全 文 ：·研究报告·
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2015, 31(12):249-255
类胡萝卜素是一类重要的天然色素的总称，普
遍存在于动物、高等植物、真菌、藻类中的黄色、
橙红色或红色的色素之中，具有抗氧化、抑制突变、
降低核酸损伤、减少心血管疾病及预防癌症等多种
收稿日期 ： 2015-04-21
基金项目 ：国家自然科学基金青年科学基金项目（21406111），国家高技术研究发展计划（“863”计划）（2012AA021705，2012AA022101），
大学生创新与实验开放基金项目（2015DC039）
作者简介 ：金玮玥，女，硕士研究生，研究方向 ：工业微生物及其应用 ；E-mail ：aileenfish2013@njtech.edu.cn
通讯作者 ：徐娴，女，硕士，助理研究员，研究方向 ：工业微生物及其应用 ；E-mail ：xuxian@njtech.edu.cn
常压室温等离子体诱变选育类胡萝卜素高产菌株及其
性质研究
金玮玥1  宋明凯1  矫文豪1  江凌2  李霜1  徐娴1
（1. 南京工业大学生物与制药工程学院 材料化学工程国家重点实验室，南京 211816 ；2. 南京工业大学食品与轻工学院，南京 211816）
摘 要 ： 采用新型常压室温等离子体（Atmospheric and room temperature plasma，ARTP）诱变产类胡萝卜素菌株 Deinococcus
wulumuqiensis R12，通过深孔培养板进行高通量筛选，并结合菌株类胡萝卜素含量复筛获得突变菌株 M1。与出发菌株相比，突变
菌株 M1 的类胡萝卜素含量检测为 612 μg/g 细胞干重（Dry cell weight，DCW），是出发菌株类胡萝卜素含量（212 μg/g DCW）的 2.8
倍，且遗传性稳定 ；突变菌株 M1 类胡萝卜素的高铁离子还原能力（OD700=0.52）高于出发菌株类胡萝卜素的高铁离子还原能力
（OD700=0.34），且 M1 的类胡萝卜素对 DPPH 自由基清除率为 33.33% 高于出发菌株类胡萝卜素的清除率（23.09%），结果显示突变
菌株 M1 具有更强的抗氧化能力 ；在相同 γ辐射与 UV 辐射剂量下突变菌株 M1 具有比出发菌株更高的存活率。研究表明突变菌株
M1 在类胡萝卜素产量、菌株抗氧化性能及抗辐射性能方面均优于出发菌株 D. wulumuqiensis R12。
关键词 ： 常压室温等离子体 ；类胡萝卜素 ；诱变 ；抗氧化性
DOI ：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.12.036
The Screening and Characterization of High-yield-carotenoid Strain
from Deinococcus wulumuqiensis R12 by ARTP
Jin Weiyue1 Song Mingkai1 Jiao Wenhao1 Jiang Ling2 Li Shuang1 Xu Xian1
（1. State Key Laboratory of Materials-oriented Chemical Engineering，College of Biotechnology and Pharmaceutical Engineering，Nanjing
Tech University，Nanjing 211816 ；2. State Key Laboratory of Materials-oriented Chemical Engineering，College of Food Science and Light
Industry，Nanjing Tech University，Nanjing 211816）
Abstract: Using the atmospheric and room temperature plasma（ARTP）to induce the carotenoid-producing Deinococcus wulumuqiensis
R12, the mutant strain M1 was finally obtained by high-throughput screening with polystyrene plates as well as re-screening according to the
content of carotenoid. The strain M1 produced 612 μg/g dry cell weight（DCW）of carotenoid after fermenting 72 h, 2.8 times of carotenoid by
original D. wulumuqiensis R12（212 μg/g DCW）, and heredity was stable. The carotenoid of the strain M1 showed stronger activity in high iron
ion reducing power（OD700 = 0.52）than that（OD700 = 0.34）of original strain, and higher DPPH scavenging rate（33.33%）than 23.09%,
indicating the mutant strain M1 possessed better anti-oxidative capacity. Under the same γ-ray and UV radiation dose, the strain M1 survived at
higher rate than the original strain. Experimental results indicated that the strain M1 was superior to original D. wulumuqiensis R12 in the aspects
of carotenoid content, anti-oxidative capacity of carotenoid and anti-radiation capacity of strain.
