全 文 ：·研究报告· 2011年第12期
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN
收稿日期 ：2011-04-29
基金项目 ： 甘肃省教育厅科研项目（0902B-01），科技部科技人员服务企业行动项目（2009GJG10030），甘肃省生物技术专项（GSSW-2009-06），
甘肃省高校研究生导师科研项目（1002-04）
作者简介 ：王佳泰，女，硕士研究生，研究方向 ：动物遗传育种与繁殖 ；E-mail: wjiat1986@qq.com
通讯作者 ：罗玉柱，男，博士，教授，博导，研究方向 ：草食动物遗传育种 ；E-mail ：luoyz@gsau.edu.cn
河西绒山羊 GOLA-DRB1 基因第 2 外显子
变异特征分析
王佳泰1 王继卿1,2 胡江1,2 马小军2 罗玉柱1,2
（1甘肃农业大学动物科学技术学院，兰州 730070 ；2甘肃省草食动物生物技术重点实验室
研究测试中心，兰州 730070）
摘 要: 采用 PCR-SSCP、克隆测序等方法，分析 600 只河西绒山羊 GOLA-DRB1 基因第 2 外显子遗传特征、SNPs 变异类
型，同时分析该基因与山羊流产的关联性。结果表明，河西绒山羊 DRB1 基因第 2 外显子上存在 26 个等位基因，序列比对后发现
26 个等位基因中存在 71 个核苷酸变异位点，占分析位点总数的 30％。其中转换位点 25 个，占核苷酸多态位点的 35.21％ ；颠换
位点 35 个，占核苷酸多态位点的 49.3％ ；转换和颠换共存位点 9 个，占 12.68％。山羊流产关联性分析结果表明，在河西绒山羊
病例组中 DRB1*18、DRB1*23、DRB1*26 等位基因频率高于正常对照组（P<0.05），χ2 值分别为 6.31，4.859，6.396，RR 值为 2.55，
2.72，DRB1*8 等位基因频率显著高于正常对照组（P<0.01），χ2 值为 17.618，RR 值为 3.59 ；病例组中 DRB1*14 等位基因频率低
于正常对照组（P<0.05），χ2 值为 4.812，RR 值为 0.65，DRB1*1 和 DRB1*11 显著低于正常对照组（P<0.01），其中 B1 的 χ2 值和
RR 值分别为 14.11 和 0.61，初步推断 DRB1*8 可能是河西绒山羊流产发病单体型中的遗传易感基因，DRB1*1 和 DRB1*11 可能为
其遗传保护基因。
关键词: DRB1 基因 PCR-SSCP 流产 河西绒山羊
Variation of the GOLA-DRB1 Gene Exon 2 in Hexi Cashmere Goat
Wang Jiatai1 Wang Jiqing1,2 Hu Jiang1,2 Ma Xiaojun2 Luo Yuzhu1,2
（1Faculty of Animal Sci-tech Gansu Agricultural University，Lanzhou 730070 ；2 Gansu Key Laboratory of Herbivorous Animal Biotechnology，
Analysis and Research Center，Lanzhou 730070）
Abstract: The variation of gene GOLA-DRB1 exon 2 and the association of alleles with abortion resistance and susceptibility of Hexi
Cashmere Goat were genotyped using Polymerase Chain Reaction- Single Strand Conformational Polymorphism（PCR-SSCP）technology，
following by cloning，sequencing and sequence data analysis. 26 alleles were identified at gene GOLA-DRB1 exon 2. There were 71 single
nucleotide polymorphism sites. The polymorphism sites proportion of whole exon 2 sequence was 30%. All those DRB1 exon 2 alleles have not
been reported. There are 25 transition sites and 35 transversion sites，representing nucleotide polymorphism 49.3% and 35.21% respectively.
Goat abortion correlation analysis showed that Gene frequencies of DRB1*18, DRB1*23, DRB1*26 in abortion group were higher than those
of control group，and the difference had statistical significance（P<0.05），χ2=6.31，4.859 and 6.396，RR=2.55，2.728 respectively. Gene
frequencies of DRB1*8 were significantly higher than those in control group（P<0.01），χ2=17.618，RR=3.59. In contrast，DRB1*1 and
DRB1*11 allelic frequencies in abortion groups were significantly lower than those in control group and the difference had statistical significance
（P<0.01），χ2=14.11，RR=0.61. The alleles of DRB1*8 may be associated with susceptibility to abortion，while DRB1*1 and DRB1*11 may
be related to resistance of abortion.
