列一起拼接
后获得 Fesod 全基因序列，并将序列递交到 NCBI 数
据库。
表 1 Fesod 基因的扩增引物
类型 引物名称 引物序列（5-3）
部分序列 sodF CACACNTTYTTYTGGGARAGCAT
sodR TANGCRTGYTCCCANACRTC
5-RACE 5sod179 TTGCCATCCTTGCCCACCACCAG
5sod209 TCAGCGTTGGGAGTCTTGGT
3-RACE 3sod77 GCGACTTTGGGTCCTTTGA
3sod186 GGTCACCAAGACTCCCAACG
定量 PCR sod416 GCGACTTTGGGTCCTTTG
sod526 CCTTGAGCTTGCCATCCTT
1.2.4 Fesod 基 因 的 系 统 进 化 分 析 在 NCBI 网 站
（http ：//www.ncbi.nlm.nih.gov）中的 protein 数据库中
查找几种绿藻的 Fesod 基因，将它们与本实验得到
的蛋白核小球藻一起用 MEGA5.1 软件中的 ClustalW
2015,31(5) 175沈佳等：蛋白核小球藻 Fesod基因的克隆及表达分析
程序进行比对，再用邻接法进行系统进化树的构建，
Bootstrap 值为 1 000。
1.2.5 Fesod 的生物信息学分析 在 NCBI 网站，通
过 ORF finder（http ：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.
html），查找其可能的开放阅读框。蛋白质分子量和
等电点预测使用 http ：//www.expasy.org，亚细胞定
位用 http ：//psort.hgc.jp，信号肽预测用 http ：//www.
cbs.dtu.dk/services/SignalP， 蛋 白 质 跨 膜 区 预 测 用
http ：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM， 蛋 白 质 二
级 结 构 预 测 用 http ：//npsa-pbil.ibcp.fr/ cgi-bin/npsa_
automat.pl?page=/NPSA/npsa_seccons.html。
1.2.6 Fesod 的表达分析 利用 Primer Premier5.0 软
件 设 计 Fesod 荧 光 定 量 PCR 引 物（ 表 1）， 用 18S
rDNA 作 为 内 标［16］。 按 照 SYBR Premix Ex Taq 说
明书进行荧光定量 PCR 反应，反应体系中 SYBR
Premix Ex Taq 10 μL，上下游引物各 0.4 μL，cDNA
2 μL， 加 水 补 足 总 体 积 到 20 μL。 荧 光 定 量 PCR
（Rotor-Gene 6000 PCR 仪）反应条件为 ：94℃预变性
3 min；94℃ 10 s，55℃ 15 s，72℃ 20 s，共 40 次循环。
荧光定量 PCR 数据采用 2-△△Ct 法进行分析［17］。
1.2.7 数据处理 数据均采用 Excel 软件作图，用
SPSS19.0 软件进行数据分析，用 SPSS 的独立样本 T
检验进行差异显著性分析，用 P<0.05 表示差异显著，
P<0.01 表示差异极显著。
2 结果
2.1 蛋白核小球藻Fesod基因的克隆
以蛋白核小球藻 cDNA 为模板，经过 PCR 扩增
得到约 250 bp 大小的 cDNA 片段，测序后其长度为
269 bp（图 1-A）。利用 GenBank 中的 BLASTn 工具
进行搜索发现，该序列与莱茵衣藻 Fesod（GenBank
登 录 号 为 U22416） 和 盐 生 杜 氏 藻（AY847684）
的 Fesod 相 似 性 均 为 75%， 与 蛋 白 核 小 球 藻
211-8bFesod（DQ183067）的相似性为 73%。该比较
结果表明获得片段是蛋白核小球藻的 Fesod 基因。
根 据 获 得 的 269 bp 的 Fesod 部 分 序 列， 设 计
RACE 引物进行上下游未知序列的扩增。5-RACE
扩增后，电泳检测（图 1-B）显示大约在 600 bp 的
位置有一条 PCR 条带，3-RACE 扩增反应后，电泳
检测（图 1-C）显示在 700 bp 附近有一条 PCR 条带。
克隆测序后得到 5-RACE 和 3-RACE 的扩增产物分
别为 604 bp 和 639 bp。拼接后得到长为 1 215 bp 的
全 Fesod 基因序列。
2000
bp
M 1
1000
750
500
250
100
2000
bp
M 2
1000
750
500
250
100
A
2000
bp
M 3
1000
750
500
250
100
CB
M ：DNA Marker ；1 ：部分 Fesod cDNA 序列 ；2 ：5-RACE 结果 ；
3 ：3-RACE 结果
图 1 蛋白核小球藻 Fesod 基因扩增结果
2.2 几株绿藻Fesod基因编码蛋白的进化分析
