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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2012年第5期
收稿日期 : 2011-09-27
基金项目 : 高等学校博士学科点专项科研基金项目（20070023093）, 国家自然科学基金项目（30701012）, 天津市自然科学基金项目（07JCZ-
DJC04900）
作者简介 : 代晓华 , 女 , 硕士 , 助理研究员 , 研究方向 : 肿瘤药理 ; E-mail: jstonehome@163.com
通讯作者 : 周圆 , 女 , 硕士生导师 , 副研究员 , 研究方向 : 肿瘤药理 ; E-mail: yuanzhou@ihcams.ac.cn
人生存素 survivin的克隆与分泌表达
代晓华1, 2 姜琳琳1 程昕1 纪庆1 朱惠芳1 熊冬生1 周圆1
（1 中国医学科学院北京协和医学院 血液病医院（血液学研究所）实验血液学国家重点实验室，天津 300020 ；
2 天津市口腔医院暨南开大学附属口腔医院实验研究中心，天津 300041）
摘 要： 旨在克隆人生存素（survivin）基因，并在原核系统中进行可溶性表达。采用 RT-PCR方法从人乳腺癌细胞 MCF-7中克
隆 survivin基因，将其重组到 pAYZ表达载体中，构建带有六聚组氨酸纯化标记的人 survivin基因原核表达载体 pAYZ-survivin，将该
载体转化大肠杆菌 16C9进行表达。结果表明，成功克隆了 survivin基因并构建了重组表达载体。融合蛋白主要以可溶性状态分泌
到周质腔内存在。分离提取蛋白，HiTrap金属螯合柱进行亲和层析纯化，并经Western blot验证了高纯度 survivin融合蛋白的表达。
关键词： 生物医学工程 生存素 分泌表达 大肠杆菌 凋亡
Cloning and Secretory Expression of Recombinant Human
Survivin Gene
Dai Xiaohua1, 2 Jiang Linlin1 Cheng Xin1 Ji Qing1 Zhu Huifang1 Xiong Dongsheng1 Zhou Yuan1
（1State Key Laboratory of Experimental Hematology，Institute of Hematology and Blood Diseases Hospital，Chinese Academy of Medical
Sciences and Peking Union Medical College，Tianjin 300020；2Experimental Research Center，Tianjin Stomatological Hospital，Affiliated
Dental College of Nankai University，Tianjin 300041）
Abstract: It was to clone human survivin gene and express it in a dissolute way in the prokaryotic system. The full-length human survivin
gene was amplified from breast cancer cell line MCF-7 by RT-PCR, and then was cloned into pAYZ expression vector to construct the recombinat
pAYZ-survivin with 6×His-tag. Escherichia coli 16C9 were transformed with the recombinant vector. Results showed the recombinant survivin
protein was secreted into the periplasm of E.coli in a soluble form. After isolation and purification by HiTrap Chelating column, western blot
analysis was performed to confirm the soluble expression of the recombinant protein.
