全 文 ：中国药房 2015年第26卷第25期 China Pharmacy 2015 Vol. 26 No. 25
＊主治医师。研究方向：呼吸临床、呼吸危重症。E-mail：guan9
yi@126.com
肺癌是严重威胁人类生存健康的杀手之一，目前化疗是
治疗肺癌的主要手段，但其副作用较大，在杀灭肿瘤细胞的同
时对正常组织也有损伤，而中药抗肿瘤治疗历史悠久，且安全
低毒[1]。藤梨根是猕猴桃科植物猕猴桃的根，研究表明藤梨根
乙酸乙酯提取物对癌细胞凋亡有一定诱导作用，而生存素
（Survivin）是一种重要的凋亡抑制因子[2]。基于此，笔者研究
藤梨根乙酸乙酯提取物对肺癌A549细胞凋亡的诱导作用及
对Survivin蛋白表达的影响，以为临床应用提供试验依据。
1 材料
1.1 仪器
801型形态学分析系统（江苏捷达科技发展有限公司）；
EpicsXL型流式细胞仪（美国Beckman Coulter公司）。
1.2 药材
藤梨根购自青海省西宁市第一人民医院中药房，由笔者
鉴定为真品。
1.3 药品与试剂
5-氟尿嘧啶（5-FU）注射液（上海旭东海普药业有限公司，
批号：20130824，规格：10 ml ∶ 0.25 g）；鼠抗人 Survivin单克隆
抗体、细胞免疫组化试剂盒（北京中山生物技术有限公司）；细
胞周期测试盒（南京凯基生物发展有限公司）；Annexin
Ⅴ-FITC/碘化丙啶（PI）凋亡测试盒（北京庄盟国际生物基因科
技有限公司）；RPMI 1640培养基、小牛血清（美国 Gibco公
司）；溴化乙锭、胰蛋白酶（美国 Sigma公司）；青霉素-链霉素
（美国Amresco公司）。
1.4 细胞
A549细胞由中南大学湘雅医学院细胞中心提供。
2 方法[3-4]
2.1 藤梨根乙酸乙酯提取物的制备
将藤梨根500 g粉碎成20目的粗粉，加8倍水煮2次，每次
1 h，滤过浓缩后加入乙酸乙酯溶剂萃取3次（每次300 ml），回
收溶剂，得浓缩物约25 g，用蒸馏水热溶滤过后取滤液供试验
用，含量为92.6％。
2.2 细胞培养与分组
在含10％小牛血清、青霉素及链霉素各100 u/ml的RPMI
1640培养基中培养A549细胞，培养环境控制在37℃、5％CO2
饱和湿度条件下，以0.25％胰蛋白酶消化传代，培养细胞至对
藤梨根乙酸乙酯提取物对肺癌A549细胞凋亡的诱导作用
关 英＊，阿选德（西宁市第一人民医院呼吸内科，西宁 810000）
中图分类号 R285 文献标志码 A 文章编号 1001-0408（2015）25-3499-03
DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2015.25.15
摘 要 目的：研究藤梨根乙酸乙酯提取物对肺癌A549细胞凋亡的诱导作用。方法：以0（阴性对照）、40、80、160 μg/ml藤梨根乙
酸乙酯提取物培养细胞48、72 h后，凝胶电泳法测定细胞DNA裂解情况。以0（阴性对照）、40、80、160 μg/ml藤梨根乙酸乙酯提取
物培养细胞24、48、72 h后，流式细胞仪测定细胞凋亡和细胞周期分布情况；免疫组化法测定细胞生存素（Survivin）表达。结果：
40、80、160 μg/ml藤梨根乙酸乙酯提取物培养细胞48、72 h后出现凋亡细胞特有的梯状条带；与阴性对照比较，40、80、160 μg/ml藤
梨根乙酸乙酯提取物培养细胞 24、48、72 h后细胞凋亡率升高，G0/G1期细胞比例升高，Survivin表达减弱，且呈时间、浓度依赖关
系。结论：藤梨根乙酸乙酯提取物可诱导A549细胞凋亡，将细胞周期阻滞于G0/G1期，其机制可能与降低Survivin表达有关。
关键词 肺癌A549细胞；藤梨根乙酸乙酯提取物；生存素；诱导凋亡
Induction of Ethyl Acetate Extract from Actinidia arguta on Apoptosis of Lung Cancer A549 Cells
GUAN Ying，A Xuan-de（Dept. of Respiration Medicine，Xining First People’s Hospital，Xining 810000，China）
ABSTRACT OBJECTIVE：To study the induction of ethyl acetate extract from Actinidia arguta on apoptosis of lung cancer
