全 文 ：免疫学杂志 2012 年 7 月 第 28 卷 第 7 期 IMMUNOLOGICAL JOURNAL Vol. 28 No. 7 Jul. 2012
雪胆素甲(Cucurbitacin IIa, CuIIa)是从葫芦科雪
胆属植物中提取出来的一种四环三萜类天然产物，具
有良好的抗菌消炎、清热解毒的作用 [1]。 研究表明，
CuIIa 对于肿瘤细胞的增殖与扩散具有明显的抑制
作用[2]。 像葫芦素家族的其他成员一样，CuIIa可能通
过破坏肌动蛋白(actin)细胞骨架、诱导细胞周期阻滞
等机制发挥其药理作用[2-4]。虽然含有 CuIIa的药物雪
胆素片或雪胆提取物具有抗炎镇痛的效果[5-6]，但其抗
炎免疫调节作用的机制尚不清楚，相关研究也未见报
道。 本研究以 LPS活化的 RAW 264.7巨噬细胞系为
模型， 研究 CuIIa 对 RAW 264.7 的增殖和凋亡的影
响，探讨其潜在的抗炎效应和可能的作用机制。
1 材料与方法
1.1 实验材料 雪胆素甲(纯度 98%)购自于广东省药
·论 著· [文章编号]1000-8861（2012）07-0553-05
雪胆素甲通过破坏微丝结构诱导 LPS活化的 RAW264.7细胞凋亡
何 健，徐丽慧，乔 静，欧阳东云，何贤辉 *
[摘 要] 目的 分析雪胆素甲(CuIIa)对脂多糖(LPS)活化的 RAW264.7巨噬细胞的影响，探讨其潜在的抗炎效应及作用机制。
方法 MTS法检测 CuIIa对 RAW264.7细胞增殖的作用， 相差显微镜观察 CuIIa对 LPS活化的细胞形态的影响， 荧光显微镜观察
CuIIa对细胞骨架的影响，流式细胞仪检测亚二倍体(凋亡)峰的变化，免疫印迹检测 Cleaved caspase-3、生存素以及 G-actin 与 F-
actin的变化。 结果 CuIIa能明显抑制 RAW264.7细胞的增殖， 并呈时间和剂量依赖性， 但单独 CuIIa 不能有效诱导细胞凋亡。
CuIIa使 LPS活化的伸展细胞收缩变圆，伪足突起消失，G-actin水平下降，细胞内发生严重的 Actin聚集，说明微丝结构被破坏。随
着 CuIIa 浓度的增加，其诱导 LPS 活化的 RAW264.7 细胞处于 sub-G0/G1(凋亡峰)的数量明显增加。 免疫印迹分析显示 CuIIa 使
Caspase-3明显活化，生存素急剧下降。 结论 CuIIa可能通过引起 Actin聚集而破坏微丝细胞骨架，诱导 LPS活化的 RAW264.7细
胞发生凋亡，从而发挥其抗炎效应。
[关键词] 雪胆素甲； RAW264.7； 细胞凋亡； 生存素； 微丝
[中图分类号] R392.12 [文献标识码] A
Cucurbitacin IIa induces apoptosis of LPS-stimulated RAW264.7 cells through
disrupting microfilament cytoskeleton
HE Jian, XULihui, QIAO Jing, OUYANGDongyun, HE Xianhui
Department of Immunobiology, College of Life Science and Technology, Ji’nan University, Guangzhou 510630, China
[Abstract ] This study aimed to explore the potential anti- inflammatory activity and underlying action
mechanism of cucurbitacin IIa (CuIIa) by using lipopolysaccharide (LPS)-activated RAW264.7 macrophages as a
model. The effect of CuIIa on cell proliferation was measured by MTS assay. Phase contrast microscopy was used to
observe the morphology changes of cells while immunofluorescence staining was adopted to examine actin
cytoskeleton. Sub-G0/G1 (apoptotic) peak was identified by flow cytometry. Immunoblotting was used to evaluate the levels
of cleaved capase-3, survivin, G-actin and F-actin. Our results showed that CuIIa inhibited the proliferation of
RAW264.7 cells in a time- and dose-dependent manner, but CuIIa alone could not effectively induce apoptosis. CuIIa
treatment caused cell shrinkage and disappearance of pseudopodia protrusions of LPS-activated cells, and led to
significant G -actin decrease and dramatic actin aggregation within cells, which indicating a disruption of
microfilament structures. The hypodiploid peaks (apoptotic peaks) were increased in LPS-activated RAW264.7 cells
treated with increased doses of CuIIa. Immunoblotting analysis revealed that CuIIa significantly induced the
activation of caspase -3 and decreased survivin expression. All the result demonstrated that CuIIa can induces
apoptosis in LPS-activated RAW264.7 cells through aggregating actin and disrupting microfilament cytoskeleton, thus
exhibits its anti-inflammatory activity.