Key words: DRB1 gene PCR-SSCP Abortion Hexi cashmere goat
河西绒山羊是中国固有的三大绒山羊品种之 一，也是甘肃省羊绒生产最重要的种质资源，主
2011年第12期 133
要分布于甘肃省河西走廊西北部的肃北蒙古族自
治县和肃南裕固族自治县。但流产严重影响着绒
山羊产业的发展，据课题组 2009-2010 年对肃北
县石宝城乡 20 845 只适繁母山羊的调查，河西绒
山羊平均流产率为 25.41%，最高可达 83.33%。尽
管加强饲养管理和使用药物疫苗等在防止流产中
发挥了重要的作用，但未能完全控制和消灭此病。
从遗传本质上看，提高家畜对病原的抗性具有治本
的功效。目前国际上采用分子抗病育种技术对部分
疾病开展选育收到良好的效果，如猪应激综合征、
奶牛乳房炎、绵羊腐蹄病（新西兰已进入商业化检
测阶段）等，但前提是找到有效的分子遗传标记。
主 要 组 织 相 容 性 复 合 体（major histocompatibility
complex，MHC）是由紧密连锁、高度多态的基因
座组成的染色体上一个与免疫应答和抗病性密切
相关的多基因复合体，MHC 的基因产物称为 MHC
抗原或 MHC 分子，是一类表达于细胞表面的脂蛋
白，主要与外来抗原相结合并将这些抗原递呈给 T
淋巴细胞，最终引起机体的免疫反应 [1,2] 。MHC 广
泛存在于脊椎动物中，其结构和功能彼此相似 [3-5]，
分 为 class Ⅰ、class Ⅱ 和 class Ⅲ 区。class Ⅱ 区
DR 基因家族与人和家畜的多种疾病存在强相关，
如人自然反复流产、牛乳房炎、绵羊的锥虫病、线
虫、包虫病等 [6-9]，因此 MHC 的 DR 基因家族成
为近年来家畜抗病育种标记辅助选择的重要基因
座 位。 山 羊 的 MHC 称 为 GOLA（goat lymphocyte
antigen），即山羊的白细胞抗原 [10]，其结构和功能
与牛、绵羊较相似，关于牛和绵羊 DR 的研究结
果已经证实，高度表达的 DRB 基因第 2 外显子是
MHC 中功能最重要的区域，其多态性最丰富 [11-13]。
但目前国内外山羊 GOLA 研究较少，且主要集中
在 DRB3 第 2 外显子上，说明山羊 DRB 多态性研
究还不够彻底，等位基因还未被完全发现，这明
显不利于揭示山羊流产的分子机理和开展山羊其
他一些疾病的抗病育种工作。因此，本研究采用
PCR-SSCP 方法检测河西绒山羊 DRB1 第二外显子
的遗传特征和 SNPs 变异类型，并初步进行山羊流
产关联性分析，以期为揭示山羊流产分子机理提供
基础素材。
1 材料与方法
1.1 材料
2009 年在甘肃省酒泉市肃北县石宝城乡采集
河西绒山羊基因组 DNA 600 份，其中正常个体 406
份，流产个体 194 份。羊只颈静脉采血 10 mL，加
入 ACD 抗凝，置于 -20℃冰箱冻存。
1.2 方法
1.2.1 基因组 DNA 的提取 用常规酚 - 氯仿抽提法
提取血液基因组 DNA[14] 。
1.2.2 引 物 设 计 和 PCR 扩 增 体 系 引 物 设 计 参
考 文 献 [15,16]。 应 用 巢 氏 PCR 方 法， 即 3 个 引
物 经 两 轮 PCR 扩 增 GOLA-DRBl 第 2 外 显 子， 目
的 片 段 大 小 为 285 bp。 引 物 序 列 如 下 ：DRB1.1，
5 -TATCCCGTCTCTGCAGCACATTTC-3 ，GIo，
5-CGTACCCAGAGTGAGTGAAGTATC-3，DRB1.2，
5-TCGCCGCTGCACACTGAAACTCTC-3。
第 一 轮 PCR 反 应 体 系 ：总 体 积 20 μL， 其 中
MgCl2 2.5 mmol/L，dNTPs 100 μmol/L， 引 物 DRB1.1
和 GIo 各 0.1 μmol/L，Taq 聚 合 酶 0.5U， 模 板 DNA
50 ng，ddH2O 补充体积至 20 μL ；反应程序 ：预变
性 94℃ 5 min，变性 94℃ 1 min，退火 60℃ 2 min，
延 伸 72 ℃ 2 min， 共 30 个 循 环， 最 后 延 伸 72 ℃
5 min。
第 二 轮 PCR 反 应 体 系 ：总 体 积 20 μL， 其 中
MgCl2 2.5 mmol/L，dNTPs 100 μmol/L， 引 物 DRB1.1
和 DRB1.2 各 0.1 μmol/L，Taq 聚 合 酶 0.5 U， 稀 释
10 倍后的第一轮 PCR 产物 1.0 μL，ddH2O 补充体积
