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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2014年第8期
急 性 心 肌 梗 死（Acute myocardiac infraction，
AMI）是严重危害人类健康的常见疾病之一。近年来，
在我国该病的发病率呈明显升高的趋势。肌红蛋白
（Myoglobin，Myo）是 AMI 发生时最早升高的心肌损
伤标志物之一，在发病 2 h 内血清中 Myo 的含量开
始增加，6-9 h 达到峰值。1975 年，Kagen 等［1］首
次提出血清 Myo 的测定可用于急性心肌梗塞的诊断，
收稿日期 ： 2013-12-18
作者简介 ：任艳娜，女，硕士研究生，研究方向 ：兽医药理学与毒理学 ；E-mail ：yanna052267213@163.com
通讯作者 ：唐时幸，男，博士，研究方向 ：生物医学 ；E-mail ：tang.shixing@wondfo.com.cn
重组肌红蛋白的原核表达、纯化及其
冻干质控品的制备
任艳娜  才蕾  武建伟  钱伟  张荣华  王继华  唐时幸
（广州万孚生物技术股份有限公司，广州 510663）
摘 要 ： 旨在为市场提供一种廉价、稳定、特异性强、灵敏度高的肌红蛋白质控品 ；将密码子优化后的肌红蛋白序列通过
两步法进行化学合成，并连接到 pET-28a 表达载体上，转入大肠杆菌 BL21（DE3），用 0.5 mmol/L IPTG 37℃诱导表达 ；目的蛋白
经 Ni Sepharose 6 Fast Flow（FF）亲和层析进行纯化后，对其特异性进行检测，并研究蛋白稀释液的配方和优化冻干工艺，最后对
冻干质控品的稳定性进行检测 ；结果显示目的蛋白分子量大小为 20 kD 左右，具有较强的特异性。蛋白冻干后具有很好的形态，
37℃可以稳定保存 10 d ；25℃、4℃可以稳定保存 4 个月以上。该蛋白的冻干制品成本低、稳定性好、特异性强、灵敏度高，可用
于定性定量肌红蛋白检测试剂盒的质控品。
关键词 ： 重组肌红蛋白 原核表达 纯化 冻干 质控品
The Expression and Purification of Recombinant Myoglobin and
Preparation of Its Quality Control Samples
Ren Yanna Cai Lei Wu Jianwei Qian Wei Zhang Ronghua Wang Jihua Tang Shixing
（Guangzhou Wondfo Biotech Co.，Ltd，Guangzhou 510663）
Abstract:  We intended to provide a cheap, stable, highly specific and sensitive lyophilized protein as quality control for diagnositic kits.
The myoglobin gene code was optimized and two-step methods were used in this study for the synthesis of myoglobin gene. The DNA fragment of
myoglobin was inserted into pET-28a vector forming a recombination plasmid, then, transformed into BL21（DE3）bacteria. Protein expression
was induced by 0.5 mmol/L IPTG and purified by Ni Sepharose 6 Fast Flow（FF）. After confirming its specificity, we studied the stability of
the lyophilized protein at different storage temperatures（37℃, 25℃, 4℃）. Results showed that the target protein is approximately 20 kD with
high specificity, good morphology and stability after freeze-drying under the optimized conditions and protein diluting solution. The lyophilized
myoglobin protein with low cost, good stability, high specificity and sensitivity, canbe used as quality control for both qualitative and quantitative
myoglobin testing kits.