[Key words] Cucurbitacin IIa; RAW264.7; Apoptosis; Survivin; Microfilament
基金项目：国家自然科学基金(81173604)；中央高校基本科研业务费
专项资金(21609403)
作者单位：510630广州， 暨南大学生命科学技术学院免疫生物学系
组织移植与免疫实验中心
*通信作者：何贤辉，Tel：020-85220679，E-mail：thexh@jnu.edu.cn
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DOI:10.13431/j.cnki.immunol.j.20120129
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品检定所。 脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)、碘化丙锭
(propidium iodide，PI)和二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide，
DMSO)购自 Sigma-Aldrich公司。 DMED培养基、胎牛
血清和 L-谷氨酰胺购自 Gibco/Invitrogen 公司 。
Cleaved caspase-3、survivin 和 β-actin 特异性抗体来
自 Cell Signaling Technologies 公司。 CuIIa 用 DMSO
配制成 0.02 mol/L 的储存液-20 ℃保存，使用时用培
养基稀释至工作液浓度。
1.2 MTS法检测细胞增殖 细胞以 1×104/ml 种于 96
孔板内，每孔 100 μl，置于 37 ℃，5% CO2的培养箱内
培养 24 h，使其贴壁。 然后用含有不同浓度 CuIIa的
完全培养基作用 24 h和 48 h， 每个浓度设置 3个复
孔。 之后每孔加入 20 μl MTS，37 ℃孵育 0~4 h，每隔
1 h用酶标仪在 490 nm波长下测量吸光值(A490 nm)。空
白组只含有培养基而无细胞。增殖率=(实验组 A490 nm-
空白 A490 nm)/(对照组 A490 nm-空白 A490 nm)×100。实验重复
3次，绘制细胞增殖曲线。
1.3 流式细胞仪分析 用含有 1 μg/ml LPS 的完全培
养基配制不同浓度的 CuIIa工作液， 处理细胞 24 h，
收集细胞于离心管中，离心(300 g，10 min)去上清，重
复 1次。亚二倍体分析按前文报道方法进行[7]，简述如
下：收集的细胞固定后，加入 PI 染液(含 50 μg/ml PI
和 30 μg/ml RNase A 的 PBS溶液)， 置于 37 ℃避光
孵育 1 h，上 FACS Calibur流式细胞仪(BD公司)进行
分析，每个样品至少收集 20 000个细胞的参数。
1.4 倒置相差显微镜观察细胞形态 细胞以 4×104/孔
种于 6 孔板中， 分别以 2.5 μmol/L 和 10 μmol/L 的
CuIIa 处理经 LPS(1 μg/ml)激活的细胞，24 h 后显微
镜下观察细胞的形态变化，拍照记录细胞图像。
1.5 细胞免疫荧光观察 细胞以 1.5×104/孔种于 35 mm
玻璃底细胞培养皿内，药物处理 24 h。弃培养液，4%
多聚甲醛固定 15 min，PBS 洗 3 次 ， 冰冷的甲醇
于-20 ℃通透 10 min，PBS洗涤， 封闭液封闭 1 h后
加入抗 β-actin一抗，4 ℃反应过夜，洗涤后加入 CF-
488A 标记的二抗，避光反应 1 h，以 Leica DMIRB 荧
光显微镜观察和记录荧光图像。
1.6 G-actin和 F-actin的抽提 按前文[8]报道方法进
行，简述如下，培养细胞以 G-actin 抽提液 (含 0.2%
Triton X-100)抽提球状肌动蛋白(G-actin)，残余部分
以 2×SDS-PAGE上样液裂解获得含纤维状肌动蛋白
(F-actin)的样品，按以下方法进行免疫印迹分析。
1.7 免疫印迹分析 按前文报道方法进行 [7]，简述如
下：RAW264.7 细胞按 4×105/孔种于 6 孔板中， 用含
有 LPS(1 μg/ml)的完全培养液配制浓度为 2.5 μmol/L、
10 μmol/L 和 40 μmol/L 的 CuIIa 工作液， 处理细胞
24 h，提取总蛋白，定量分析，以 SDS-PAGE电泳分离
蛋白，将蛋白转移到 PVDF膜上，以特异性抗体进行免
疫印迹显色，X光片显影成像，FluorChem 8000 (美国
AlphaInnotech)成像仪记录结果并以 AlphaEaseFC。 软
件分析结果。
1.8 统计学分析 数据以均数±标准差形式表示，用
Graphpad Prism 4.0进行单因素方差分析，P ＜ 0.05为
差异显著，有统计学意义。
2 结果
2.1 CuIIa 对 RAW264.7 细胞增殖和细胞周期的影
响 如图 1a 所示，不同浓度的 CuIIa 处理 RAW264.7
细胞，以 MTS法测定细胞活性，结果显示 CuIIa 以时
间和剂量依赖方式抑制 RAW264.7 细胞增殖， 作用
24 h和 48 h的 IC50分别为 (122.32±39.78) μmol/L和
(6.42±0.28) μmol/L。 虽然 CuIIa单独对 RAW264.7细
n=3; ﹡﹡P＜0.01, vs control group; ﹡P＜0.05, vs control group.