A549 cells. METHODS：After the cells were cultured in 0（negative control）40，80 and 160 μg/ml ethyl acetate extract from A. ar-
guta for 48 and 72 h，gel electrophoresis method was used to detect DNA cleavage in the cells. After the cells were cultured in 0
（negative control），40，80 and 160 μg/ml ethyl acetate extract from A. arguta for 24，48 and 72 h，flow cytometry was adopted to
detect apoptosis and cell cycle distribution，and immunohistochemical method was employed to detect Survivin expression. RE-
SULTS：After 48 and 72 h culture in 40，80 and 160 μg/ml ethyl acetate extract from A. arguta，ladders appeared，which are the
characteristic of apoptosis. Compared to the negative control，following 24，48 and 72 h culture of cells in 40，80 and 160 μg/ml
ethyl acetate extract from A. arguta，apoptosis rate was higher，also was the percentage of the cells in G0/G1 phase；and the expres-
sion of Survivin was weaker，demonstrating a time and concentration-dependent relation. CONCLUSIONS：The ethyl acetate ex-
tract from A. arguta can induce apoptosis of A549 cells and cause a cell cycle arrest in G0/G1 phase，by a mechanism which may be
related to the reduction in Survivin expression.
KEYWORDS Lung cancer A549 cells；Ethyl acetate extract from Actinidia arguta ；Survivin；Apoptosis induction
··3499
China Pharmacy 2015 Vol. 26 No. 25 中国药房 2015年第26卷第25期
图1 细胞凋亡流式细胞仪测定结果
A.阴性对照；B. 5-FU；C. 40 μg/ml藤梨根乙酸乙酯提取物；D. 80 μg/ml
藤梨根乙酸乙酯提取物；E. 160 μg/ml藤梨根乙酸乙酯提取物
Fig 1 Determination results of cell apoptosis by the flow cy-
tometry
A. negative control；B. 5-FU；C. ethyl acetate extract from A. arguta of
40 μg/ml；D. ethyl acetate extract from A. arguta of 80 μg/ml；E. ethyl
acetate extract from A. arguta of 160 μg/ml
1 000
500
11 500 1 000
AnnexinⅤ-FITC
A
P
I
1 500 1 000
AnnexinⅤ-FITC
B
P
I
1 500 1 000
AnnexinⅤ-FITC
C
P
I
1 500 1 000
AnnexinⅤ-FITC
D
P
I
1 500 1 000
AnnexinⅤ-FITC
E
P
I
1 000
500
1
1 000
500
1
1 000
500
1
1 000
500
1
数生长期用于后续试验。
2.3 细胞DNA梯状条带测定
以DNA琼脂糖凝胶电泳法检测裂解片段。取对数生长期
细胞，调整细胞密度至5.0×105 ml－1，接种于25 ml培养瓶中，每