Key words: atmospheric and room temperature plasma ；carotenoid ；mutation ；anti-oxidation
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.12250
保健功能［1，2］。目前利用发酵法生产天然类胡萝卜
素的微生物有霉菌、细菌和酵母等［3-5］。耐辐射奇
异 球 菌 Deinococcus wulumuqiensis R12 是 一 种 红 色、
不产孢子、非致病性的球菌，对电离辐射、干燥、
紫外线、各种 DNA 损伤以及强氧化剂具有较强的抗
性，其细胞膜富含的大量类胡萝卜素是脂质、蛋白
质、多糖的抗氧化剂，因而耐辐射奇异球菌具有较
强的抗氧化能力［6-8］。因此，开发利用耐辐射奇异
球菌进行发酵生产类胡萝卜素具有重要的价值。
常压室温等离子体（Atmospheric and room temp-
erature plasma，ARTP）育种技术是近年来兴起的一
种新型有效的微生物诱变方法。采用氦气为工作气
体的等离子体射流作用于微生物，从而引起微生物
的突变。与传统诱变方法相比，采用 ARTP 技术能
够有效造成 DNA 多样性的损伤，突变率高，并易获
得遗传稳定性良好的突变株 ；与分子操作手段相比，
ARTP 技术进行微生物诱变育种具有操作安全性高、
无有毒有害物质参与诱变过程等优点［9］。最近几年，
ARTP 技术在微生物突变育种及生物医学领域中已
经引起人们越来越多的注意，已经成为当前一个相
当活跃的交叉学科研究领域，得到了越来越广泛的
应用［10，11］。
实验室前期获得一株极端耐辐射奇异球菌 D.
wulumuqiensis R12，属于 Deinococcus 属，并有可能
是 该 菌 属 中 的 一 个 新 种［12］。D. wulumuqiensis R12
合成的类胡萝卜素经过薄层层析和高效液相色谱
分 析 表 明， 除 主 要 产 物 deinoxanthin［13］ 之 外， 还
存在其他次级代谢产物。为了使 D. wulumuqiensis
R12 能高效、大量合成类胡萝卜素，本研究以 D.
wulumuqiensis R12 为出发菌株，利用 ARTP 技术进
行诱变，筛选高产类胡萝卜素的稳定突变菌株，并
研究突变菌株类胡萝卜素的抗氧化性能及菌株的抗
辐射性能。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 试剂 蛋白胨、酵母粉（OXOID，England）；