a) Effect of different concentrations of CuIIa on the proliferation of
RAW264.7 macrophage cells; b) Cell cycle distribution in RAW264.7
cells after treatment with CuIIa for 24 h.
图 1 CuIIa对 RAW264.7巨噬细胞增殖和细胞周期的影响
Fig 1 Effects of CuIIa on the proliferation and cell cycle
distribution of RAW264.7 macrophage cells
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胞增殖具有剂量依赖性抑制作用，但并不能有效诱导
细胞凋亡(图 1b)，因此在以下的实验中，不再对 CuIIa
单独作用进行分析。
2.2 CuIIa对 LPS活化的 RAW264.7细胞形态的影
响 相差显微镜观察显示，未刺激的 RAW264.7 细胞
部分伸展呈上皮样，较多的细胞呈圆形，而经 LPS
(1 μg/ml) 刺激 24 h后细胞伸展爬开呈现成纤维样，
增殖速度加快。 LPS刺激同时加入 CuIIa处理 24 h，
细胞明显收缩变圆，增殖减慢，10 μmol/L CuIIa 处理
组细胞碎裂，呈现凋亡状(图 2)。
2.3 CuIIa诱导 G-actin减少并促进细胞内 Actin聚
集 研究表明，CuIIa能够破坏肿瘤细胞的 Actin细胞
骨架，诱导 Actin聚集，这可能是该药物的抗肿瘤作用
的重要机制之一[2]。 Actin细胞骨架又称微丝，也称为纤
维形肌动蛋白(F-actin)，是由球形肌动蛋白(G-actin)单
体聚合形成的多聚体， 两者在细胞内处于动态平衡之
中。 免疫印迹结果显示，与对照细胞相比，RAW 264.7
细胞在 CuIIa(20 μmol/L)作用 1 h 后，其 G-actin 水平
明显下降，4 h和 24 h后虽然有所回升，但仍然低于对
照组细胞；同时 F-actin含量相应升高(图 3a)，提示发
生了 Actin聚集。 SDS-PAGE的结果显示， 药物作用
24 h后细胞内 Triton X-100不溶性 F-actin水平明显
升高。 进一步利用免疫荧光分析 Actin在细胞内的分
布，可见药物作用 24 h后，10 μmol/L的 CucIIa即可诱
导细胞内 Actin聚集，而高浓度 40 μmol/L的 CuIIa则
使 Actin聚集更为严重； 相反， 对照细胞和 LPS细胞
Actin呈正常分布， 其中 LPS刺激细胞有大量伪足突
起，其中 Actin分布相对较多(图 3b)。
2.4 CuIIa 对 RAW264.7 细胞凋亡和 G2/M 期的影
响 应用流式细胞术检测 sub-G0/G1峰(凋亡峰)细胞，
结果显示，LPS 刺激 24 h 后有少量细胞分布于凋亡
峰，而 LPS 加 CuIIa 组凋亡峰大大升高，并呈现剂量
依赖关系(图 4a，图 4b)，提示 CuIIa 促进 LPS 活化的
RAW 264.7细胞发生凋亡。 从细胞周期 G2/M期的统
计结果来看，CuIIa诱导 G2/M期阻滞(图 4c)。
2.5 CuIIa 促进 Caspase-3 的活化 Caspase 家族在
细胞凋亡过程中发挥重要作用 ， 其中活化的
Caspase-3发挥关键作用[9-10]。 免疫印迹结果显示，正
常对照组和 LPS 刺激组中没有检测到明显的活化
Caspase-3， 而 LPS活化细胞在不同浓度的 CuIIa 作
用 24 h后，与对照组和 LPS组相比，活化的 Caspase-
3 水平明显升高 (图 5)， 表明 CuIIa 诱导活化的
RAW264.6细胞凋亡依赖于 Caspase-3通路。
2.6 CuIIa 抑制 Survivin 的表达 Survivin 是凋亡抑
制蛋白家族中的一员，在调控细胞周期和抑制细胞凋
亡方面发挥重要作用[11-12]。免疫印迹分析显示，与对照
组相比，LPS 刺激组的 Survivin 表达无明显变化，但
CuIIa显著诱导 Survivin蛋白的下调， 并表现出剂量
依赖性 ，40 μmol/L CuIIa 处理组几乎检测不到
Survivin的表达(图 5)。
3 讨论
葫芦科雪胆属植物的块茎在民间被用来治疗肠
