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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2013年第8期
广西火桐（Erythropsis kwangsiensis）为梧桐科、
火桐属（Erythropsis）植物，中国特有种，仅分布于
广西中部至南部的石灰岩地区，对研究植物区系和
植物地理及亲缘关系等均有重要的学术价值。野生
资源量极少，具有重要的经济价值和科研价值，为
国家二级重点保护植物［1］。
简单序列重复区间（Inter-simple sequence rep-
eat，ISSR）是一种基于 SSR 的简单重复序列区间扩
增多态性分子标记［2］，它结合了 SSR 和 RAPD 的优
点，主要特点是操作简单，遗传多态性高，重复性好，
收稿日期 ： 2013-04-02
基金项目 ：广西植物研究所基本业务费支持项目（ 桂植业 12009），广西科技创新能力与条件建设项目（桂科能 11217028）
作者简介 ：代文娟，女，助理研究员，研究方向 ：珍稀濒危植物遗传多样性 ；E-mail ：dwj@gxib.cn
通讯作者 ：黄仕训，男，研究员，研究方向 ：珍稀濒危植物保护 ；E-mail ：hsx@gxib.cn
正交设计优化广西火桐 ISSR-PCR 反应体系
代文娟1  骆文华1  马虎生1  符支宏1，2  唐文秀1  赵博1  盘波1  黄仕训1
（1. 中国科学院广西植物研究所，桂林 541006 ；2. 广西师范大学生命科学学院，桂林 541004）
摘 要 ： 以广西火桐 DNA 为模板，利用正交试验分别对 ISSR-PCR 反应的 MgCl2 浓度、dNTPs 浓度、Taq DNA 聚合酶浓度、
模板 DNA 浓度进行了优化，并通过梯度 PCR 确定最佳退火温度和循环次数，最终确定广西火桐最佳反应体系及扩增条件。25 μL
体系中 1×PCR buffer，2.5 mmol/L MgCl2，0.15 mmol/L dNTPs，0.06 U/μL Taq DNA 聚合酶，3 ng/μL DNA 模板，0.2 μmol/L 引物 ；最
佳扩增程序为 ：94℃预变性 5 min ；94 ℃变性 45 s，52℃退火 45 s，72℃延伸 1.5 min，共 30 个循环 ；72℃最后延伸 7 min。扩增后
的 PCR 产物在 4℃保存。应用该 ISSR 体系对 10 个广西火桐样品进行了扩增，证实了该体系的适用性和稳定性。
关键词 ： 广西火桐 正交设计 优化
Optimization for ISSR Reaction System of Erythropsis kwangsiensis by
Orthogonal Design
Dai Wenjuan1 Luo Wenhua1 Ma Husheng1 Fu Zhihong1，2 Tang Wenxiu1 Zhao Bo1 Pan Bo1 Huang Shixun1
（1.Guangxi Institute of Botany，Guangxi Zhuang Autonomous Region and the Chineses Academy of Sciences，Guilin 541006 ；2. College of
Life Sciences Guangxi Normal University，Guilin 541004）
Abstract:  To optimize the inter simple sequence repeat（ISSR）reaction condition for Erythropsis kwangsiensis genomic DNA, the
concentrations of MgCl2, dNTPs, Taq polymerase and template DNA were studied with an orthogonal experimental design, and the optimal
anneal temperature of primer and cycles were determined through gradient PCR. The optimal PCR system for ISSR analysis was 1×PCR buffer,
2.5 mmol/L MgCl2, 0.15 mmol/L dNTPs, 0.06 U/μL Taq polymerase, 3 ng/μL template DNA, 0.2 μmol/L primer in 25 μL reaction solution. The
augmentation procedure was pre-denaturation at 94℃ for 5 min, denaturation at 94℃ for 45 s, annealing at 52℃ for 45 s, extension at 72℃ for 1.5
min, reaction with 30 cycles, and extension at 72℃ for 7 min and holding the samples at 4℃. The system was applied in the amplification of 10
varieties of Erythropsis kwangsiensis, and indicated the suitability and stability of the system.