氯化钠、葡萄糖、丙酮、甲醇、盐酸（国药集团化
学试剂有限公司）；琼脂粉（上海化学试剂公司）；
K3Fe（CN）6、1，1-二苯基 -2- 三硝基苯肼（DPPH）（上
海宝曼生物科技有限公司）；三氯乙酸（永华化学科
技有限公司）。
1.1.2 仪器 微量移液器（Eppendorf）；高压灭菌
锅（YXQ.SG41.280，上海医用核子仪器厂）；水浴
锅（HH-4，上海国华仪器厂）；烘干箱（PYX-DHS，
上海实验仪器厂）；培养箱（101A-2，上海跃进医疗
器械厂）；电子天平（BP110S，Sartorias）；离心机
（SIGMA 15K，SIGMA）；超净工作台（JW-CJ-IF，苏
州净化设备厂）；数字恒温水浴锅（HH-4，常州国
华电器有限公司）；酶标仪（M3，Thermo）；紫外光
栅分光光度计（752，上海精密科学仪器有限公司）；
ARTP 生物育种机（北京思清源生物科技有限公司）；
UV 灯（苏州市相城区新亚特光源厂）；紫外辐射表
（VLX-3W，法国 Radiometer 公司）。
1.1.3 菌种 耐辐射奇异球菌 D. wulumuqiensis R12
（实验室选育保藏）。
1.1.4 培养基（g/L） TGY 液体培养基 ：蛋白胨 5，
酵母粉 3，葡萄糖 1，pH7.2。TGY 固体培养基 ：在
TGY 液体培养基中添加 2.5% 琼脂粉。以上培养基
均在 121℃灭菌 20 min。
1.2 方法
1.2.1 细胞干重测定方法 待测发酵液加入离心管
中，12 000 r/min 离心 5 min 收集菌体，弃去培养基，
将菌体用蒸馏水洗涤 3 次，100℃干燥直至恒重。
1.2.2 ARTP 诱变方法 从 -80℃的冻存菌中接种 D.
wulumuqiensis R12 至 TGY 固体培养基，30℃培养 3-4
d 后，挑取单菌落接种至 TGY 液体培养基，在 30℃
的 150 r/min 摇床中培养 20-30 h 至对数生长期。用
分光光度计测量菌液的吸光度（OD600 值），用生理
盐水调整菌液 OD600 值至 1，取 10 μL 进行 ARTP 诱
变。以 99.99% 氦气作为工作气体，在电源功率为
115 W、操作温度在 23.0-35.0℃的条件下分别诱变
0、30、60、90、120、150 和 180 s。诱变结束后用
生理盐水进行梯度稀释，取 10-6 和 10-7 浓度的菌液
涂布于 TGY 固体培养基上，放于 30℃的培养箱中
培养 2-3 d，计算平板上菌落数，通过菌落计数法
（Colony forming units，CFU）计算致死率，绘制致死
率曲线。
2015,31(12) 251金玮玥等：常压室温等离子体诱变选育类胡萝卜素高产菌株及其性质研究㠤↫⦷% ×100
ΝሩΝሩΝ䈡
其中，N 对 为对照处理菌落数 ；N 诱 为诱变处理菌
落数。
1.2.3 突变株的筛选 将诱变后的菌液稀释一定倍
数涂布 TGY 平板，根据菌落生长情况挑取生长大而
丰满、颜色较深的菌落，接种单菌落于装有 2.4 mL
TGY 液体培养基的 24 孔深孔培养板中，于 30℃、
150 r/min 培养 48 h。利用 96 孔板测定发酵液 OD600，
并观察菌体颜色深浅进行菌株的初筛。通过测定初
筛得到的突变菌株类胡萝卜素含量进行菌株的复筛。
1.2.4 类 胡 萝 卜 素 的 提 取 与 检 测 方 法 参 照 文
献［14，15］ 中方法，略加改进。将初筛筛出的突变
菌株接种至含液体 TGY 培养基 50 mL 的 250 mL 摇
瓶中进行培养，30℃、150 r/min 培养 72 h 后 6 000
r/min 离心 10 min 收集菌体，弃去培养基，将菌体用
蒸馏水洗涤 3 次，冻干之后，-20℃保存。取冷冻保
存的菌体 0.1 g 至 50 mL 离心管中，加入 4 mL HCL
（3 mol/L），28℃振荡 1 h。随后沸水浴中加热 4 min，
置于冰水浴中迅速冷却，6 000 r/min 离心 10 min，
弃上清，沉淀以蒸馏水洗涤 2 次，弃上清取沉淀，