瓶 3 ml RPMI 1640培养基。培养 24 h后更换培养液，以 40、
80、160 μg/ml藤梨根乙酸乙酯提取物与 5 μg/ml 5-FU培养细
胞 48、72 h，分别收集 2 ml细胞液，利用DNA琼脂糖凝胶电泳
检测细胞DNA梯状条带。
2.4 细胞凋亡率测定
取对数生长期细胞，接种于6孔板中，调整细胞密度至105
ml－1。以0（阴性对照）、40、80、160 μg/ml藤梨根乙酸乙酯提取
物与 5 μg/ml 5-FU培养细胞 24、48、72 h，弃上清液，以磷酸盐
缓冲液（PBS）清洗细胞 1次，用 0.25％胰蛋白酶消化，收集
0.2～1 ml细胞液，加入 500 μl Buffer缓冲液后再加入 5 μl An-
nexinⅤ-FITC、10 μl PI，混匀，室温下避光反应 15 min，1 h内
进行流式细胞仪检测。
2.5 细胞周期分布测定
取对数生长期细胞，接种于6孔板中，调整细胞密度至5×
104 ml－1。以 0（阴性对照）、40、80、160 μg/ml藤梨根乙酸乙酯
提取物与 5 μg/ml 5-Fu培养细胞 24、48、72 h，弃上清液，用
0.25％胰蛋白酶消化调整细胞密度至 1×106 ml－1，用 70％冷乙
醇500 μl固定1 ml单细胞悬液，常规离心，弃上清液，4℃下保
存12 h。以PBS洗去固定液，在100 μl RnaseA 37℃下水浴30
min，再加入400 μl PI染色混匀，4℃条件下避光保存30 min后
检测细胞周期分布。
2.6 Survivin表达测定
免疫组化法测定Survivin表达。取对数生长期细胞，接种
于 6孔板中，调整细胞密度至 105 ml－1。以 0（阴性对照）、40、
80、160 μg/ml藤梨根乙酸乙酯提取物与 5 μg/ml 5-FU培养细
胞24、48、72 h，弃上清液，以PBS清洗细胞1次，用0.25％的胰
蛋白酶消化，收集1×105～5×105 ml－1。以细胞免疫组化试剂盒
测定Survivin表达，阳性反应为细胞质内可见黄色或棕黄色颗
粒，在高倍视野（×400）下观察，由形态分析系统进行分析，选
取4个视野进行阳性率测定。
2.7 统计学方法
采用 SPSS 15.0软件处理试验数据。各组数据均为计量
资料，数据以x±s表示，采用 LSD检验进行分析。P＜0.05为
差异有统计学意义。
3 结果
3.1 细胞DNA梯状条带测定结果
通过DNA琼脂糖凝胶电泳检测后，阴性对照细胞中未发
现明显DNA梯状条带。以 40、80、160 μg/ml藤梨根乙酸乙酯
提取物与 5 μg/ml 5-FU培养细胞 48、72 h后，均发现凋亡细胞
所特有的DNA梯状条带，表明藤梨根乙酸乙酯提取物对于
A549细胞的DNA裂解有一定作用。
3.2 细胞凋亡率测定结果
与阴性对照比较，40、80、160 μg/ml藤梨根乙酸乙酯提取
物与 5 μg/ml 5-FU培养细胞 24、48、72 h后，细胞凋亡率升高，
差异有统计学意义（P＜0.05）。细胞凋亡率测定结果见图 1、
表1。
3.3 细胞周期分布测定结果
表1 细胞凋亡率与Survivin表达测定结果（x±s，n＝3）
Tab 1 Determination results of cell apoptosis and Survivin
protein expression（x±s，n＝3）
组别
藤梨根乙酸
乙酯提取物
5-FU
质量浓度，
μg/ml
0（阴性
对照）
40
80
160
5
不同时间点凋亡率，％
24 h
2.05±0.44
9.42±1.88＊
13.73±2.33＊
24.37±3.52＊
12.11±1.46＊
48 h
2.53±0.66
13.46±3.21＊
32.34±4.44＊
40.68±4.12＊
22.78±2.89＊
72 h
2.81±0.65
28.43±4.31＊
44.28±3.82＊
53.27±4.31＊
33.12±3.72＊ 23.45±1.46＊
不同时间点Survivin表达，％
24 h
34.77±1.93
28.72±2.63＊
24.15±3.11＊
16.43±1.89＊
48 h
35.75±2.17
22.63±2.79＊
19.36±3.44＊
11.89±1.72＊
16.45±2.41＊
72 h
35.63±3.03
15.63±3.82＊
10.32±2.43＊
5.98±1.98＊
13.21±1.47＊
注：与阴性对照比较，＊P＜0.05
Note：vs. negative control，＊P＜0.05
