全 文 ：·技术与方法·
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2015, 31(6):87-92
收稿日期 ：2014-10-22
基金项目 ：国家“863“计划项目（2007AA10Z212，2012AA101609-7）
作者简介 ：宋艳敏，女，硕士，研究方向 ：食品微生物 ；E-mail ：songyanminyx@sina.com
通讯作者 ：梁志宏，女，博士，研究方向 ：食品微生物及生物脱毒 ；E-mail ：lzh01@cau.edu.cn
冷鲜肉又称冷却肉，是指在屠宰、加工和销售
过程中一直处于 4℃低温而不冻结的肉，目前，冷
链销售是一种国内外广泛应用的生鲜肉类销售模
式［1］。由于冷鲜肉的货架期较短，各地储藏销售冷
链系统参差不齐，所以对冷鲜肉的安全检测和新鲜
度评价就不可或缺。
利用实时定量 PCR 快速检测冷鲜猪肉新鲜度指标的
方法研究
宋艳敏1  石丽敏1  徐瑗聪1  许文涛1，3  黄岚2  梁志宏1
（1. 中国农业大学食品科学与营养工程学院，北京 100083 ；2. 中国农业大学信息与电气工程学院，北京 100083 ；
3. 食品质量与安全北京实验室，北京 100083）
摘 要 ： 目前冷鲜猪肉新鲜度指标检测繁琐，探索快速检测冷鲜猪肉新鲜度指标新技术成为研究热点。利用国标法检测发
性盐基氮（Total volatile basic nitrogen，TVB-N）含量，平板培养法和实时定量 PCR 技术分别检测腐败微生物数量。结果显示，冷
鲜猪肉在 4℃条件下，随储藏时间延长，微生物的菌落总数和 TVB-N 逐渐增加且呈线性相关，与猪肉品的腐败程度呈正相关；丙酮 -
氯仿法提取的细菌基因组条带清晰，提取效果好 ；基于 SYBER Green Ⅰ的实时定量 PCR 技术检测的菌落数量与平板培养测得菌落
总数利用单因素方差分析结果没有显著性差异（P=0.7190），一致性较好；实时定量 PCR 方法缩短了检测时间，提高了检测灵敏度。
微生物是冷鲜猪肉新鲜度评价的重要指标，实时定量 PCR 可以作为一种快速高效检测冷鲜猪肉新鲜度指标的新技术。
关键词 ： 冷鲜猪肉 ；实时定量 PCR ；微生物 ；TVB-N
DOI ：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.06.013
Fast Detection of Freshness of Chilled Pork by Real-time
Quantitative PCR
Song Yanmin1 Shi Limin1 Xu Yuancong1 Xu Wentao1，3 Huang Lan2 Liang Zhihong1
（1. College of Food Science and Nutritional Engineering，China Agricultural University，Beijing 100083 ；2. College of Information and
Electrical Engineering，China Agricultural University，Beijing 100083 ；3. Beijing Food Quality and Safety Laboratory，Beijing 100083）
Abstract: The current detection techniques for freshness of chilled pork are complex, so exploring fast detection techniques becomes
hotspot. In this study Total Volatile Basic Nitrogen（TVB-N）was detected by the method defined in national standard, and Plate Culture
Method（PCM）and real-time quantitative PCR were used to count the total amount of microorganisms causing spoilage of chilled pork. With
the extension of storage time of the chilled pork at 4℃, the total number of microorganism colony and TVB-N had the linear correlation, and the
level of spoilage of chilled pork behaved the positive correlation. The extracted bacterial genome by acetone-chloroform had the clear bands and
showed the fine extraction result. Single-factor analysis of variance revealed that there was no significant difference of total number of colony
（P=0. 7190）between by real-time quantitative PCR based on SYBER Green I and by counting in PCM, i. e. , consistency was quite solid. The
detection time was reduced by real-time quantitative PCR with higher detection sensitivity. The amount of microorganisms is a crucial index to
evaluate the freshness of chilled pork, and real-time quantitative PCR can be a new technology for quickly checking the freshness of chilled pork.