最后加入 4 mL 有机溶剂（丙酮∶甲醇 =7∶2）提取
类胡萝卜素，28℃振荡 30 min，6 000 r/min 离心 15
min，上清即为类胡萝卜素粗提取液，用 0.22 μm 滤
头过滤后避光 -20℃保存。
类胡萝卜素粗提取液含量测定采用分光光度法
确定，类胡萝卜素含量的计算公式为 ：㊫㜑㩍ঌ㍐ਜ਼䟿μg/g Α475×D×V
0.16×W

其中，A475 为类胡萝卜素在 475 nm 吸收波长下的吸
光度 ；V 为有机溶剂浸提所用的总体积（mL）；D 为
色素浸提液的稀释倍数 ；W 为菌体质量（g）；0.16
为类胡萝卜素的消光系数。
1.2.5 突变菌株遗传稳定性检测 在 TGY 固体培养
基上活化菌，转接到装有 5 mL TGY 液体培养基的
50 mL 离心管中进行一级培养，连续转接 10 次，测
定突变菌株产类胡萝卜素能力的遗传稳定性。
1.2.6 突变菌株的抗氧化性检测方法
1.2.6.1 高铁离子还原能力测定 参照文献［16，17］中
方法，略加改进。取 0.5 mL 类胡萝卜素粗提取液，
加入 0.5 mL l% 的 K3Fe（CN）6，混匀，50℃孵育 20
min，加入 0.5 mL 10% 的三氯乙酸（TCA），然后将
混合物 3 500 r/min 离心 10 min。取 1 mL 上清，加入
1 mL 0.1% 的三氯化铁溶液。测定反应液在 700 nm
下的吸光度，吸光值越大说明样品对高铁离子的还
原能力越强。
1.2.6.2 DPPH 法 测 定 自 由 基 清 除 活 性 参 照 文
献［17，18］中方法，略加改进。取 1 mL 的类胡萝卜素
粗提取液，加入 1 mL 0.2 mmol/L DPPH 乙醇溶液，
振荡混合，室温下避光反应 30 min。测定反应液在
580 nm 下的吸光度，吸光度越小说明样品对 DPPH
的清除能力越强。清除率计算公式为 ：␵䲔⦷%
AオAオAṧ ×100
其 中，A 空 ：等 体 积 溶 剂 丙 酮 ：甲 醇 =7 ：2（V/V）
代替类胡萝卜素粗提取液的吸光度 ；A 样 ：类胡萝卜
素粗提取液的吸光度。
1.2.7 突变菌株的抗辐射性能测定［12］
1.2.7.1 γ 射线测定菌株耐辐射性能 以突变菌株为
测试菌株，设置原始菌株 D. wulumuqiensis R12 为阳
性对照，设置 Escherichia coli DH5α 为阴性对照。将
菌株培养在 TGY 液体培养基中生长到对数生长期，
在 4℃、12 000 r/min 离心 5 min 后以生理盐水重悬
菌体，分别得到浓度为 107-108 CFU/mL 的菌液。将
菌液分别分成 2 mL 的小份，在 25℃的环境中，暴
露在 0.167 kGy/min 剂量的 60Co 的放射源下，在辐射
量 0-20.0 kGy 范围内，以 2.0 kGy 为梯度进行 γ 辐
射处理。每隔 10 min，取 0.1 mL 的辐射菌液，用生
理盐水进行梯度稀释，每个稀释梯度涂布 TGY 平板，
置于 30℃培养箱内培养。每天计数 TGY 培养基上的
菌落形成单位，计数 15 d。
1.2.7.2 UV 辐射测定菌株耐辐射性能 以突变菌株
为测试菌株，设置原始菌株 D. wulumuqiensis R12 为
阳性对照，设置 E. coli DH5α 为阴性对照。将菌株培
养在 TGY 液体培养基中生长到对数生长期，在 4℃、
12 000 r/min 离心 5 min 后以生理盐水重悬菌体，分
别得到浓度为 107-108 CFU/mL 的菌液。将菌液分别
分成 2 mL 的小份，在 254 nm 的 UV 灯下照射，通
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.12252
过紫外辐射表检测 UV 辐射强度，考察不同照射剂
量下各菌株的存活率。每隔 10 min，取 0.1 mL 的照
射菌液，用生理盐水进行梯度稀释，每个稀释梯度
涂布 TGY 平板，置于 30℃培养箱里培养。每天计数
TGY 培养基上的菌落形成单位，计数 15。
2 结果