Key words: Biomedical engineerin Survivin Secretory expression Escherichia coli Apoptosis
细胞凋亡是化疗和放疗介导杀伤肿瘤细胞的主
要机制，肿瘤细胞的凋亡抑制与其发生发展以及对
放化疗的耐受密切相关。凋亡抑制蛋白（inhibitor of
apoptosis protein，IAP）家族作为凋亡通路的重要调
节者，能够抑制凋亡终末效应器 caspase 的活化，从
而阻断各种刺激诱导的细胞凋亡过程。Survivin 是
IAP 家族的重要成员，同时具有抑制细胞凋亡和调
节细胞分裂的双重功能［1］。Survivin 由 142 个氨基
酸组成，是 IAP 家族中结构最简单的蛋白分子，只
有一个杆状病毒 IAP 重复序列，并具有高度的保守
性［2］。Survivin 选择性表达在 G2/M 期，具有细胞周
期特异性［3］，survivin 的这种周期依赖性表达以及
其抗凋亡作用将有助于突变的细胞逃离 G2/M 检查
点而达到无限增殖，从而促进肿瘤的发生。还有研
究表明，survivin 参与了肿瘤血管新生以及多药耐
药的发生［4, 5］。survivin 也是一种肿瘤特异性的凋亡
抑制因子［6］，所有分化成熟的组织几乎都检测不到
survivin 的表达。研究证实，在全球近 400 万的基因
转录表达分析中，survivin 基因是肿瘤组织中表达上
调最为普遍的基因。基于以上特点，survivin 已经成
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为抗肿瘤药物研究的一个重要靶点。除了目前研究
较多的反义核酸，核酶，siRNA，针对 survivin 蛋白
的小分子抑制剂也是靶向抑制 survivin 药物的重要
发展方向之一［7］。纯化的靶蛋白的获得是能够高效
在体外进行药物筛选的关键步骤，因此本研究通过
克隆 survivin 基因，并在原核表达系统中高效稳定
表达可溶性的 survivin 蛋白，旨在为靶向 survivin 抑
制剂的筛选和研究奠定方法学基础。
1 材料与方法
1.1 材料
原核表达载体 pAYZ，大肠杆菌 DH5α 和 16C9
均由本实验室构建和保存。人乳腺癌细胞 MCF-7 由
本室常规保存，用含 10% 胎牛血清的 RPMI-1640 培
养液于 37℃、5% CO2、饱和湿度条件下传代培养。
DNA 纯化试剂盒与质粒提取试剂盒购自北京赛百盛
基因技术公司。DNA 聚合酶、T4 连接酶及限制性内
切酶 MluⅠ和 SphⅠ购自大连宝生物公司。HiTrap
亲和层析柱购自美国 GE 公司。Trizol 及 M-MLV 逆
转录试剂盒购自 Invitrogen 公司。
1.2 方法
1.2.1 引物设计 从 GenBank 中检索人 survivin 的
cDNA 序列（HM625836），再用 DNASIS 2.5 计算机
软件辅助设计扩增 survivin 序列的上游引物和下游
引物。在下游引物 SphⅠ酶切位点和 survivin 序列之
间加入 6 个组氨酸序列。引物由上海英骏生物技术
有限公司合成。
离心 15 min。弃上清，加入 1 mL 75% 乙醇洗涤，4℃，
10 000 r/min 离心 10 min。弃上清，取适量 DEPC 水
溶解沉淀，紫外分光光度计定量。取 1 μg 总 RNA，
按照 M-MLV 说明书要求混合逆转录反应体系，37℃
孵育 1 h，然后置于 72℃水浴 5 min 终止反应。
1.2.3 基因的扩增、酶切与回收 以上述获取的
MCF-7 细胞的 cDNA 为模板扩增 survivin 基因，PCR
扩增程序为 ：94℃ 40 s，56℃ 40 s，72℃ 1 min，30
个循环。PCR 扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，使用
凝胶回收试剂盒纯化回收 PCR 产物。扩增培养并提
取 pAYZ 载体质粒。将扩增的 survivin 基因用 MluⅠ
和 SphⅠ双酶切，经琼脂糖凝胶电泳分离纯化回收
目的片段。pAYZ 载体经相同酶切处理，凝胶回收大
片段。
1.2.4 重组人 survivin 表达载体的构建 将纯化回收