Key words: chilled pork ；Real-time quantitative PCR ；microorganism ；total volatile basic nitrogen（TVB-N）
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.688
根据我国对冷鲜肉的卫生标准规定［2］，肉的
新鲜度评价主要采用感官标准、微生物和理化标准
相结合的方法。但由于其主观因素较大、耗时耗
力、检测成本较高等缺点，所以专家们在不断探索
快速无损检测方法［3］。2009 年毕松等［4］通过分析
细菌菌斑变化与挥发性盐基氮（Total Volatile Basic
Nitrogen，TVB-N） 间 的 关 系 来 检 测 肉 的 新 鲜 度 ；
2012 年王丽等［5］运用近红外光谱技术快速无损地
检测猪肉的新鲜度 ；2012 年 Tian 等［6］利用电子鼻
分析检测猪肉的新鲜度，研究中建立主要成分分析
（Principal component analysis，PCA）模型并得出结
果 ：当猪肉中的 TVB-N ≤ 15 mg/100 g 或细菌总数
≤ 106 CFU/g 为新鲜肉 ；当 TVB-N ≥ 15 mg/100 g 或
细菌总数≥ 106 CFU/g 视为腐败肉。此外，还有电子
舌、超生波技术、计算机视觉技术［7］等。微生物是
导致冷鲜肉腐败变质的因素之一，主要有腐败微生
物和病原微生物两种，其中假单胞菌是冷鲜猪肉的
主要致腐菌［8，9］。
传 统 微 生 物 检 测 方 法 操 作 繁 琐， 测 量 周 期
长，在实际应用中有一定局限性 ；聚合酶链式反应
（Polymerase chain reaction，PCR）技术具有灵敏度
高、特异性好、操作简单、速度快等特点［10］。但是
普通 PCR 只能定性不能定量检测，而实时定量 PCR
技术可定量检测微生物，这种技术不需要琼脂糖凝
胶电泳，不仅缩短了检测时间，而且简化了操作步骤，
具有较高的应用价值。但实时定量 PCR 在冷鲜猪肉
新鲜度指标检测方面的研究尚少。本研究通过分析
细菌总数和 TVB-N 间的关系，旨在探索荧光实时定
量 PCR 法作为一种快速灵敏的检测手段在冷鲜猪肉
细菌总数的检测中的应用。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 原料肉 超市冷鲜肉，4℃用 PE 塑料保鲜膜
封好并避光保藏。
1.1.2 主要试剂与设备
1.1.2.1 主要试剂 平板计数琼脂培养基，假单胞
菌选择性培养基（Pseudomonas selective agar，PSA），
盐酸，硼酸，甲基红和次甲基蓝指示剂，丙酮，无
水乙醇，氯仿，异戊醇，所用试剂均为分析纯。
1.1.2.2 主要设备 美国 ABI 公司的 ABI-2720 PCR
仪 ；ABI-7500 荧光定量 PCR 仪 ；北京市六一仪器厂
的 DYCZ-24 D 垂直板电泳槽 ；美国生物基因系统公
司的 CHEMI- SMART3000 WL/ LC 荧光化学发光凝胶
成像分析系统 ；北京毅新兴业公司的 Midrop100 微
量分光光度计。
1.2 方法
1.2.1 肉样的处理 取猪后臀尖为样品，将购买的
新鲜猪肉直接切割成 200 g，随机分成 9 份，用 PE
塑料保鲜膜封住，贴上标签，在 4℃条件下，避光
冷藏。每份分为 3 组，分别在标签上标记Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ。
其中Ⅰ组用于 TVB-N 的测定，Ⅱ组用于平板计数培
养，Ⅲ组用于实时定量 PCR 检测。
1.2.2 TVB-N 的测定 TVB-N 具有挥发性，在测定
时遇到弱碱性溶液即可以游离而被蒸馏出来，蒸馏
出来的氨被 H3BO3 吸收，生成（NH4）2B4O7。使吸
收液从酸性变为碱性，混合指示剂由紫色变为绿色，
然后用盐酸标准溶液滴定，使混合指示剂再由绿色
变为蓝绿色即为滴定终点。然后根据盐酸标准溶液
的消耗量计算 TVB-N 含量［11］。
1.2.3 微生物指标的检测 将 4℃条件下冷藏的猪
肉放置在超净工作台中并在酒精灯火焰上将表面灼
烧 2-3 s，用高压灭菌的剪刀随机剪取猪肉 50 g 左右，
放入已使用酒精棉消毒的无菌绞肉机中绞碎 2 次，