2.1 ARTP诱变致死率曲线的测定
对 D. wulumuqiensis R12 进行 ARTP 诱变，考察
不同诱变时间菌株的致死率（图 1）。从图 1 中可以
看出，随着诱变时间的增加致死率上升，在 90 s 条
件下达到致死率 90% 以上（93.8%），之后随时间增
加致死率接近 100%。为了使菌株获得较好的正向突
变，本研究选用 90 s 作为 ARTP 的诱变条件。
分别培养，测定在 600 nm 处的吸光值，进行生长曲
线的测定。如图 3 所示，出发菌株 D. wulumuqiensis
R12 与突变菌株 M1 的延滞期都较短，能迅速进入
对数期，对数期阶段突变菌株生长速度略高于出发
菌株，进入稳定期后，突变菌株细胞浓度明显高于
出发菌株的细胞浓度。
-20 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200
0
20
40
60
80
100
120㠤↫⦷% 䈡ਈᰦ䰤s
图 1 出发菌株 D. wulumuqiensis R12 在不同 ARTP 照射
时间下的致死率曲线
2.2 诱变菌株的筛选
以 99.99% 氦气作为工作气体，在电源功率为
115 W、操作温度在 23.0-35.0℃的条件下诱变 90 s，
得到 252 株生长大而丰满、颜色较深的菌落。通过
24 孔深孔培养板和 96 孔板进行高通量初筛后，获
得了 35 株生长 OD600 高于出发菌株 D. wulumuqiensis
R12 且发酵颜色较深的菌株。结合类胡萝卜素含量
测定进行复筛，最终筛选到了 1 株突变菌株，命名
为 M1。D. wulumuqiensis R12 和突变菌株 M1 在 30℃，
培养 72 h 后在平板上的生长情况，如图 2 所示。
2.3 突变菌株的生长特性
为了更好地掌握突变菌株 M1 的生长特性，本
研究对出发菌株 D. wulumuqiensis R12 和突变菌株 M1
A B
图 2 出发菌株 D. wulumuqiensis R12（A）和突变菌株
M1（B）在 TGY 平板上的生长情况
-10 0 10 20 30 40 50 60 70 80
-2
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
O
D
60
0 ਁ䞥ᰦ䰤h
ࠪਁ㧼Ṛケਈ㧼Ṛ
图 3 出发菌株和突变菌株 M1 的生长曲线
2.4 突变菌株的类胡萝卜素含量
利用丙酮 / 甲醇溶液（7∶2，V/V）对出发菌株 D.
wulumuqiensis R12 和突变菌株中的类胡萝卜素进行
了提取和测定。如图 4 所示，D. wulumuqiensis R12
中类胡萝卜素含量为 212 μg/g DCW，M1 中类胡萝
卜素含量为 612 μg/g DCW。突变菌株 M1 中的类胡
萝卜素含量明显高于出发菌株 D. wulumuqiensis R12，
且是出发菌株类胡萝卜素含量的 2.8 倍。
2.5 突变菌株的遗传稳定性
为了鉴定筛选的突变菌株经传代后是否出现形
状的衰退，将突变菌株 M1 连续转接 10 代，图 5 显
示 M1 类胡萝卜素含量稳定在 601-623 μg/g DCW 之
间。表明突变菌株 M1 遗传性状稳定。
2015,31(12) 253金玮玥等：常压室温等离子体诱变选育类胡萝卜素高产菌株及其性质研究
2.6 突变菌株类胡萝卜素的抗氧化性能
2.6.1 高铁离子的还原能力 通过对铁离子的还原能
力来测定抗氧化物质的总还原能力，具体原理为还原
剂可以将铁氰化钾（K3Fe（CN）6）还原成亚铁氰化
钾［K4Fe（CN）6］，Fe
3+ 与 K4Fe（CN）6 作用生成亚
铁氰化铁（Fe4［Fe（CN）6］3），Fe4［Fe（CN）6］3
在 700 nm 下吸光度较高，所以可通过对吸光度的
测定来衡量有多少 K3Fe（CN）6 被还原，其中吸光
度越大还原能力越强。图 6 为测定 D. wulumuqiensis
R12 和突变菌株 M1 类胡萝卜素的高铁离子还原能
力，经测定，在相同体积类胡萝卜素的条件下，D.