Key words:  Erythropsis kwangsiensis Orthogonal design Optimization
耗资少，模板 DNA 用量少。因此，ISSR 标记技术
广泛应用于植物遗传多样性的研究［3-6］。
目前，尚未见利用 ISSR 对广西火桐进行遗传分
析的报道。为了确保 ISSR 分析结果的可靠性和重复
性，对 ISSR-PCR 反应体系进行优化非常必要。本
试验利用正交设计对广西火桐 ISSR-PCR 反应中的
MgCl2 浓度、dNTPs 浓度、Taq DNA 聚合酶浓度、模
板 DNA 浓度进行系统的研究，并探讨退火温度和反
应循环次数对 ISSR-PCR 的影响，以期建立稳定且
重复性好的广西火桐 ISSR-PCR 反应体系。
2013年第8期 79代文娟等 ：正交设计优化广西火桐 ISSR-PCR 反应体系
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 试验材料 广西火桐材料取自广西植物研究
所内 10 株成年植株的当年生嫩叶。
1.1.2 试 剂 Buffer、MgCl2、dNTPs、Taq DNA 聚
合酶等均购于上海生物工程有限公司，ISSR 引物
由上海生物工程有限公司合成 ；经初步筛选将引物
U835［（Ag）8YC］作为此次正交试验的引物。
1.2 方法
1.2.1 总 DNA 的提取 利用植物基因组 DNA 提取
试剂盒（离心柱型）（上海捷瑞生物工程有限公司）
进行 DNA 的提取，操作步骤参照说明。
1.2.2 ISSR-PCR 反应体系的正交试验设计与 PCR 扩
增 采用 L16（4
4）正交试验设计，对 MgCl2、dNTPs、
Taq DNA 聚合酶、模板 DNA 进行 4 因素 4 水平筛
选，方案如表 1 所示。表中共有 16 个处理，每个
处理做 2 个重复，共 32 管，按表中的数据加样。在
Biometra TProfessional PCR 仪（ 华 粤 企 业 集 团 有 限
公司）上进行扩增。反应体系为 25 μL，除表中所
列因素外，每管还有 1× PCR buffer。根据文献资
料［7， 8］，初步确定 ISSR-PCR 扩增程序为 ：94℃预变
性 5 min ；94℃变性 45 s，50℃退火 45 s，72℃延伸
1.5 min，共 35 个循环 ；72℃最后延伸 7 min。扩增
后的 PCR 产物在 4℃保存。
表 1 ISSR-PCR 反应体系的正交试验设计［L16（44）］
编号 MgCl2（mmol/L） dNTPs（mmol/L） Taq DNA 聚合酶（U/μL） 模板 DNA（ng/μL） 评分 1 评分 2 平均值
1 1 0.1 0.02 2 1 1 1
2 1 0.15 0.04 3 1 2 1.5
3 1 0.2 0.06 4 2 3 2.5
4 1 0.25 0.08 5 1 2 1.5
5 1.5 0.1 0.04 5 4 6 5
6 1.5 0.15 0.02 4 3 5 4
7 1.5 0.2 0.08 3 6 8 7
8 1.5 0.25 0.06 2 4 6 5
9 2 0.1 0.06 3 10 14 12
10 2 0.15 0.08 2 4 4 4
11 2 0.2 0.02 5 4 6 5
12 2 0.25 0.04 4 8 12 10
13 2.5 0.1 0.08 4 7 4 5.5
14 2.5 0.15 0.06 5 14 12 13
15 2.5 0.2 0.04 2 12 10 11
16 2.5 0.25 0.02 3 6 4 5
1.2.3 温度梯度 PCR 在 PCR 梯度扩增仪上设置最
小退火温度为 45℃，最大为 60℃，PCR 仪自动形成
8 个梯度，即 45℃、45.9℃、48℃、50.8℃、54.5℃、
57.5℃、59.1℃、60℃每个梯度设 3 次重复。PCR 反
应体系根据正交试验的结果而定，扩增程序除退火
温度外，其余同 1.2.2。
1.2.4 循环次数的确定 设置 25、30、35、40、45
这 5 个不同循环次数，PCR 反应体系和扩增程序中
的退火温度分别根据正交试验和温度梯度 PCR 试验
结果而定，其余同 1.2.2。
1.2.5 ISSR-PCR 产物的检测 扩增反应结束后，10
μL 上样液含 1 μL GelGreen 核酸染料在 1% 琼脂糖凝
胶中电泳 60 min，电压设定为 120 V，于生物电泳图
像分析系统（美国 UVP）成像分析系统拍照记录。
2 结果
2.1 正交设计的结果
2.1.1 各因素对 PCR 反应影响的差异 L16（4
4）正
交设计的试验和 PCR 扩增结果，见图 1。根据电泳
条带数、亮度和背景对每个处理进行评分，并将结
果计入表 1 中。图 1 显示第 9、14 和 15 组条带明亮、
背景清晰、数量较多。其余组合或没有条带，或条
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第8期80