至 20 μL ；反应程序 ：预变性 94℃ 5 min，变性 94℃
1 min，退火 60℃ 30 s，延伸 72℃ 30 s，共 25 个循环，
最后延伸 72℃ 5 min。PCR 产物用 1% 的琼脂糖凝胶
电泳检测。
1.2.3 PCR 产物的 SSCP 检测 取 2 μL 的 PCR 产物
加入 8 μL 的变性上样缓冲液（98% 去离子甲酰胺、
0.025% 溴酚蓝、0. 025% 二甲苯青、10 mmol/L EDTA
（pH 8. 0）），98 ℃变性 10 min，立即冰浴 5 min。变
性后的 PCR 产物上样于 12 % 的非变性聚丙烯酰胺
凝胶（Arc Bis = 37.5 1）上，以 250 V 电压、0.5×TBE，
在温控室和德国 Julabo 冷循环仪控温的 8℃条件下
电泳 20 h，银染法显色后拍照。
王佳泰等 ：河西绒山羊 GOLA-DRB1 基因第 2 外显子变异特征分析
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2011年第12期134
1.2.4 基因的克隆测序 从 SSCP 分析样品中，选
取不同等位基因个体的 PCR 产物用琼脂糖凝胶纯化
试剂盒回收纯化。回收后的片段用 PGEM-T Easy 载
体连接，构建重组质粒，并转化大肠杆菌 DH5α 菌
株。为确保测序菌液的正确性，同一等位基因的菌
液 PCR 扩增产物与原 PCR 产物 SSCP 分型比较后，
送至北京华大生物工程有限公司测序。
1.2.5 序列分析 用 Clustal X 软件对所测的河西绒
山羊 DRB1 基因第 2 外显子序列进行同源序列比对
分析 ；Dnasp 4.0 用于核苷酸变异位点分析。
1.2.6 统计学处理 基因频率按 Hardy-Weinberg 定
理计算，应用社会科学统计软件包 16.0 版本，用 χ2
检验分析各组间基因频率分布。当 P<0.05 时，依
Woolf 公式计算相对危险率（relative risk，RR）。
2 结果
2.1 PCR的扩增结果
经 1% 的琼脂糖凝胶电泳检测，在 200-500 bp
得到一条特异性的条带，片段大小与目的片段一致
（图 1），可直接进行 SSCP 分析。
2.2 PCR-SSCP检测结果
对 PCR 扩 增 产 物 进 行 SSCP 分 析， 结 果 在 所
检测的 600 只河西绒山羊中共发现 26 个等位基因，
分 别 命 名 为 GOLA-DRB1*01、GOLA-DRB1*02……
GOLA-DRB1*26，各等位基因的电泳条带从 1 条到 3
条不等，结果见图 2。
2011年第12期 135
2.3 DRB1基因第2外显子核苷酸位点变异与多态
性分析
对 600 只河西绒山羊 DRB1 基因第 2 外显子的
26 个等位基因进行克隆测序和序列比对，结果表
明，在 26 个等位基因中共发现 71 个核苷酸多态位
点，占分析位点总数的 30％（711237）。其中转换
位点 25 个，占核苷酸多态位点的 35.21％（25171），
包 括 G/A 的 转 换 位 点 12 个，T/C 的 转 换 位 点 13
个 ；颠换位点 35 个，占核苷酸多态位点的 49.3％
（35171）；转换和颠换共存位点 9 个，占 12.68％
（9171）（图 3）。本试验还发现 2 个缺失位点（33
位点和 113 位点）。
王佳泰等 ：河西绒山羊 GOLA-DRB1 基因第 2 外显子变异特征分析
图 3 DRB1 基因第 2 外显子等位基因核苷酸比对结果
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2011年第12期136
2.4 DRB1基因第2外显子频率与山羊流产相关性
分析
河西绒山羊 DRB1 基因第 2 外显子的等位基因
频率见表 1。结果表明等位基因 GOLA-DRB1*1 的
频率最高，其次是 DRB1*14，DRB1*5 和 DRB1*6，
分别为 19.42%，9.97%，7.70% 和 7.44% ；等位基因
DRB1*3，DRB1*18 和 DRB1*16 频率最低仅为 0.09%，
0.26% 和 0.52%。
在观测的有表型记录的 600 只河西绒山羊个体
中，正常个体 406 个，流产个体 194 个。相关性统
计分析结果表明，等位基因 DRB1*18 只存在于流产
个体中 ；等位基因 DRB1*3，DRB1*11 和 DRB1*16
只存在于正常个体中。病例组中等位基因 DRB1*1，