的 pAYZ 载体大片段与 survivin 目的片段按 1 5 的比
例用 T4 连接酶，16℃水浴连接过夜。连接产物转化
感受态大肠杆菌 DH5α，转化后的感受态细菌涂布
于氨苄青霉素抗性的软琼脂半固体培养基，37℃培
养过夜，筛选出重组克隆质粒，并进行菌液的 PCR
及重组质粒的双酶切鉴定后测序，形成 survivin 重
组表达载体 pAYZ-survivin。
1.2.5 Survivin 融合蛋白的表达与纯化 将测序正确
的质粒 pAYZ-survivin 转化大肠杆菌 16C9，挑取单
菌落接种于含氨苄青霉素（100 mg/L）的 2×YT 培
养基中，37℃，250 r/min，振荡培养过夜。然后移
入 500 mL 含氨苄青霉素 （100 mg/L） 的 2×YT 培养
基，37℃，250 r/min，振荡培养 8 h。在低温高速离
心机上 4℃，8 000 r/min 离心 10 min 收集菌体。将
菌体重新悬于 1 000 mL 含 100 μg/mL 氨苄青霉素的
AP5 培养基，30℃，250 r/min，振荡培养 24 h。收
集菌体，加入 50 mL 细菌周质腔蛋白提取液，振荡
混匀，置于 4℃轻摇 1 h 后，12 000 r/min，4℃离心
20 min，收集上清为表达产物的粗提物。上清液经
PBS 透析 24 h，0.45 μm 微孔滤膜除去沉淀后，上样
于抗 His-tag 亲和层析柱，以含有 20 mmol/L 咪唑的
结合缓冲液和含 500 mmol/L 咪唑的洗脱缓冲液梯度
洗脱，快速蛋白层析仪（FPLC）收集蛋白洗脱峰峰。
蛋白峰洗脱液用 PBS 置换，并用 Milipore 公司的浓
缩柱浓缩蛋白，分装后保存于 -20℃。
表 1 survivin表达载体引物设计
引物 序列（5-3） 酶切位点
上游
下游
GCGCACGCGTACGCTGGTGCCCCGACG
TTGCCCCCT
GCGCGCATGCTCAGTGGTGGTGGTG
GTGGTGCGACCCTCCGCCACCATCCA
TGGCAGCCAGCTGC
MluⅠ
SphⅠ
下划线为酶切位点，粗体部分为下游引物中六聚组氨酸序列
1.2.2 细胞总 RNA 提取和逆转录 取对数生长期
MCF-7 细胞 5×106 加入 1 mL Trizol，混匀，室温放置
5 min，加入氯仿 0.2 mL，混匀，室温放置 3-5 min。
4℃，12 000 r/min 离心 15 min，取上清加入 0.5 mL
异丙醇，室温放置 10 min，然后 4℃，12 000 r/min
2012年第5期 91代晓华等 ：人生存素 survivin 的克隆与分泌表达
1.2.6 Western blot 分析 Western blot 分析纯化结
果，取透析后样品进行 15% SDS-PAGE 凝胶电泳，
电泳完毕后，用半干电转仪将胶上的蛋白转到硝酸
纤维素膜上，恒流转膜 5 h。转膜结束后，5% 脱脂
奶 4℃封闭过夜，次日用抗 His-tag 抗体进行杂交，
室温温和摇动 2 h，PBS 洗 3 次，加入连接有 HRP
的二抗室温温和摇动 2 h，DAB 显色。
2 结果
2.1 Survivin基因的克隆与重组pAYZ-survivin表达
载体的构建
以 MCF-7 细胞的 cDNA 作为模板，PCR 扩增
survivin 基因，在基因片段的两端分别引入 MluⅠ和
SphⅠ酶切位点，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分离
后，在分子量约 480 bp 处可见一条特异性扩增带，
与预期分子量相同（图 1-A）。扩增产物用 MluⅠ和
SphⅠ进行酶切，并与经 MluⅠ和 SphⅠ酶切的表
达载体 pAYZ 连接，构建成 pAYZ-survivin 重组表达
载体（图 1-B）。
2.3 人survivin融合蛋白在大肠杆菌中的分泌表达
与分离纯化
含有表达载体 pAYZ-survivin 的 E. coli 16C9 在
2×YT 培养基中培养至 OD600 约为 0.6 时，转接 AP5
低磷酸盐培养基进行诱导表达，表达产物用细菌周
质腔蛋白提取液提取，经 PBS 透析后，于 HiTrap 金
属螯合柱纯化表达产物，纯化的融合蛋白以可溶性