无菌称取 25 g 转移到装有 225 mL 生理盐水的灭菌
三角瓶中，摇匀，必要时可在漩涡震荡器上进行震
荡混匀，然后对样品依次进行 10 倍梯度稀释，选取
适当的梯度进行细菌培养，每组 3 个平行。细菌的
计数按照国标进行。
1.2.3.1 菌 落 总 数 参 照 GB4789.2-2010《 食 品 安
全国家标准食品微生物学检验菌落总数》［12］，假单
胞杆菌属需氧型革兰阴性菌，是腐败猪肉中的优势
菌［9］，另外还有大肠杆菌等需氧菌，所以用平板计
数法培养。但也存在少量的乳酸菌等厌氧菌，培养
时易镶嵌在培养基底层或内部，均计入结果。
1.2.3.2 假单胞杆菌 选用假单胞选择性培养基
（PSA）进行平板培养法，并计数［13］。
1.2.4 DNA 提取方法 丙酮 - 氯仿快速提取法，参
照文献［14］。
2015,31(6) 89宋艳敏等：利用实时定量 PCR快速检测冷鲜猪肉新鲜度指标的方法研究
1.2.5 实时定量 PCR 标准曲线的制作
1.2.5.1 提取假单胞菌的 DNA 将标准铜绿假单胞
菌接种于 LB 溶液中培养 12 h，使其增殖，浑浊可使
用提取 DNA。提取前将菌液混匀，无菌枪小心吸取
1 mL 液体于无菌离心管中，8 000 r/min 离心 10 min，
再加入 1 mL 菌液，8 000 r/min 离心 10 min，收集沉淀。
1.2.5.2 进 行 实 时 定 量 PCR 测 定 提 取 DNA 浓
度，用水稀释调整 DNA 浓度到 20 ng/μL，保证 CT
值 在 18-30 之 间， 进 行 10 倍 梯 度 稀 释 4 次， 得
到 10 倍 梯 度 的 样 液。 细 菌 的 16S rRNA 基 因 具
有 高 度 的 保 守 性， 不 同 科、 属、 种 间 的 同 源 性
达 97%［15，16］。 采 用 细 菌 通 用 引 物 usu 对 提 取 的
DNA 样品进行 PCR 扩增，总细菌引物序列［17］为
usu-F ：5-AACTGGAGGAAGGTGGGGA-3 ；usu-R ：
5-AGGAGGTGATCCAACCGCA-3。产物片段长度为
370 bp，反应体系为 ：2.5×SYBR Green Mix 2 11.25
μL，usu-F（10 μmol/L） 和 usu-R（10 μmol/L） 各
0.3 μL，模板 DNA 5.0 μL，超纯水 13.15 μL。实时定
量 PCR 反应条件为 ：95℃ 5 min ；94℃ 30 s，55℃ 1
min，72℃ 1 min，共 30 个循环。
1.2.5.3 标准曲线制作 以 Lg（起始拷贝数 /g）为
横坐标，以 CT 值为纵坐标，制作标准曲线。
1.2.6 定量 PCR 检测 用丙酮氯仿快速提取法提取
猪肉中细菌基因组 DNA，-20℃储藏备用并对肉中提
取的 DNA 进行定量检测，根据标准曲线的范围可以
适当调整模板浓度。将测定的 CT 值带入标准曲线中，
即可得到对应的 DNA 的浓度，再计算得出起始拷贝
数（即初始细菌总数）。同时用国标法测定 TVB-N
含量，每天测一次，3 次平行测定，求平均值。
2 结果
2.1 微生物生长与TVB-N变化之间的关系
图 1 显 示， 随 着 冷 鲜 肉 储 藏 时 间 的 延 长，
TVB-N 和菌落总数均呈现上升趋势，表明 TVB-N 和
菌落总数均与猪肉的腐败程度正相关。根据图 2 菌
落总数与 TVB-N 之间的线性关系可看出，微生物
的菌落总数与 TVB-N 线性相关，线性方程式为 ：
y=3.4750x-3.0954，R2=0.9636。
2.2 猪肉中细菌DNA的提取结果
图 3 中显示，丙酮 - 氯仿法提取的冷鲜肉中
细菌 DNA 条带清晰，没有杂条带，紫外分光光度
计测定的 260 nm 和 280 nm 光波下的紫外吸收值为
1.754±0.145，提取效果比较好，可以用于后续实验。
14
12
10
8
6
4
2
0
1 2 3 4ᰦ䰤d㧼㩭ᙫᮠlgCFU
g
TV
B
-N
ਜ਼䟿mg100 g
5 6 7 8
0
5
10
15
20
25
菌落总数
TVB-N
图 1 冷鲜猪肉挥发性盐基氮（TVB-N）和菌落总数的变化
㧼㩭ᙫᮠlgCFUg
20
y=3.4750x3.0954
R2=0.963618
16
14
12
10
8
6
4
2
0
0 1 2 3 4 5 6 7
TV
B
-N
mg/100 g