wulumuqiensis R12 的 吸 光 值 为 0.340， 而 突 变 菌 株
M1 的吸光值为 0.52。表明在相同体积类胡萝卜素的
情况下，突变菌株 M1 类胡萝卜素对高铁离子的还
原能力比出发菌株类胡萝卜素强，说明突变菌株 M1
的抗氧化能力强于出发菌株。
2.6.2 DPPH 自由基清除活性 1，1-二苯基 -2- 苦
肼 基 自 由（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl radical 2，2-
diphenyl-1-（2，4，6-trinitrophenyl）hydrazyl，DP-PH）
醇溶液为深紫色，是一种稳定自由基，具有一个未
配对电子，可接受 1 个 H+ 或者 1 个 e- 才能到稳定。
当有自由基清除剂存在时，DPPH 溶液的颜色会变
浅，吸光值将会呈线性下降，所以可以用来评价试
验样品的抗氧化能力。用清除率来表示抗氧化能力，
清除率越大则抗氧化性越强。
图 7 显 示， 出 发 菌 株 D. wulumuqiensis R12 对
DPPH 的清除率为 23.09%，突变菌株 M1 对 DPPH
的清除率为 33.33%。表明出发菌株和突变菌株的类
胡萝卜素提取液都具有一定的 DPPH 清除能力，且
突变菌株 M1 的清除率高于出发菌株，说明突变菌
株 M1 的抗氧化能力强于出发菌株。
2.7 突变菌株抗辐射性能
2.7.1 γ 辐射照射下菌株的存活率 从图 8 中可以看
ࠪਁ㧼Ṛ M10100200300400
500
600
700
㊫㜑㩍ঌ㍐ਜ਼䟿/μg·g-1 DCW

㧼Ṛ
图 4 出发菌株和突变菌株 M1 的类胡萝卜素含量
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
0
100
200
300
400
500
600
700
㊫㜑㩍ঌ㍐ਜ਼䟿/μg·g-1 DCW

Րԓ⅑ᮠ
图 5 突变菌株 M1 的遗传稳定性
ࠪਁ㧼Ṛ M10.00.10.20.3
0.4
0.5
0.6
O
D
70
0
㧼Ṛ
图 6 出发菌株和突变菌株 M1 类胡萝卜素的高铁离子还原
能力
ࠪਁ㧼Ṛ M105101520
25
30
35␵䲔⦷% 㧼Ṛ
图 7 出发菌株和突变菌株 M1 类胡萝卜素的 DPPH 自由
基清除能力
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.12254
出，E. coli DH5α 在低辐射量下已达到 100% 致死率，
而 D. wulumuqiensis R12 和突变菌株 M1 在 16 kGy 的
辐射量下仍有一定存活率，并且在相同辐射量下，
突变菌株的存活率高于出发菌株，说明突变菌株 M1
具有更强的耐 γ 射线辐射能力。
意义。前期已经对 D. wulumuqiensis R12 进行了全基
因组测序［6］，通过 BLAST 比对初步发现与类胡萝卜
素合成相关的一系列基因，将进一步通过实验验证
各基因功能，并探究 deinoxanthin 合成途径。
ARTP 诱变得到的菌株存在正突变和负突变，
为了快速高效筛选到有利菌株，采用了高通量筛选
（High throughput screening，HTS） 技 术 进 行 初 筛。
郑明英等［11］采用高通量筛选手段获得 16 株生长速
率和脯氨酸产率变化的菌株，最终结合实验筛选到
一株高产脯氨酸的突变菌株。蔡友华等［20］通过高
通量筛选获得一株 L-苏氨酸产量明显提高的突变株。
罗莉斯等［21］建立了 96 孔板高通量筛选多杀菌素高
产菌株的方法，该方法显著提高菌株的筛选效率。
本研究利用 24 孔深孔培养板对突变菌株进行相同时
间的发酵培养，通过测定 OD600 确定细菌生长密度，
并观察菌体颜色深浅进行初筛。通过测定突变菌株
类胡萝卜素产量进一步对初筛菌株进行复筛，结果
表明突变菌株类胡萝卜素产量高于出发菌株，进一
步证明通过细菌生长密度与菌体颜色深浅能够表明
菌株发生了正突变。
类胡萝卜素是菌株 D. wulumuqiensis R12 中非酶
类抗氧化系统中的天然化合物，在菌体抗氧化作用
中发挥重要作用。胡雅萍［22］的研究表明，类胡萝
卜素提取物在抗氧化活性上具有浓度依赖特征，浓
度越高抗氧化性越强，因此菌株类胡萝卜素抗氧化
实验的结果表明突变菌株的类胡萝卜素浓度更高，
说明突变菌株的抗氧化性要强于出发菌株。
为了能更好的应用于工业化生产，对突变菌株
还需进一步研究 ：对突变菌株进行摇瓶、发酵罐等
发酵培养，优化发酵条件 ；对其产生的类胡萝卜素
进行性质结构的鉴定 ；对突变菌株进行基因测序，
与出发菌株相比进行基因组分析或关键酶基因分析
等一系列后续实验。
4 结论
本实验以耐辐射奇异球菌 D. wulumuqiensis R12
作为出发菌株，采用 ARTP 诱变育种，结合高通量
筛选方法进行初筛和菌株类胡萝卜素含量复筛，得
到了一株高产类胡萝卜素菌株 M1。
研 究 D. wulumuqiensis R12 和 突 变 菌 株 M1 的
-2 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22
0
20
40
60
80
100ᆈ⍫⦷% 䗀ሴࡲ䟿/kGy
E. coli DH5α
ࠪਁ㧼Ṛケਈ㧼Ṛ
图 8 γ 射线照射下出发菌株、突变菌株 M1 和 E. coli DH5α
存活曲线
2.7.2 UV 辐射照射下菌株的存活率 考察不同 UV
辐射剂量下的菌株存活率，从表 1 中可以看出，E.
