全 文 ：研究报告
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2010年第 4期
PCRSSCP的效果分析
赵爽 潘秋丽 姜宫凌侠
(大连水产学院生命科学与技术学院,大连 116023)
摘 要: PCRSSCP是一种以 PCR为基础的单链构象多态性分析技术,是 DNA已知突变的检测或未知变异分析中常用
和实用的技术之一。影响 SSCP试验效果的因素有很多, 本研究主要对凝胶浓度和是否添加甘油两个因素进行分析与探讨。
结果表明, 凝胶浓度 12%和添加甘油终浓度 10%的条件下可以得到满意的结果。
关键词: 牙鲆 聚丙烯酰胺凝胶 PCRSSCP
EffectsAnalysis of PCRSSCP
Zhao Shuang Pan Q iu li JiangGonglingxia
(College of Life Science and B io technology, Dalian F isheries University, Dalian 116023)
Abstrac:t Po lym erase chain reactionsing le strand conforma tion po lym orphism ( PCRSSCP ) is an assay accord ing to the SSCP
from PCR produc tion on po ly acry lam ide ge l e lectrophoresis ( PAGE) , wh ich have been them ost w ide ly used and practica l approaches
for de tecting known or unknow n va riations o f DNA. The re are m any factors affecting the resu lts o f PCRSSCP. In th is study, ana lysis
and d iscussion w ere carried out on influentia l factors, inc luding gel s concentra tion and presence or absence of g lycero.l The resu lts
show ed that the optim al exper im ent cond itions w ere as fo llows, ge l s concentration of 12% and g lycero l s concentration of 10% .
Key words: P aralichthys olivaceus Po lyacry lam ide gel PCRSSCP
收稿日期: 20100113
作者简介:赵爽,女,在读研究生,研究方向:水产动物基因工程; Em ai:l xiu l iw ang417@ s ina. com
O rita等 [ 1]的研究发现, 单链 DNA片段呈复杂
的空间折叠构象,这种立体结构主要由其内部碱基
配对等分子内相互作用力维持。当有一个碱基发生
改变时,会或多或少地影响其空间构象,使构象发生
改变,空间构象有差异的单链 DNA分子在聚丙烯酰
胺凝胶中受排阻大小不同。因此, 通过非变性聚丙
烯酰胺凝胶电泳 ( PAGE ) , 可以敏锐地将构象上有
差异的分子分离开。他把此方法称之为单链构象多
态性 ( single strand conformation po lymorphism, SSCP)
分析。在随后的研究中, 该作者又将 SSCP用于检
查 PCR扩增产物的基因突变, 从而建立了 PCRSS
CP技术 [ 2]。它能快速有效地区分 DNA短片段中是
否存在单核苷酸突变, 包括单个碱基的转换、颠换、
插入和缺失等 [ 3]。
由于 PCRSSCP技术具有快速、简便、灵敏度高
及适用于大群体筛选等优点,因此,该方法已广泛用
于各类群体点突变的检测。另外, 该方法对实验室
条件要求不高,无需特殊设备,因而很容易被接受与
应用。但由于 PCRSSCP技术受 DNA的结构、凝胶
的浓度和电泳条件等众多因素的影响,在试验操作
时想得到清晰的结果,需要对各种因素进行分析并
采取对策。主要对凝胶浓度和是否添加甘油两个因
素进行了分析与探讨, 希望对该方法的选用提供
参考。
1 材料和方法
1. 1 材料
大连海域牙鲆群体 45尾, 取其肌肉组织加入
95%乙醇后放入 - 20! 冰箱中保存备用。
1. 2 基因组 DNA的提取
采用经典的酚、氯仿法 [ 4] , 以牙鲆肌肉组织为
材料提取牙鲆鱼的基因组 DNA , 得到的 DNA溶于
TE中,然后将 DNA溶液置 - 20! 冰箱中备用。
1. 3 引物设计及 PCR反应
根据 GenBank数据库中牙鲆的肌肉生长抑制
2010年第 4期 赵爽等: PCRSSCP的效果分析
素基因 (M STN)序列,用 Prim er 5软件设计引物。引
物序 列为 EF: TTCAGCAACCATTCATGGAG, ER:
GATACTTCTGCAAGTGCATG。扩增片段大小为 221
bp。引物由上海生物工程技术服务公司合成。 PCR
反应总体积为 25 L, 内含 2. 5 L的 10 ∀ buffer,
2 L的 dNTPs, 1 L的上游引物, 1 L的下游引物,
1 L的模板 DNA, 0. 2 L的 TaqDNA聚合酶。反应
在 AB I9700PCR仪上进行。 PCR反应条件为 94!
预变性 5 m in, 然后进行如下 30个循环: 94! 变性
30 s, 52! 退火 30 s, 72! 延伸 30 s, 最后 72! 延伸
7m in。PCR扩增的目的片段, 经 1. 5%琼脂糖凝胶
电泳鉴定。
1. 4 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳
按照表 1的配方进行配制 (如果不添加甘油,
用双蒸水配平 ), 将所有溶液混合后, 灌胶, 胶厚
1mm, 操作方法见文献 [ 5] ,室温下聚合 50 m in。
表 1 不同浓度非变性聚丙烯酰胺凝胶的配方
药品与试剂 浓度 (% )
8 10 12 15
30%丙烯酰胺溶液 ( 29#1) ( mL) 8 10 12 15
5∀ TBE (mL) 6 6 6 6
50%甘油 (mL ) 3 3 3 3
双蒸水 (m L) 13 11 9 6
10%过硫酸胺溶液 (L) 200 200 200 200
TEMED( L ) 15 15 15 15
总体积 (m L) 30 30 30 30
凝胶上样缓冲液: 98% 的去离子甲酰胺,
10mmo l/LEDTA ( pH8. 0 ), 0. 025% 的二甲苯氰,
0025%的溴酚蓝。在 5 L上样缓冲液中加入 2
L PCR扩增产物 (可根据 DNA的浓度调整 PCR上
样量 ) ,混匀后在 PCR仪上 98! 变性 10m in,取出立
即放入冰浴中, 以防止温度逐渐下降时的复性。
5- 10 m in后即可以按序上样。待凝胶完全凝好以
后即可上样。电泳缓冲液为 1 ∀TBE。在常温 ( 25!