炎和菌痢等疾病，效果良好。 雪胆素甲(CuIIa)是从其
块茎中分离获得的有效成分之一，以往的研究揭示其
具有良好的抗肿瘤、抗炎镇咳等药理作用[2-4,6]。 但CuIIa
的抗炎作用机制尚未见报道。 巨噬细胞在固有免疫
和适应性免疫中均发挥着重要作用，参与多种组织的
炎症反应。LPS刺激的巨噬细胞在一定程度上模拟了
a) Control cells; b) Cells stimulated with LPS for 24 h; c) Cells treated
with LPS plus CuIIa (2.5 μmol/L) for 24 h; d) Cells treated with LPS plus
CuIIa (10 μmol/L) for 24 h. The concentration of LPS is 1 μg/ml.
图 2 CuIIa对 LPS活化的 RAW264.7巨噬细胞形态的影响
Fig 2 Effects of CuIIa on the morphology of LPS-activated
RAW264.7 macrophage cells
a) Immunoblotting analysis of G-actin levels in 20 μmol/L CuIIa-
treated cells. SDS -PAGE stained with Coomassie Brilliant Blue R250
(CBB). Arrow head indicates actin band (Mr 43 000). b) Immunofluorescence
staining of β-actin in CuIIa-treated cells stimulated with LPS (1 μg/ml) for
24 h. Arrows indicate large actin aggregates.
图 3 CuIIa对 RAW264.7微丝细胞骨架的影响
Fig 3 Effect of CuIIa on microfilament cytoskeleton of
RAW264.7 cells
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n=3; *P<0.01, vs control group；#P<0.05, vs LPS group；##P< 0.01, vs LPS group. a)Flow cytometry analysis of cell cycle; M1: sub-G0/G1 peak; M2:
G0/G1 phase; M3: S phase; M4: G2/M phase. b) Histograms of the percentages of sub-G0/G1. c)Histograms of the percentages of cells in G2/M phase.
图 4 CuIIa对 LPS刺激的 RAW264.7巨噬细胞凋亡和 G2/M期的影响
Fig 4 Effects of CuIIa on cell apoptosis of LPS-stimulated RAW 264.7
体内炎症反应过程， 常用于抗炎药物作用机制的研
究。 本研究以 LPS 活化的 RAW264.7 巨噬细胞系为
模型， 分析 CuIIa对巨噬细胞增殖和凋亡的影响，探
讨其潜在的抗炎作用机制。
CuIIa对 RAW 264.7的增殖具有明显抑制作用，
呈时间和剂量依赖的关系。 与葫芦素家族其他成员
不同的是 CuIIa 毒性相对较小，单独 CuIIa 药物作用
并不会诱导凋亡峰的出现，但可引起细胞周期阻滞于
G2/M期。 其它葫芦素类的天然产物如葫芦素 B也能
诱导细胞周期阻滞于 G2/M期，破坏正常的胞质分裂，
从而抑制细胞增殖[7]。 在肿瘤细胞中的研究表明，CuIIa
与其它葫芦素一样， 能快速诱导 Actin骨架的破坏，
导致 Actin聚集，因此发挥其抗肿瘤效应[2]。 我们不仅
观察到 CuIIa 可抑制 LPS 诱导的 RAW264.7 细胞的
活化和伪足突起的形成， 而且发现该药物可以诱导
G-actin的下降和 F-actin的聚集，严重破坏了细胞内
的正常微丝细胞骨架的结构和 Actin动力学。 这表明
CuIIa与其它葫芦素可能有相似的作用机制， 即通过
破坏 Actin细胞骨架结构而抑制细胞增殖，并导致细
胞周期的阻滞。