coli DH5α 在辐射强度为 200 J/m2 条件下存活率仅为
1%，在辐射剂量为 400 J/m2 条件下存活率已基本为 0，
但出发菌株和突变菌株在 200-600 J/m2 条件下均具
有存活率，且突变菌株的存活率高于出发菌株，说
明突变菌株 M1 具有更强的耐 UV 射线辐射能力。
表 1 UV 照射下出发菌株、突变菌株 M1 和 E. coli DH5α
存活率 /%
菌株
辐射强度（J/m2）
0 200 400 600 800
D. wulumuqiensis R12 100 12±1.8 0.5±0.05 0.3±0.08 0
E. coli DH5α 100 1±0.23 0.008±0.0021 0 0
M1 100 15±2.3 0.6±0.12 0.41±0.09 0
3 讨论
耐辐射奇球菌代谢过程中积累的主要类胡萝卜
素 deinoxanthin，尽管其生物合成途径还不明确，但
是研究表明，这种类胡萝卜素具有比番茄红素、β
胡萝卜素、叶黄素和玉米黄质更强的清除氧自由
基、单线态氧和 H2O2 的能力
［19］。因此努力提高 D.
wulumuqiensis R12 的类胡萝卜素生产能力具有重要
2015,31(12) 255金玮玥等：常压室温等离子体诱变选育类胡萝卜素高产菌株及其性质研究
类胡萝卜素产量差异发现，相同细菌干重的突变
菌 株 M1 在 发 酵 72 h 后， 类 胡 萝 卜 素 含 量 比 D.
wulumuqiensis R12 高，含量为 612 μg/g DCW，而出
发菌株只有 212 μg/g DCW，是出发菌株的 2.8 倍，
且突变菌株 M1 具有良好的遗传稳定性。
突 变 菌 株 M1 的 类 胡 萝 卜 素 具 有 比 D.
wulumuqiensis R12 更强的高铁离子还原能力和 DPPH
自由基清除能力，表明突变菌株 M1 具有比出发菌
株更强的抗氧化能力。在相同 γ射线和 UV 辐射剂
量下，突变菌株的存活率均显著高于出发菌株，因
此突变菌株具有比出发菌株更强的耐辐射能力。
参 考 文 献
［1］ 许青 . 类胡萝卜素吸收研究进展［J］. 国际病理科学与临床杂
志 , 1996, 16（4）：249-251.
［2］ 李福枝 , 刘飞 , 曾晓希 , 等 . 天然类胡萝卜素的研究进展［J］.
食品工业科技 , 2007, 28（9）：227-232.
［3］ Wang Q, Luo W, Gu QY, et al. Enhanced lycopene content in Blake-
slea trispora by effective mutation-screening method［J］. Applied
Biochemistry and Biotechnology, 2013, 171（7）：1692-1700.
［4］ Zhao J, Li QY, Sun T, et al. Engineering central metabolic modules
of Escherichia coli for improving β-carotene production［J］. Meta-
bolic Engineering, 2013, 17 ：42-50.