Key words:  Recombinant Myoglobin Prokaryotic expression Purification Lyophilized Quality control samples
检测病人的 Myo 水平可以快速确诊并及时治疗，从
而降低病死率［2］。此外，Myo 是判断急性心肌梗塞
患者有无再灌注的最好的无创指标之一。溶栓治疗
开始后 90 min，如果肌红蛋白升高近 4 倍，则可比
较准确判定梗死冠脉已完全开通。因此，肌红蛋白
的检测对急性心肌梗死的诊断、预测心肌梗塞面积、
指导溶栓治疗及其预后具有重要意义［3，4］。
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第8期190
肌红蛋白存在于哺乳动物肌肉中，具有在肌细
胞内转运和贮存氧的功能［5］，由一条多肽链构成，
有 153 个氨基酸残基和一个血红素辅基，分子量为
17.8 kD［6，7］。人体心肌、骨骼肌内含有大量肌红蛋
白，正常人的血液中很少，主要由肾脏代谢并排泄。
肌红蛋白增高见于急性心肌梗死早期、急性肌损伤、
肌营养不良、肌萎缩、多发性肌炎、急性或慢性肾
功能衰竭、严重充血性心力衰竭和长期休克等［8-11］。
市场上的肌红蛋白质控品均为进口血源型人肌
红蛋白，来源受限，价格昂贵，购买渠道难以保证。
血源型人 Myo 不稳定，极易降解，严重限制肌红蛋
白诊断试剂的发展［12］。虽然国内外通过基因工程手
段表达重组肌红蛋白的报道很多，但所表达的 Myo
稳定性有待进一步提高，其表达条件仍需优化［6，13］。
本研究通过基因工程技术，对该蛋白进行体外
表达、纯化并优化冻干工艺，旨在为市场提供一种
表达效率高、重复性好，蛋白活性高和稳定性高，
接近于血液来源样品的产品，填补市场高品质重组
肌红蛋白质控品的空白，为我国肌红蛋白诊断试剂
和质控品开发提供保障。
1 材料与方法
1.1 材料
DNA Ex Taq 酶、限制性内切酶、T4 DNA 连接
酶购自 TaKaRa 公司 ；细菌基因组提取试剂盒、DNA
回收试剂盒购自 Promega 公司 ；小量质粒提取试剂
盒购自北京奇华盛 ；中分子量蛋白 Marker、预染蛋
白 Marker 购自 Fermentas 公司 ；甘氨酸、十二烷基
磺酸钠（SDS）、甲双叉丙烯酰胺、考马斯亮兰、丙
烯酰胺、IPTG 购自 Sigma 公司 ；质粒 pET-28a、大
肠杆菌 E.coli BL21（DE3）、大肠杆菌 E.coli DH5α 为
本实验室保存 ；目的基因由 Genewiz 公司合成 ；肌
红蛋白抗体购自 Hytest 公司 ；辣根酶标记山羊抗鼠
IgG 购自北京中杉金桥生物技术有限公司 ；CHRIST
ALPHA1-2 型冷冻干燥机购自 Martin Christ 公司 ；其
它试剂均为国产分析纯。
1.2 方法
1.2.1 表达载体 pET28a-Myo 的构建 通过 NCBI 获
取人源肌红蛋白（Myo）的编码序列后，根据大肠
杆菌偏爱性，运用密码子优化工具 http ：//www.jcat.
de/Start.jsp 对序列进行优化 ；并利用化学合成的技
术手段获得目的基因片段。由 Genewiz 公司合成的
优化密码子基因片段经 BamH I 和 Hind III 双酶切，
酶切产物纯化，取 3 μL 与经同样限制性内切酶双酶
切后的质粒 pET-28a，16℃连接过夜。热激法将连
接产物转化感受态大肠杆菌株 E.coli DH5α，涂布于
含 50 μg/mL Kan+ 的 LB 平板，挑取阳性克隆经菌落
PCR 和酶切初步鉴定后，送 Invitrogen 公司测序。鉴
定正确后得到重组表达载体命名为 pET28a-Myo。
1.2.2 Myo 的诱导表达 将测序正确并经过酶切
鉴定的阳性重组质粒用热激发转化大肠杆菌 E.coli
BL21（DE3）感受态细胞，复苏后涂布于 Kan+ 浓度
为 50 μg/mL 的 LB 琼 脂 培 养 基 上，37℃ 培 养 16 h。
挑取 4 个单菌落接种至含 50 μg/mL Kan+ 的 5 mL LB
液体培养基中，37℃，200 r/min 培养过夜。次日，
以 1∶100 比例转接于 5 mL 新鲜含 50 μg/mL Kan+ 的
LB 培 养 基 中，37℃，200 r/min 培 养 至 OD600 ≈ 0.8
时加入 IPTG 至终浓度 0.5 mmol/L，37℃诱导培养 4-5
h。SDS-PAGE 检测 4 株菌重组蛋白的表达情况，并
筛选高效表达的重组菌株。挑选高效表达菌株进行
表达条件优化和扩大培养。
1.2.3 Myo 的纯化收集 扩大培养的菌体，在冰浴
条件下超声破碎（超声条件为 ：超声 5 s，间隔 12 s，
共超声 15 min），12 000 r/min 4℃离心 15 min，上清
经 Ni Sepharose 6 Fast Flow（FF）亲和层析纯化。上
样缓冲液为 20 mmol/L PB，5 mmol/L 咪唑 pH7.4 ；平