DRB1*5 和 DRB1*14 的 频 率 最 高， 频 率 分 别 为
14.33%，9.55% 和 7.58%。在对照组中，等位基因
DRB1*1 和 DRB1*14 频率较高，频率分别为 21.37%
和 11.05%。
经过 χ2 检验结果表明，病例组与对照组各基
因座位的基因频率分布，均符合 Hardy-Weinborg 平
衡定律。从表 1 中可看出，在河西绒山羊病例组中
DRB1*18、DRB1*23、DRB1*26 等位基因频率高于
正常对照组（P<0.05），χ2 值分别为 6.31，4.859，6.396，
RR 值为 2.55，2.72，DRB1*8 等位基因频率显著高
于正常对照组（P<0.01），χ2 值为 17.618，RR 值为 3.59；
病例组中 DRB1*14 等位基因频率低于正常对照组
（P<0.05），χ2 值为 4.812，RR 值为 0.65，DRB1*1 和
DRB1*11 显著低于正常对照组（P<0.01），其中 B1
的 χ2 值和 RR 值分别为 14.11 和 0.61，其余各等位
基因频率分布差异无显著性（P>0.05）。
表 1 DRB1 基因第 2 外显子等位基因频率
** 表示差异极显著 P ＜ 0.01 ；* 表示差异显著 P ＜ 0.05
等位基因 总频率 病例组（194） 对照组（406） χ2 P RR流产数量 基因频率 正常数量 基因频率
GOLA-DRB1*1 0.1942 51 0.1433 171 0.2173 14.11 <0.001** 0.61
GOLA-DRB1*2 0.0140 6 0.0169 10 0.0127 0.20 0.418 -
GOLA-DRB1*3 0.0009 0 0.0000 1 0.0013 0.48 0.677 -
GOLA-DRB1*4 0.0507 18 0.0506 40 0.0508 0.05 0.476 -
GOLA-DRB1*5 0.0770 34 0.0955 54 0.0686 1.87 0.107 -
GOLA-DRB1*6 0.0744 24 0.0674 61 0.0775 0.76 0.229 -
GOLA-DRB1*7 0.0542 22 0.0618 40 0.0508 0.314 0.335 -
GOLA-DRB1*8 0.0332 24 0.0674 14 0.0178 17.618 <0.001** 3.59
GOLA-DRB1*9 0.0647 19 0.0534 55 0.0699 1.581 0.13 -
GOLA-DRB1*10 0.0280 8 0.0225 24 0.0305 0.831 0.24 -
GOLA-DRB1*11 0.0219 0 0.0000 25 0.0318 12.465 <0.001** -
GOLA-DRB1*12 0.0131 5 0.0140 10 0.0127 0.007 0.565 -
GOLA-DRB1*13 0.0254 6 0.0169 23 0.0292 1.888 0.119 -
GOLA-DRB1*14 0.0997 27 0.0758 87 0.1105 4.812 0.017* 0.65
GOLA-DRB1*15 0.0472 22 0.0618 32 0.0407 1.917 0.11 -
GOLA-DRB1*16 0.0052 0 0.0000 6 0.0076 2.896 0.095 -
GOLA-DRB1*17 0.0070 2 0.0056 6 0.0076 0.199 0.492 -
GOLA-DRB1*18 0.0026 3 0.0084 0 0.0000 6.31 0.033* -
GOLA-DRB1*19 0.0105 5 0.0140 7 0.0089 0.488 0.339 -
GOLA-DRB1*20 0.0184 3 0.0084 18 0.0229 3.24 0.053 -
GOLA-DRB1*21 0.0149 5 0.0140 12 0.0152 0.068 0.513 -
GOLA-DRB1*22 0.0131 8 0.0225 7 0.0089 3.101 0.095 -
GOLA-DRB1*23 0.0175 11 0.0309 9 0.0114 4.859 0.028* 2.55
GOLA-DRB1*24 0.0350 15 0.0421 25 0.0318 0.523 0.288 -
GOLA-DRB1*25 0.0569 25 0.0702 40 0.0508 1.251 0.164 -