40、80、160 μg/ml藤梨根乙酸乙酯提取物与 5 μg/ml 5-FU
培养细胞24、48、72 h后，可使细胞滞留于G0/G1期，与阴性对照
比较，G0/G1期细胞数增加，S期细胞增加，G2/M期细胞减少，差
异有统计学意义（P＜0.05）。细胞周期测定结果见图2、表2。
3.4 Survivin表达测定结果
与阴性对照比较，40、80、160 μg/ml藤梨根乙酸乙酯提取
··3500
中国药房 2015年第26卷第25期 China Pharmacy 2015 Vol. 26 No. 25
表2 细胞周期测定结果（％，x±s，n＝3）
Tab 2 Determination results of cell cycles（％，x±s，n＝3）
组别
藤梨根乙酸乙酯提取物
5-Fu
质量浓度，μg/ml
0（阴性对照）
40
80
160
5
G0/G1
50.1±2.41
67.8±4.76＊
71.4±3.45＊
64.6±3.46＊
88.6±3.75＊
S
19.4±1.57
10.5±0.72＊
11.6±1.32＊
12.5±0.61＊
1.96±0.71＊
G2/M
26.5±1.46
15.4±1.65＊
13.7±0.82＊
16.4±1.11＊
5.9±1.54＊
注：与阴性对照比较，＊P＜0.05
Note：vs. negative control，＊P＜0.05
物与5 μg/ml 5-FU培养细胞24、48、72 h后，Survivin表达减弱，
差异有统计学意义（P＜0.05）；且随质量浓度的增加和作用时间
的延长，其表达逐渐减弱。Survivin表达测定结果见表1。
4 讨论
藤梨根学名猕猴桃根，为猕猴桃科植物猕猴桃的干燥根，
其乙酸乙酯提取物具有增强细胞免疫和抑制体液免疫的作
用，一般用作治疗腹部肿瘤的清热解毒药；另外因其在促进淋
巴细胞转化和增强自然杀伤（NK）细胞活性上有一定作用，现
多应用在治疗胃肠道癌症中[5]。
本研究显示，藤梨根乙酸乙酯提取物作用于A549细胞
后，通过DNA琼脂糖凝胶电泳检测裂解片段，阴性对照未出现
明显的DNA梯状条带，而用药培养细胞后，都出现了相应的
DNA条带，说明在藤梨根乙酸乙酯提取物作用下，A549细胞
出现裂解。细胞周期测定显示，用其培养细胞后，细胞周期阻
滞在G0/G1期，且随药物质量浓度增加，处于G0/G1期的A549细
胞比例增加。在不同的藤梨根乙酸乙酯提取物质量浓度下，
免疫组化法检测显示阴性对照细胞凋亡率明显低于用药细
胞。细胞凋亡受多种基因控制的，早有研究表明Survivin是凋
亡抑制蛋白家族新成员，是具有抑制细胞凋亡和调节细胞分
裂的双功能蛋白[6-9]。本研究显示，用药培养细胞后，Survivin
蛋白表达明显降低，因此藤梨根乙酸乙酯提取物诱导A549细
胞凋亡的机制可能与降低Survivin蛋白表达有关[10]。
综上所述，藤梨根乙酸乙酯提取物对于A549细胞凋亡具
有一定的诱导作用，且在一定范围内呈浓度和时间依赖性，其
机制可能与降低Survivin表达有关。本研究为藤梨根乙酸乙
酯提取物应用于临床治疗肺腺癌提供了一定依据。
参考文献
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2015，32（1）：14.
（收稿日期：2015-04-01 修回日期：2015-06-03）
（编辑：张 静）
图2 细胞周期流式细胞仪测定结果
A.阴性对照；B. 5-FU；C. 40 μg/ml藤梨根乙酸乙酯提取物；D. 80 μg/ml
藤梨根乙酸乙酯提取物；E. 160 μg/ml藤梨根乙酸乙酯提取物
Fig 2 Determination results of cell cycles by the flow cytom-
etry
A. negative control；B. 5-FU；C. ethyl acetate extract from A. arguta of
40 μg/ml；D. ethyl acetate extract from A. arguta of 80 μg/ml；E. ethyl ac-
etate extract from A. arguta of 160 μg/ml
252
1
0 512 1 024
DNA含量
A
细
胞
计
数
252
1
0 512 1 024
DNA含量
B
252
1
0 512 1 024
DNA含量
C
252
1
0 512 1 024
DNA含量
D
252
10 512 1 024
DNA含量
E
细
胞
计
数
细
胞
计
数
细
胞
计
数
细
胞
计
数
··3501