在 NCBI 中利用该蛋白核小球藻 Fesod（GenBa-
nk 登录号为 KF736945，蛋白序列号为 AHD25899）
进行 BLASTx 搜索，发现该蛋白核小球藻 Fesod 编码
氨基酸序列与小球藻 C. variabilis（XP_005851580）
相似性最高（为 68%），与莱茵衣藻 Fesod（XP_0016-
90591）相似性为 64%，而与蛋白核小球藻 Fesod
（ABA71697）相似性为 65%。
我们又从 NCBI 数据库中下载了 11 条绿藻和 1
条小麦的 FeSOD 氨基酸序列，与本研究得到的蛋白
核小球藻 FeSOD 共 13 条序列一起构建系统发育树。
结果（图 2）表明，12 条绿藻依次聚在一起，高等
植物小麦（与其它绿藻的遗传距离在 0.529-0.548）
在最外群。其中 6 株绿藻——两株莱茵衣藻（绿藻
门、绿藻纲、衣藻目和衣藻科）（XP_001690591 和
AAB04944），团藻目的雨生红球藻（Haematococcus
pluvialis）（AFC35159）、团藻 Volvox carteri f. nagarie-
nsis（XP_002946030）和盐生杜氏藻（AAX92665），
以及衣藻科的 Polytomella parva（ABH11031）最先
聚类 ；外面依次是石莼纲的裂片石莼（Ulva fasciata）
（ABR23159）、Trebouxiophyceae 纲的蛋白核小球藻
（ABA71697）、Coccomyxa subellipsoidea（XP_00564-
7238）、本研究的蛋白核小球藻（AHD25899）和另
外 两 条 小 球 藻 C. variabilis（XP_005851580 和 XP_
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.5176
005850533）。可见，根据 FeSOD 氨基酸序列可以把
绿藻门的不同纲分开，但是可能不太适合更低分类
水平的区分。如蛋白核小球藻（ABA71697）并没有
与同属的小球藻聚在一起，但该小球藻与裂片石莼
的遗传距离为 0.310，与同属其他 3 株小球藻的距离
为 0.329-0.394，差别较小。
Chlamydomonas reinhardtiiXP_001690591
Chlamydomonas reinhardtiiAAB04944
Volvox carteri f. nagariensisXP_002946030
Polytomella parvaABH11031
Haematococcus pluvialisAFC35159
Dunaliella salinaAAX92665
Ulva fasciataABR23159
Chlorella pyrenoidosaABA71697
Coccomyxa subellipsoideaXP_005647238
Chlorella pyrenoidosaAHD25899
Chlorella variabilisXP_005851580
Chlorella variabilisXP_005850533
Triticum aestivumAFV0863699 1001001007553 49724591
0.05
图 2 根据 FeSOD 序列构建的系统进化树
2.3 蛋白核小球藻Fesod的生物信息学分析
获得的 Fesod 基因全长 1 215 bp，其中 5- 非翻
译区长 52 bp，3- 非翻译区长 452 bp，开放阅读框
长 711 bp，共编码 236 个氨基酸。生物信息学分析
结果表明，该 Fesod 编码蛋白的理论分子量为 26.42
kD，等电点为 6.98。亚细胞定位结果表明，该 Fesod
基因定位于线粒体中的概率是 73.9%，位于细胞核
中的概率是 13.0%，位于细胞质、胞外和细胞骨架
的概率均是 4.3%。
信号肽预测结果表明该 FeSOD 蛋白没有信号
肽。跨膜结构预测结果表明编码的 236 个氨基酸全
部位于胞外。蛋白质二级结构预测结果表明 α-螺旋
占 53.39%，β-折叠占 5.93%，无规卷曲所占比例为
39.41%，不明确的氨基酸占 1.27%（图 3）。
50 100 150 200
横轴表示氨基酸位置，竖线由长至短依次为 α-螺旋、β-折叠和无规卷曲
图 3 蛋白核小球藻 FeSOD 二级结构预测图
2.4 蛋白核小球藻Fesod基因的转录表达分析
图 4 显示，蛋白核小球藻 Fesod 表达量随着盐
度升高而增加。以 15‰盐度培养藻的 Fesod 表达量
为 1，30‰和 45‰盐度培养藻的 Fesod 表达量分别
是 15‰盐度培养藻的 Fesod 表达量的 1.89 倍（P<
0.05）和 3.65 倍（P<0.01）。结果表明，高盐胁迫一
定程度地促进了蛋白核小球藻 Fesod 的表达，推测
高盐胁迫时，藻细胞通过增加 Fesod 基因表达从而
增加 FeSOD 酶的含量来对抗高盐逆境伤害。
植物激素水杨酸的添加对 45‰盐度培养蛋白核
小球藻 Fesod 表达的影响，见图 5（30‰盐度结果与