图 2 菌落总数和 TVB-N 的关系
M CK1 2
M ：DNA Marker ；1，2 ：提取的细菌 DNA ；CK ：空白对照
图 3 冷鲜猪肉 DNA 提取结果
2.3 实时定量PCR的标准曲线制作
熔解曲线是用来验证以 SYBR Green Ⅰ为荧光染
料的定量 PCR 扩增的特异性，图 4 显示，细菌通用
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.690
引物 usu 扩增 PCR 产物的熔解曲线峰值为 87.98℃，
峰型锐利，熔解温度较为均匀。说明本研究所使用
的引物扩增产物有较强的特异性。利用已知起始浓
度的假单胞杆菌 DNA 标准品，经实时定量 PCR 反
应得到有关 CT 值与细菌 DNA 质量关系的标准曲线
方程。使用 dsDNA copy number calculator 软件，将
测 得 的 细 菌 DNA 质 量 转 化 为 Lg（ 目 的 基 因 拷 贝
数 /g）得到 CT 值与 Lg（起始拷贝数 /g）的标准曲线，
曲线方程为 CT=-3.372 Lg（起始拷贝数 / g）+41.000，
R2=0.999。
2.4 实时定量PCR测定猪肉腐败过程中DNA含量
实验结果
将冷鲜肉腐败过程中测得的 CT 结果记入表 1，
实时定量 PCR 得到的熔解曲线和扩增曲线，如图 5
0.000001
403836343230282624222018
Cycle
Amplification Plot
ΔR
n
16141210864
65.0
0.05
0.10
0.15
0.20
0.25
0.35
Melt Curve
0.30
D
er
iv
ah
e
R
ep
or
le
r/
75.0 85.0 95.090.080.070.0
Temperature/ć Tm:87.87
2
0.00001
0.0001
0.001
0.01
0.1
A B
C
15.0
0.0001 0.001
Quantity
Standard Curve
0.002 0.02 0.20.1 1 2 345 10 20 30 1000.01
17.5
27.5
25.0
20.0
22.5C
T
30.0
A ：扩增曲线图 ；B ：熔解曲线图 ；C ：标准曲线
图 4 标准曲线实时定量 PCR 检测结果
表 1 CT 值（x
-±s，n=3）
实验次数
时间 /d
1 2 3 4 6 7 8 9
1 27.6±0.03 27.6±0.01 26.1±0.20 25.9±0.05 22.9±0.07 24.8±0.13 21.9±0.06 20.3±0.07
2 27.9±0.01 28.8±0.02 22.8±1.21 22.8±0.11 21.9±0.08 22.3±0.11 21.9±0.09 20.1±0.12
3 27.3±0.02 27.9±0.04 24.9±0.08 21.8±0.11 24.5±0.16 21.4±0.42 22.9±0.01 19.95±0.0
平均 27.6±0.30 28.1±0.78 24.6±0.08 23.5±0.03 23.1±0.02 23.1±0.19 22.2±0.62 20.1±0.18
注 ：s ：标准偏差 ；x
-
平均值 ；n 实验次数，下同
所示。
图 5 与表 1 结合可以看出，随着储藏时间的延
长 CT 呈现减小的趋势，而根据标准曲线 CT 与起始
拷贝数的对数成负相关，可以判断细菌 DNA 起始拷
贝数逐渐增加，并能够得到细菌 DNA 起始拷贝数的
具体数值，由此看出实时定量 PCR 可以判断冷鲜肉
是趋向腐败的，同时与 TVB-N 和平板法检测的菌落
总数进行比较，结果见表 2。
2015,31(6) 91宋艳敏等：利用实时定量 PCR快速检测冷鲜猪肉新鲜度指标的方法研究
在 TVB-N 一致的情况下，运用 SPSS 软件对表
2 中数据进行单因素方差分析比较两者间差异，结
果显示，P=0.7190 >> 0.05，表明传统法测得细菌菌
落总数与实时定量 PCR 方法测得细菌 DNA 起始拷
贝数（即为初始菌落数）之间无显著性差异，并且
两者在数量级上一致。
3 讨论
肉品新鲜度通常用 TVB-N 含量来评价，TVB-N
的产生是指动物性产品的蛋白质在酶和微生物的作
用下分解产生氨和胺类等碱性含氮物质，微生物是
导致 TVB-N 产生的因素之一［18］。微生物的增殖是