左右 )下进行电泳, 110V预电泳 10m in, 120V电泳 8
- 15 h(凝胶浓度不同,电泳时间不同 )。
待溴酚蓝移至凝胶底部, 停止电泳。将胶侵入
10%乙醇固定 10m in,去离子水漂洗 3次,每次1m in,
0. 1% AgNO3染色 10- 15m in,去离子水漂洗 3次, 每
次不得超过 15 s, 然后用显色液 ( 2 g NaOH, 01 g
N a2CO3,双蒸水定容到 250mL, 再加入800 L甲醛 )
显色 [ 6] ,条带清晰即可停止。照相读取结果。
2 结果与分析
2. 1 PCR扩增产物结果
随机选取了 4尾牙鲆鱼个体进行 PCRSSCP的
影响因素分析。PCR扩增结果经 1. 5%琼脂糖凝胶
电泳检测 (图 1)。由图 1可知, PCR扩增片段与想要
得到的目的片段一致,条带清晰,未见有其它的杂带。
图 1 引物 E的 PCR扩增产物琼脂糖检测电泳图
2. 2 不同浓度聚丙烯酰胺凝胶检测结果
对随机选取的 4尾牙鲆鱼个体进行不同浓度的
聚丙烯酰胺凝胶电泳检测 (图 2)。从图 2可以看
出, 浓度为 12%的 PAGE胶条带较 8%和 10%的清
晰, 15%的 PAGE胶虽然条带很清晰但浓度较大, 电
泳时间过长,所以选择浓度为 12%的聚丙烯酰胺凝
胶最为合适。
2. 3 有无甘油的检测结果
从图 3中可以看出无甘油的 12%的 PAGE胶
条带并不清楚, 和图 2C (有甘油 )相比, 条带不整
齐, 带型特征也不明显。
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生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 4期
A- D.聚丙烯酰胺凝胶浓度分别为 8% , 10% , 12% , 15%
图 2 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳结果
图 3 浓度为 12%条件下无甘油的非变性聚丙烯酰
3 讨论
在其他条件相同的情况下,不同浓度的聚丙烯酰
胺凝胶对相同的 PCR产物进行电泳时会产生不同的
结果,条带相近的 PCR产物在高浓度的聚丙烯酰胺
凝胶电泳中条带更易压缩, 更易分开,而在低浓度的
聚丙烯酰胺凝胶电泳中占的体积大,条带较弥散, 不
易分开,不利于基因型的判断。另外,选用的凝胶浓
度与待测 DNA片段的长短也有关系,不同浓度的凝
胶有不同的检测范围, SSCP最适检测的 DNA片段在
300 bp以内,一般 DNA片段越长,凝胶浓度应越小。
姜运良等 [ 7 ]认为对于 100- 200 bp范围内的 DNA片
段,聚丙烯酰胺凝胶浓度为 10% - 15%较合适。通常
在 8% - 12%之间是大多数报道采用的浓度 [ 8]。
甘油是一种弱变性剂, 凝胶中是否添加甘油对
不同基因片段的 PCRSSCP分析有不同的效果。对
某些片段而言,甘油有助于其迁移,而对另外一些片
段则起抑制作用。有一些学者认为甘油的浓度在
5% - 10%时 SSCP分析的结果较好 [ 9] , 但有人发现
0%甘油也同样可以得到满意的结果 [ 10, 11 ] , 刘建佳
等 [ 12]认为在凝胶中添加甘油后单链 DNA泳动差异
缩小,条带难以分辨, 各等位基因型难以确定, 聚合
和电泳都需更长的时间,且凝胶易脱落、破损, 影响
SSCP的分析效果。本研究证实同等条件下添加终
浓度为 10%的甘油可以获得满意的结果。但是在
摸索其它引物的 PCRSSCP条件过程中发现有些引
物在 0%甘油条件下也可以得到满意的结果。所
以, 在 PCRSSCP分析过程中是否添加甘油应根据
实验时的具体情况进行调整。
目前,在用 PCRSSCP方法检测多态性的报道
中也有对凝胶浓度和甘油浓度的介绍, 薛良义等 [ 13]
在大黄鱼肌肉生长抑制素基因外显子 I遗传多态性
分析的文章中所用聚丙烯酰胺凝胶浓度为 12%; 倪
静等 [ 14]认为聚丙烯酰胺凝胶浓度为 14%, 甘油浓
度 0%可以得到清晰的条带; 严美娇等 [ 15]在两种东
方纯的 GH基因单核苷酸多态性分析的文章中介绍
的凝胶浓度为 12%,甘油浓度为 2%。
4 结论
经多次试验发现,在浓度为 12%的非变性聚丙
烯酰胺凝胶和添加终浓度为 10%的甘油条件下, 可
以得到相对满意的结果。当然, 由于不同实验室的
条件不同,得到的结果也有可能是不同的。
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(下转第 155页 )
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2010年第 4期 卢雪梅等:融合基因 M dchly的构建及原核表达
( DE3),经 IPTG诱导得到高效表达为检测其生物学
活性及以后的应用奠定必要的基础。
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