GOLA-DRB1*26 0.0201 13 0.0365 10 0.0127 6.396 0.013* 2.72
2011年第12期 137
3 讨论
3.1 MHC-DRB1基因外显子2多态性
河西绒山羊产区地形复杂，南部高山纵横，山
顶终年积雪，中部山峰与戈壁、沙漠、丘陵、山岗
穿插交错。产区为荒漠、半荒漠地带，属典型的大
陆性气候，这里海拔 1 400-5 564 m，草场有草甸
草原草场、半荒漠草场、荒漠草场等。本研究采用
PCR-SSCP 技术首次对河西绒山羊 DRB1 基因第 2 外
显子进行分析，结果在 600 只个体中发现了 26 个等
位基因及 71 个多态位点，表现为高度的多态性。这
主要与河西绒山羊常年生活在严酷环境下所具有的
适应性强、抗病性强有关。研究发现病原压力是造
成动物 MHC 基因高度多态的主要因素 [17-19]。动物
体只有具有多态的机体免疫系统才能适应前差外别
的外界环境，由于动物 MHC 起抗原呈递作用、与免
疫应答密切相关，因此作为主要编码 MHC 肽结合区
（Peptide-binding region，PBR） 的 DRB1 基 因 也 表
现为丰富的多态性。这可能是高等动物抵御恶劣环
境、从而维持种属生存与延续的一种需要 [4]。国内
外对山羊 DRB1 基因研究较少，目前只有 Amills 利
用 PCR-RFLP 技术在西班牙野生山羊群体发现了 6
个等位基因，多态性明显低于河西绒山羊可能与西
班牙野生山羊栖息地地理隔绝、缺乏基因交流及所
处高纬度地理环境有关。由于高纬度环境中病原体
的种类及其流行程度低，致使 MHC 基因面临的选择
压力也相应较小 [20]。
3.2 GOLA-DRB1基因与免疫性状的相关性分析
许多研究表明 MHC 与人类和家畜部分疾病的
易感性和抗性有关 [5,21]，它能诱导强排斥反应并参
与免疫调节。由于 MHC 基因已被证实与家畜多种
疾病存在强相关，因此成为家畜抗病育种的首选基
因标记 [21-23]。本试验结果表明 GLOA-DRB1 不同等
位基因个体对流产的易感性和抗性存在差异。在相
同的饲养管理及防疫条件下，在流产山羊个体中，
GOLA-DRB1 基因第 2 外显子的等位基因 B1，B5 和
B25 的频率最高，在正常个体中，等位基因 B1 和
B14 频率较高。 χ2 检验结果表明，在病例组中等位
基因 B18，B23，B26 基因频率显著高于正常对照
组（P<0.05），RR 值 分 别 为 2.55，2.72，DRB1-B8
等位基因频率显著高于正常对照组（P<0.01），χ2 值
为 17.618，RR 值为 3.59，初步推断 DRB1-B8 可能
是河西绒山羊流产发病单体型中的遗传易感基因 ；
病例组中 DRB1-B14 等位基因频率低于正常对照组
（P<0.05），χ2 值 为 4.812，RR 值 为 0.65，B1 和 B11
显著低于正常对照组（P<0.01），B11 只在正常个体
中发现，其中 B1 的 χ2 值和 RR 值分别为 14.11 和
0.61，可能对流产发病有保护作用。人类流产的研
究结果 [24-26] 中表明 HLA-DRB1 等位基因与人类不
明原因流产的抗性和易感性有关，尽管个体的基因
与抗体反应水平不是 100% 相符，但是群体的基因
差异与抗体或细胞应答水平却呈相关性，经选择的
MHC 单倍型通过繁殖能增强种群的抗病能力。通
过对 GOLA-DRB1 基因的多态性分析来确定 DRB1
等位基因与山羊流产抗病性的关系，进一步寻找具
有抗病性的遗传位点而最终进行抗病育种，这在预
防和控制疫病的流行和蔓延方面具有一定的现实意
义。然而，由于研究群体数量有限，这些等位基因
是否可以作为抗流产的遗传标记还需扩大样本量深
入研究。
4 结论
在 600 份河西绒山羊 GOLA-DRB1 基因第二外
显子中发现 26 个等位基因，全为首次发现，这 26
个等位基因中存在 72 个核苷酸变异位点，占分析
位点总数的 30％。其中转换位点 25 个，占核苷酸
多态位点的 34.72％ ；颠换位点 35 个，占 48.61％ ；
转换和颠换共存位点 9 个，占 12.5％，说明 GOLA-
DRB1 第二外显子有丰富多态性。山羊流产关联性
分析结果表明，GOLA-DRB1*08 可能与河西绒山羊
流产易感相关，GOLA-DRB1*01 和 GOLA-DRB1*11
可能与其抗性有关。
　
参 考 文 献
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（责任编辑 李楠）