肉品质产生安全问题的本质因素，微生物侵染肉品
后大量繁殖，消耗分解肉中的蛋白质、脂类和糖类
等营养成分导致的，会产生不悦风味，品质下降
并可能产毒，对食用者造成危害。Tang 等［19］预测
冷鲜猪肉货架期时发现，当微生物的数量达到 107
CFU/g 时的猪肉已经变成了腐败肉。但是传统微生
物指标检测方法耗时长，操作繁琐，受环境因素影
响较大。而实时定量 PCR 作为一种生物检测技术已
应用到鱼肉和牛肉的新鲜度检测方面［20，21］，该方法
检测速度快，灵敏性高且特异性好，成功克服了传
统平板培养法的缺点。猪肉同鱼肉和牛肉有很多相
似之处，它们水分多、营养物质丰富，都是一种高
度易腐的产品。Margot 等［22］和 Delibato 等［23］用实
时定量 PCR 检测猪肉中沙门氏菌的数量，结果精确
度高，并且可以确定沙门氏菌检测限量。Ye 等［24］
利用反转录定量 PCR 检测冷鲜猪肉中的单增李斯特
菌，结果可以粗略地预测猪肉的污染程度。
目前研究中利用实时定量 PCR 技术仅对牛肉
和鱼肉等其他肉品的新鲜度进行评价，或只对猪肉
中的特定微生物进行定性和定量检测，并没有对冷
鲜猪肉新鲜度指标进行评价。本研究在已有研究的
基础上进一步拓展了研究范围，主要以超市的冷鲜
猪肉为研究对象，应用实时定量 PCR 技术检测冷鲜
肉的细菌总数，既达到了定量的目的又避免了传统
方法繁琐耗时的缺点，而且检测灵敏度高，所以通
过实时定量 PCR 方法代替平板培养法对冷鲜猪肉的
新鲜度、微生物指标进行评定是可行的。并且定量
PCR 技术可应用到未来肉制品及其他方面的检测中，
也可以深入研究确定冷鲜肉新鲜度指标的检测限量。
本研究主要针对冷鲜猪肉展开实验研究，预实验中
对生产加工单位和超市的冷鲜肉都做了研究，最后
考虑到食品安全受众问题，选择超市冷鲜肉作为研
究材料，在后续的研究中会将该方法应用到食品生
65.0
0.05
0.15
0.25 Melt Curve
0.20
0.10
D
er
iv
at
iv
e
R
ep
or
te
r/-Rn˃
70.0 75.0 80.0 85.0 90.0 95.0
Tm:87.73
Temperature/ć
A
0.000001
2 4 6 8 10 12 14 16 18 20
Cycle
22 24 26 28 30 32 34 36 38 40
0.00001
0.0001
0.001ΔR
n
0.01
Amplifcation Plot
0.1
B
A ：冷鲜猪肉腐败过程细菌的熔解曲线图 ；B ：冷鲜猪肉腐败过程细菌的扩增曲线
图 5 冷鲜猪肉腐败过程细菌 DNA 的定量检测结果
表 2 TVB-N 的量和 Log10（细菌菌落总数）、Log10（目的基因拷贝数 /g 湿重）（x
-
±s，n=3）
时间 /d
1 2 3 4 5 6 7 8
TVB-N 8.31±0.00 8.64±0.40 8.47±0.83 11.6±1.52 13.2±2.59 16.7±2.74 19.1±1.60 18.4±1.17
菌落数 3.27±0.15 4.26±0.32 4.18±0.19 4.19±0.04 5.04±0.54 5.36±0.19 6.28±0.29 6.33±0.29
拷贝数 3.97±0.09 3.82±0.20 4.86±0.49 5.18±0.63 5.31±0.38 5.44±0.55 5.56±0.18 6.17±0.04
注 ：传统平板计数结果单位 ：Log10（CFU/g 湿重）；定量检测结果单位 ：Log10（起始拷贝数 /g 湿重）
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.692
产厂家的安全监督检测中。
4 结论
本研究验证了微生物菌落总数与 TVB-N 呈线性
相关性，因此可以根据细菌菌落总数的数量级确定
判断冷鲜肉新鲜度。将用传统平板计数法测得的菌
落总数与实时定量 PCR 方法得到的初始拷贝数进行
对照发现，在 TVB-N 相近的条件下，传统方法测得
的细菌菌落总数与实时定量 PCR 法测定的初始拷贝
数在数量级上是一致的。但实时定量 PCR 检测时间
短，灵敏度高，缩短了实验周期，降低了实验成本。
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（责任编辑 马鑫）