虽然 CuIIa单独不会诱导 RAW264.7细胞凋亡，
但是它能使 LPS 活化的细胞的凋亡峰大大升高，说
明能有效诱导活化的 RAW264.7细胞发生凋亡。进一
步的免疫印迹分析也证实了流式细胞仪的结果 ，
CuIIa 大大提高了细胞凋亡的执行蛋白酶 Caspase-3
的活化(Cleaved caspase-3 的产生)，表明 CuIIa 诱导
的细胞凋亡依赖于 Caspase-3 通路。 Caspase 家族是
一类进化上保守的蛋白，分为两类：起始 Caspase 和
效应 Caspase。 Caspase-3是细胞内效应 Caspase的一
员，其活化在细胞凋亡的过程中发挥关键作用 [13-14]。
Caspase-3 在正常细胞内以非活性的前体形式存在，
当其被起始 Caspase 如 Caspase-9 激活后，生成 2 个
亚单位的异二聚体。 这对于凋亡细胞的染色质凝集、
DNA片段和凋亡小体的形成是十分必要的[9, 15]。 另一
方面，CuIIa导致 Survivin的表达水平明显下降，这也
是诱导细胞凋亡的重要原因。 Survivin蛋白是凋亡抑
制因子家族的成员之一，它在胚胎发育和肿瘤细胞中
表达很高。 它是抗凋亡蛋白的一种，同时也是细胞周
期调控因子。 Survivin能与 Caspase-3结合，抑制后者
Cells were stimulated with LPS (1 μg/ml) in the absence or presence
of CuIIa for 24 h.
图 5 CuIIa对 LPS刺激的 RAW 264.7细胞 Caspase-3活化和
Survivin表达的影响
Fig 5 Effects of CuIIa on caspase-3 activation and survivin
expression in LPS-stimulated RAW 264.7 cells
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活化，阻止细胞凋亡[16]。 也有研究表明，Survivin可抑
制凋亡体的活化而影响 Caspase-3 的活性 [17]。 可见，
我们的结果表明，CuIIa 诱导 LPS 活化的 RAW264.7
细胞凋亡依赖于 Caspase-3 的活化，并与 Survivin 的
急剧下调密切相关。
CuIIa和葫芦素类其他化合物一样，能够以细胞
内骨架蛋白 Actin为靶标，诱导细胞内 F-actin聚集，
破坏细胞骨架， 从而影响细胞的多种活动。 例如，
CuIIa通过破坏细胞骨架来抑制肿瘤细胞的转移与扩
散[2]。 那么，CuIIa是如何通过破坏 LPS活化的RAW264.6
细胞骨架而诱导细胞凋亡呢？ 这一问题目前还缺少
更为直接的实验证据， 但我们可以推测，LPS活化的
细胞形态发生了巨大的变化，有大量伪足突起，其中
涉及微丝骨架的正确重构(reorganization)，而 CuIIa破
坏了 Actin 骨架结构，阻止了微丝骨架的重构，从而
激活了细胞凋亡通路。 但其中的确切机制还需要进
一步的研究和探索。
临床上使用雪胆素片 (主要成分为雪胆素甲和
乙)来治疗肠炎、菌痢等疾病，每日剂量为 6~30 mg。
我们的结果显示 10 μmol/L 的 CuIIa 即可发挥药理
作用，这是药物在体内可以达到的浓度范围。 与其他
抗炎药物不同的是，CuIIa并没有下调 LPS 活化的巨
噬细胞 RAW264.7炎症因子如 TNF-α的分泌 (数据
未显示)， 提示 CuIIa发挥抗炎作用并不是通过减少
炎症因子来实现的， 而可能是通过诱导活化的炎症
细胞发生凋亡等机制而发挥抗炎效应。
总之，CucIIa能够抑制 RAW264.7巨噬细胞的增
殖，并诱导 LPS活化的 RAW264.7 细胞凋亡，这可能
是 CuIIa发挥抗炎效应的一个机制。 我们推测 CuIIa
对 RAW264.7 细胞的影响最本质的原因是对细胞内
微丝细胞骨架的破坏作用。 但是，CuIIa 诱导活化
RAW264.7细胞凋亡的具体机制，尚需进一步的研究
阐明。
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(收稿日期：2012-03-13；修回日期：2012-05-05)
(编辑 汤玉瑜)
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