［5］ Ukibe K, Hashida K, Yoshida N, et al. Metabolic engineering of
Saccharomyces cerevisiae for astaxanthin production and oxidative
stress tolerance［J］. Applied and Environmental Microbiology,
2009, 75（22）：7205-7211.
［6］ Xu X, Jiang L, Zhang ZD, et al. Genome sequence of a gamma- and
UV-ray-resistant strain, Deinococcus wulumuqiensis R12［J］.
Genome Announcements, 2013, 1（3）. piie00206-e002-13.
［7］Carbonneau MA, Melin AM, Perromat A, et al. The action of free
radicals on Denococcus radiodurans carotenoids［J］. Achives of
Biochemistry and Biophysics, 1989, 275（1）：244-251.
［8］Saito T, Ohyama Y, Ide H, et al. A carotenoid pigment of the
radioresistant bacterium Deinococcus radiodurans［J］. Microbios,
1998, 95（381）：79-90.
［9］ Lu Y, Wang LY, Ma K, et al. Characteristics of hydrogen production
of an Enterobacter aerogenes mutant generated by a new atmospheric
and room temperature plasma（ARTP）［J］. Biochemical
Engineering Journal, 2011, 55（1）：17-22.
［10］ Zong H, Zhan Y, Li X, et al. A new mutation breeding method for
Streptomyces albulus by an atmospheric and room temperature
plasma［J］. African Journal of Microbiology Research, 2012, 6
（13）：3154-3158.
［11］ 郑明英 , 蔡友华 , 陆最青 , 等 . 常压室温等离子体快速诱变筛
选高脯氨酸产率突变株［J］. 食品与发酵工业 , 2013, 39（1）：
36-40.
［12］ Wang W, Mao J, Zhang ZD, et al. Deinococcus wulumuqiensis sp.
nov. , and Deinococcus xibeiensis sp. nov. , isolated from radiation-
polluted soil［J］. International Journal of Systematic and
Evolutionary Microbiology, 2010, 60（9）：2006-2010.
［13］ Lemee L, Peuchant E, Clerc M. Deinoxanthin ：a new carotenoid
isolated from Deinococcus radiodurans［J］. Tetrahedron, 1997,
53（3）：919-926.
［14］ 王飞 , 封琼 , 刘程智 , 等 . 奇球菌属类胡萝卜素提取物的抗氧
化活性研究［J］. 核农学报 , 2012, 26（6）：900-905.
［15］ 封琼 . Deinococcus radiopugnans 类胡萝卜素的提取纯化、特性
和生物活性的研究［D］. 杭州 ：浙江大学 , 2013.
［16］ Benzie IFF, Strain JJ. The ferric reducing ability of plasma（FRAP）
as a measure of “antioxidant power”：the FRAP assay［J］.
Analytical Biochemistry, 1996, 239（1）：70-76.
［17］ 陈君 . 高抗氧化微生物筛选及其延缓小鼠衰老的研究［D］.
南昌 ：南昌大学 , 2012.
［18］ 韩伟 , 刘文群 , 黄丽婵 , 等 . 5 株微生物抗氧化作用的初步研
究［J］. 食品与机械 , 2008, 24（5）：45-47.
［19］ Tian B, Xu ZJ, Sun ZT, et al. Evaluation of the antioxidant effects
of carotenoids from Deinococcus radiodurans through targeted
mutagenesis, chemiluminescence, and DNA damage analyses［J］.
Biochimica et Biophysica Acta（BBA）- General Subjects, 2007,
1770（6）：902-911.
［20］ 蔡友华 , 李文锋 , 卢伟宁 , 等 . 新型常压室温等离子体（ARTP）
快速诱变高产苏氨酸的突变株［J］. 现代食品科技 , 2013, 29
（8）：1888-1892.
［21］ 罗莉斯 , 李能威 , 李丽 , 等 . 96 孔板高通量筛选多杀菌素高
产菌株的研究［J］. 中国农业科技导报 , 2010, 12（2）：133-
137.
［22］胡雅萍 . 耐辐射奇球菌特种类胡萝卜素 deinoxanthin 药理学活
性的初步研究［D］. 杭州 ：浙江大学 , 2011.
（责任编辑　李楠）