带较暗、数量少，或背景模糊。因此，第 9、14、
15 组的评分较高，第 1、2、4 组的评分较低。对重
复处理的 PCR 电泳结果评分 2 计入表 1，其结果与
第 1 次 PCR 扩增结果高度一致。对 16 个处理评分
结果进行极差分析，各因素对反应体系的影响从大
到 小 依 次 为 MgCl2、 模 板 DNA、Taq DNA 聚 合 酶、
dNTPs（表 2）；各个因素的最佳反应水平分别为 ：
MgCl2 为 第 4 个 水 平，dNTPs 为 第 3 个 水 平，Taq
DNA 聚合酶为第 3 个水平，模板 DNA 为第 2 个水
平。最佳组合为 MgCl2 为 2.5 mmol/L，dNTPs 为 0.2
mmol/L，Taq DNA 聚 合 酶 为 0.06 U/μL， 模 板 DNA
为 3 ng/μL。但这一组合在正交表中并没有出现，与
分值较高的两个组合（第 14 组和第 15 组）较接近。
响未达到显著水平 ；Taq DNA 聚合酶对结果的影响
都达到了显著水平，MgCl2 对结果的影响都达到了极
显著水平，所以还应对 MgCl2 和 Taq DNA 聚合酶进
行水平间的多重比较。
表 3 ISSR-PCR 正交试验结果方差分析
变异来源 自由度 方差 均方 F 值 P
MgCl2 3 236.150 78.708 11.843 0.000
dNTPs 3 4.375 1.458 0.219 0.882
Taq DNA 聚合酶 3 99.625 33.208 4.997 0.011
模板 DNA 3 6.625 2.208 2.208 0.802
误差 18 119.625 6.646
总和 32 1552.000
2.1.2 各因素不同水平间多重比较 随着 MgCl2 浓
度从 1.0-2.5 mmol/L 增加，扩增结果均值由小变大，
当增加到 2.5 mmol/L 时均值最大（图 2），且与其他
3 个水平之间差异均达到极显著水平。因此，MgCl2
最佳浓度为 2.5 mmol/L。
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 M
1-16 ：处理代号（表 1）；M ：Lambda DNA/EcoR Ⅰ + Hind Ⅲ，下同
图 1 ISSR-PCR 正交试验结果
表 2 ISSR-PCR 正交试验结果极差分析
结果
MgCl2
（mmol/L）
dNTPs
（mmol/L）
Taq DNA 聚合酶
（U/μL）
模板 DNA
（ng/μL）
K1 6.5 23.5 15 21
K2 21 22.5 27.5 25.5
K3 31 25.5 32.5 22
K4 34.5 21.5 18 24.5
k1 1.625 5.875 3.75 5.25
k2 5.25 5.625 6.875 6.375
k3 7.75 6.375 8.125 5.5
k4 8.625 5.375 4.5 6.125
R 值 4.25 1.625 2.625 3.25
Ki 为每个因素同一水平下的条带数之和 ；ki 为每个因素同一水平下的条带
数的平均值 ；R 值为极差
为了弥补极差分析的缺陷，用 DPS 9.50 统计软
件对结果进行了方差分析。结果（表 3）显示，各
因素对广西火桐 ISSR-PCR 反应的影响程度从大到
小 依 次 为 ：MgCl2、Taq DNA 聚 合 酶、 模 板 DNA、
dNTPs。其中，模板 DNA 浓度、dNTPs 对结果的影
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
1 1.5 2 2.5
䇴࠶
ᒣ൷
٬
MgCl2mmol/L
图 2 MgCl2 浓度与评分结果均值的关系
dNTPs 浓度从 0.1-0.25 mmol/L（图 3），扩增结
果均值没有规律变化，在 0.20 mmol/L 时均值最大，
且与其他 3 个水平之间的差异达到极显著水平。
Taq DNA 聚合酶浓度从 0.02-0.08 U/μL，扩增结
果均值先增大后减小，在 0.06 U/μL 时均值最高，0.02
U/μL 时均值最低（图 4），且与其他 3 个水平之间的
差异均达到极显著水平。
随着 DNA 模板浓度增大（图 5），扩增结果均
值无规律变化，当浓度为 2 ng/μL 时均值最低，为 3
ng/μL 时均值最高，且与其他 3 个水平之间差异达到
极显著水平。
2.2 退火温度的确定
图 6 中，各个退火温度均能扩增出产物，且背
2013年第8期 81代文娟等 ：正交设计优化广西火桐 ISSR-PCR 反应体系
景清晰。但若退火温度过低，特异性差，有些主带不
明显，见图 6 中的泳道 1（45℃）、泳道 2（45.9℃）、
泳道 3（48℃）；退火温度过高，引物与模板的特异
性增强，造成多态性偏低，扩增产物较少或谱带亮
度相对较弱，如图 6 中的泳道 6（57.5℃）、泳道 7
（59.1℃）、泳道 8（60℃）；合适的退火温度，即泳