45‰类似，文中未显示）。从 0.1-2.0 mmol/L SA 浓度
变化，Fesod 表达呈现先下降后上升再下降的趋势。
以未添加 SA 的 Fesod 基因表达量作为 1，0.1 mmol/L
SA 组 Fesod 表 达 量 为 对 照 组 的 0.54 倍（P<0.05），
0.5 和 2.0 mmol/L SA 组 Fesod 表达量分别为对照组的
0.84 倍和 0.80 倍，而 1.0 mmol/L SA 组 Fesod 表达量
为对照的 1.17 倍。表明水杨酸诱导 Fesod 表达的作
2015,31(5) 177沈佳等：蛋白核小球藻 Fesod基因的克隆及表达分析
用不明显，低浓度（0.1 和 0.5 mmol/L）和高浓度（2.0
mmol/L）水杨酸处理 Fesod 基因表达均低于对照组，
只有 1.0 mmol/L SA 添加后 Fesod 表达水平比对照略
高，但差异不显著（P>0.05）。
3 讨论
SOD 是植物抗氧化系统的重要酶，相对于高
等 植 物 中 Cu/ZnSOD 和 MnSOD 的 研 究， 低 等 藻
类植物中关于 SOD 的研究并不多，如大型红藻坛
紫 菜（Pyropia haitanensis） 和 龙 须 菜（Gracilaria
lemaneiformis）中 Mnsod 基因的克隆与热胁迫下的表
达［18，19］；微藻中的钝顶螺旋藻（Spirulina platensis）、
雨 生 红 球 藻 和 莱 茵 衣 藻 的 Fesod 的 克 隆 等［20-22］。
FeSOD 一般位于植物叶绿体中［23］，也有 FeSOD 位
于细胞质中的报道，如苔藓植物 Pogonatum inflexum
和大豆［24，25］。但本研究生物信息学分析结果表明
该 FeSOD 蛋 白 位 于 线 粒 体 中（ 其 概 率 是 73.9%）。
已进行基因组测序的小球藻 C. variabilis 中有两条
Fesod 基因，分别编码 236 个和 204 个氨基酸。该
小 球 藻 C. variabilis 中 编 码 236 个 氨 基 酸 的 Fesod
（XP_005851580）与本研究小球藻 Fesod 编码的氨
基酸个数相同，对其序列进行亚细胞定位分析结果
表明其 FeSOD 蛋白位于线粒体和细胞质中的概率
分别是 34.8% 和 30.4%。蛋白质二级结构预测结果
表明该蛋白核小球藻中 α-螺旋占 53.39%，β-折叠占
5.93% ；钝顶螺旋藻 FeSOD 的二级结构中 α-螺旋所
占比例很大，而 β-折叠只有一个［20］；而雨生红球藻
FeSOD 中则含有 3 个 β-折叠片和 11 个 α-螺旋［21］，
这些结果都符合植物中 FeSOD 的 α-螺旋所占比例远
远大于 β-折叠的序列结构特征［23］。并且，该蛋白核
小球藻 FeSOD 序列也有高等单子叶植物 FeSOD 蛋
白的 WEHAYY 保守序列［23］。
盐胁迫是影响植物生命活动的重要环境因素。
盐胁迫会对植物体内活性氧的代谢系统平衡造成破
坏，具体表现在活性氧（ROS）含量增加，SOD 活
性 增 加。 而 作 为 SOD 家 族 的 一 员，Fesod 表 达 量
也受盐度诱导。如杜氏盐藻中 3.0 mol/L NaCl 培养
的 Fesod 表达量明显比 1.5 mol/L NaCl 增加［26］；100
mmol/L NaCl 处理后银杏叶中 Fesod 基因表达量提高
为对照组的 4.3 倍［27］。这些结果与本研究一致。
此外，据报道其他植物激素对高等植物 Fesod
基因表达的影响不同，如 ABA 可以诱导银杏 Fesod
基因的表达［27］，但 IAA 则无此作用［27］；而 ABA 和
IAA 不能诱导烟草 Fesod 的表达，并且 ABA 作用下
烟草 Fesod mRNA 反而有所降低［28］。本研究结果显
示水杨酸对蛋白核小球藻 Fesod 表达作用不明显。
4 结论
本研究从蛋白核小球藻中克隆到 1 215 bp 的
Fesod 序列，共编码 236 个氨基酸，该蛋白很可能位
于线粒体中，无信号肽序列，α-螺旋含量远高于 β-
折叠。该 Fesod 基因表达受盐度诱导，而植物激素
水杨酸对其表达影响较小。
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**
*
0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
4.0
15 30 45ⴀᓖ/‰Fesod⴨ሩ㺘䗮䟿
*
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
1.4
0 0.1 0.5 1.0 2.0≤ᶘ䞨⎃ᓖ/mmol·L-1Fesod⴨ሩ㺘䗮䟿
* 表示 P<0.05 ；** 表示 P<0.01，下同
图 4 盐度对蛋白核小球藻 Fesod 转录表达的影响
图 5 水杨酸对蛋白核小球藻 Fesod 转录表达的影响
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（责任编辑 马鑫）