状态存在。经 15% 的 SDS-PAGE 分离和 Western blot
后，在分子量约 17 kD 处呈现一蛋白条带（图 3），
与 survivin 融合蛋白理论计算值相符。
1.DNA 分子量标准 ；2.PCR 扩增产物
图 1 Survivin基因的克隆（A）和 pAYZ-survivin
重组载体的构建（B）
2.2 重组载体的鉴定
挑取涂布转化后 DH5α 的软琼脂平板上的单
菌落为模板，以 survivin 引物进行 PCR 扩增鉴定，
结果（图 2-A）显示 PCR 扩增产物可见分子量约
480 bp 的条带。挑取 PCR 阳性克隆提取质粒，经
MluⅠ和 SphⅠ酶切，琼脂糖凝胶电泳分离后，可
见一条分子量约 480 bp 的条带（图 2-B），与预期
相符。双脱氧末端终止法测序结果显示，克隆的
人 survivin 基因与 GenBank 中已知基因序列相同
（HM625836）。
A：PCR 鉴定，1. DNA 分子量标准，2-4. pAYZ-survivin 质粒的 PCR 扩增产物；
B ：MluⅠ和 SphⅠ酶切鉴定，1. DNA 分子量标准，2-5. pAYZ-survivin 经
MluⅠ和 SphⅠ双酶切，6. pAYZ-survivin 经 MluⅠ单酶切，7. pAYZ-survivin
经 SphⅠ单酶切，8. pAYZ-survivin 酶切前，9. pAYZ 酶切前
图 2 重组质粒 pAYZ-survivin的鉴定
1. 蛋白预染 Marker ；2. 纯化的 survivin 蛋白
图 3 Western blot检测纯化后的 survivin融合蛋白
3 讨论
Survivin 是迄今为止发现的最强的凋亡抑制因子
之一，与 bcl-2 抑制只能提高细胞对凋亡的敏感性相
比，抑制 survivin 不但能够增加肿瘤细胞对放化疗的
敏感性，还能够诱导肿瘤细胞发生自发凋亡。由于
survivin 是近年发现的新靶点，对其结构特点的研究
以及抑制剂的筛选还在不断进行中。本研究正是基
于此类研究的需要，在原核表达系统中获得稳定高
效的 survivin 融合蛋白的分泌表达，为其奠定了方法
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学基础。
近年来，随着基因工程技术的不断开发与应用，
先后有研究者利用大肠杆菌表达系统对 survivin 蛋白
进行了表达，但其表达产物多为胞浆内不溶的无功
能的包涵体，尚需要经过变性、复性等过程的摸索
及处理，使其成为有功能的可溶性蛋白。本室构建
的 pAYZ 表达载体上包含碱性磷酸酶启动子（phoA）
和信号肽 stII，是一种分泌型表达载体。当含有
pAYZ-survivin 重组载体的宿主菌在 2×YT 培养基中
生长到一定程度，转接于 AP5 低磷酸盐诱导培养基，
其 phoA 能在低磷酸盐诱导下合成 mRNA，并在该
mRNA 的 SD 序列位置合成带有 6×His-tag 纯化标志
的人 survivin 蛋白，该蛋白在信号肽 stII 的引导下，
分泌到细菌外周质腔中。细菌周质腔是一个氧化的
环境，且在周质腔中有许多有助于蛋白质折叠交联
的分子伴侣样分子以及二硫键异构酶存在，从而有
利于蛋白折叠成正确的空间构象，以有活性的可溶
状态存在。应用高渗溶液提取细菌外周质腔表达产
物，经抗 His-tag 柱亲和层析纯化，获得较高纯度的
survivin 重组蛋白。此种以分泌形式表达外源蛋白，
可避免细菌蛋白酶对外源蛋白的降解，降低外源蛋
白对宿主细胞的毒性作用，提高外源蛋白的表达量。
4 结论
本研究利用 DNA 重组技术，从人乳腺癌耐药细
胞系 MCF-7 细胞中成功克隆了人 survivin 基因，并
在原核表达系统内进行了高效稳定的表达，表达产
物以可溶性分泌形式存在，避免了表达产物纯化时
变性和复性等问题。并通过进一步分离纯化，获得
了高纯度的 survivin 融合蛋白，为靶向 survivin 药物
的体外筛选奠定了药理模型基础，同时也能够用于
survivin 蛋白的结构生物学研究及 survivin 抗体制备
等，在肿瘤的早期诊断与靶向抗肿瘤治疗中具有良
好的应用前景。
参 考 文 献
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（责任编辑 马鑫）