道 4（50.8℃）和泳道 5（54.5℃）扩增产物多态性
高，条带清晰明亮，背景清晰。故本试验以 52℃为
ISSR-PCR 扩增的最佳退火温度。
2.3 循环次数的确定
根据正交试验结果所得的最佳反应体系，在最
适退火温度下，对 PCR 循环数进行梯度试验，设置
5 个梯度，结果如图 7 所示。当循环次数为 30 时能
4.8
5.0
5.2
5.4
5.6
5.8
6.0
6.2
6.4
6.6
0.10 0.15 0.20 0.25
dNTPsmmol/L
䇴࠶
ᒣ൷
٬
图 3 dNTPs 浓度与评分结果均值的关系
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
0.02 0.04 0.06 0.08
Taq DNA㚊ਸ䞦U/μL
䇴࠶
ᒣ൷
٬
图 4 Taq DNA 聚合酶浓度与评分结果均值的关系
0
1
2
3
4
5
6
7
2 3 4 5⁑ᶯDNAng/μL
䇴࠶
ᒣ൷
٬
图 5 DNA 模板浓度与评分结果均值的关系
M 1 2 3 4 5 6 7 8 M
1-8 分别代表 45、45.9、48、50.8、54.5、57.5、59.1、60 ℃退火温度
图 6 温度梯度 PCR 电泳图（UBC857）
得到清晰稳定且丰富的条带，而其他循环次数的扩
增产物有所减少，背景模糊，有些条带较弱甚难辨读。
因此，30 个循环是该反应体系的最佳循环次数。
M 1 2 3 4 5 M
1-5 ：循环次数依次为 25、30、35、40、45
图 7 循环次数试验
2.4 ISSR-PCR反应体系稳定性
用 UBC835 引物对 10 份广西火桐 DNA 用优化
后 ISSR-PCR 体系及扩增程序进行扩增，结果显示（图
8），扩增谱带明亮，背景清晰，稳定性好，多态性
丰富，表明该反应体系和反应程序稳定性、重复性
较好，适合于广西火桐进行 ISSR-PCR 反应。
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
1-10 ：广西火桐样品
图 8 引物 U835 在 10 份广西火桐样品中的 ISSR 扩增结果
3 讨论
影 响 ISSR 反 应 体 系 的 因 素 包 括 MgCl2 浓 度、
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第8期82
dNTPs 浓度、Taq DNA 聚合酶浓度等。研究表明，
MgCl2 浓 度 对 PCR 反 应 影 响 较 大， 不 仅 影 响 Taq
DNA 聚合酶的活性，也影响 PCR 产物的解链温度、
产物的特异性、模板与引物的结合等［9］。过量的
MgCl2 会导致酶催化非特异性产物的扩增，而浓度过
低，又使酶的催化活性降低。本试验中，MgCl2 浓
度为 2.5 mmol/L 时扩增效果最佳。dNTPs 作为 PCR
反应的原料，浓度太低会使扩增反应不完全，从而
降低 PCR 产物的产量 ；浓度过高会对 MgCl2 产生抑
制作用，影响 Taq DNA 酶活力，造成浪费［10］。试
验结果显示，dNTPs 浓度为 0.2 mmol/L 时，扩增得
到的条带数量和质量均较理想。Taq DNA 聚合酶浓
度过高或过低都会影响扩增的结果。本试验中，0.06
U/μL 的 Taq DNA 聚合酶浓度最佳。PCR 反应对模
板 DNA 用量要求的范围通常较广，在 60-100 ng 内
均可获得较好的扩增效果［11，12］。但为避免 DNA 中
杂质对试验的影响，应尽可能采用较低的模板浓度
进行扩增。因此，本试验中的 DNA 用量为 3 ng/μL。
综合以上分析和经济因素，选择第 14 组合作为广西
火桐 ISSR-PCR 反应的最佳体系。
引物的理论退火温度（Tm 值）和通过试验选出
的最适退火温度并无明显规律性［13，14］，试验结果支
持这一观点。本试验中选用引物 U835 的理论退火
温度为56℃， 但试验结果显示52℃是最佳退火温度。
循环次数决定产量，循环次数偏少，产物扩增
不完全，条带不明亮 ；循环次数偏多，错配几率增
加，非特异性产物增多，条带易弥散。此外，循环
次数还受各反应成分的用量限制。通过试验，广西
火桐 ISSR-PCR 反应的最佳循环次数为 30。
4 结论
广西火桐的 ISSR-PCR 反应体系最佳扩增反应
条 件 为 ：25 μL 体 系 中 1×PCR buffer，2.5 mmol/L
MgCl2，0.15 mmol/L dNTPs，0.06 U/μL Taq DNA 聚合
酶，3 ng/μL DNA 模板，0.2 μmol/L 引物。适合广西
火桐的最佳扩增程序为 ：94℃预变性 5 min ；94℃变
性 45 s，52℃退火 45 s，72℃延伸 1.5 min，共 30 个
循环 ；72℃最后延伸 7 min。
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（责任编辑 李楠）