衡缓冲液为 20 mmol/L PB，250 mmol/L 咪唑 pH7.4 ；
洗 脱 缓 冲 液 为 20 mmol/L PB，500 mmol/L 咪 唑
pH7.4。
1.2.4 Myo 特异性检测 为了检测 Myo 的特异性和
灵敏度，实验室用购自 Hytest 的肌红蛋白抗体 1 000
倍稀释后做一抗，进行 Western blot 检测。
1.2.5 Myo 的活性检测 将原浓度重组肌红蛋白分
别稀释若干倍后（浓度 H、浓度 M、浓度 L），用广
州万孚生物技术公司研发的肌红蛋白检测试剂盒（荧
光定量免疫层析法）对该蛋白的活性进行检测，从
而确定适当的稀释比例进行后续试验。
1.2.6 Myo 冻干工艺的筛选 为了增加蛋白的稳定
性，筛选蛋白的冻干工艺。分别用小牛血清和健康
人血浆作为稀释液，加入赋形剂和保护剂后，分别
2014年第8期 191任艳娜等 ：重组肌红蛋白的原核表达、纯化及其冻干质控品的制备
将蛋白稀释上述确定的 3 个浓度（浓度 H、浓度 M、
浓度 L）进行冻干，并通过冻干外观、活性收率和
37℃ 1 周破坏试验（在 37℃恒温培养箱中，每天取
出一支进行活性检测）筛选最佳冻干工艺。
1.2.7 Myo 冻干样品稳定性检测 为进一步验证冻
干工艺，评价该质控品的稳定性，同一批冻干样品
分别于 25℃、4℃放置 4 个月，检测冻干蛋白的实
时稳定性。此外，通过 37℃加速破坏试验预测冻干
蛋白的长期稳定性。
2 结果
2.1 表达载体的鉴定
将重组质粒 pET28a-Myo 送到 Invitrogen 公司进
行测序，结果（图 1）表明连接正确，与预期结果一
致。同时对提取的重组质粒进行双酶切鉴定，电泳
结果可观察到一条 500 bp 左右的条带，说明目的片
段已成功插入到表达载体 pET-28a 中（图 2）。
2.3 Myo特异性检测结果
用购自 Hytest 的抗肌红蛋白抗体为一抗，以辣
根酶标记山羊抗鼠 IgG 为二抗进行 Western blot 检测
该重组蛋白的特异性。结果（图 4）表明，表达的
重组 Myo 可与特异性的抗肌红蛋白抗体结合，特异
性良好。
5000
bp
M 1 2
3000
2500
2000
1000
750
500
100
250
M ：DNA Marker DL5000 ；1，2 ：pET28a-Myo 酶切鉴定结果
图 2 pET28a-Myo 酶切鉴定
2.2 Myo的诱导表达及纯化结果
按正交试验进行表达因素筛选，包括温度、诱
导剂量、诱导时间、宿主菌 OD 值以及培养基 pH 值
等。结果（图 3）显示，以 BL21（DE3）为宿主菌体，
在 37℃，OD600≈0.8 时， 加 入 终 浓 度 为 0.5 mmol/L
的 IPTG，37℃诱导 4 h 表达量最大。菌液裂解后，
用 Ni Sepharose 6 Fast Flow（FF） 亲 和 层 析 进 行 纯
化， 上 样 缓 冲 液 为 20 mmol/L PB，5 mmol/L 咪 唑
pH7.4 ；平衡缓冲液为 20 mmol/L PB，250 mmol/L 咪
唑 pH7.4 ；洗脱缓冲液为 20 mmol/L PB，500 mmol/L
咪唑 pH7.4。洗脱得到的目的蛋白纯度大于 95%，
分子量大小正确。
64
kD
M 1 2 3 4 5
50
36
22
16
6
M ：蛋白质 Marker ；1，2 ：超声上清 ；3 ：未结合蛋白 ；
4，5 ：500 mmol/L 咪唑洗脱蛋白
图 3 Myo 的表达及纯化结果
1:1000〰䟺व㻛অඁ
图 4 纯化后蛋白 Western Blot 检测结果
2.4 Myo活性检测结果
将重组肌红蛋白原液若干倍稀释以后，用广州
万孚生物技术股份有限公司生产的肌红蛋白（Myo）
定量检测试剂对稀释的 3 个不同浓度（浓度 H、浓
度 M、浓度 L）重组肌红蛋白活性进行检测，每个
浓度平行检测 10 支，CV 值均小于 10%（表 1）。
表 1 定量试剂盒对重组肌红蛋白的检测结果
结果
蛋白浓度（ng/mL）
H M L
AV（n=10） 251.30 76.83 34.22
SD 19.33 5.67 1.69
CV（%） 9.23 8.12 5.37
2.5 Myo冻干工艺的优化
为保证蛋白运输保存的稳定性，对冻干工艺进
行了初步探索。最终确定小牛血清中加 3% 乳糖、
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第8期192
320 330 340 350 360 370 380 390 400
310300290280270260250240230
140 150 160 170 180 190 200 210 220
580570560550540530520510500
410 420 430 440 450 460 470 480 490
图 1 pET28a-Myo 的测序结果
2014年第8期 193任艳娜等 ：重组肌红蛋白的原核表达、纯化及其冻干质控品的制备
0.04% 人血清白蛋白、20 mmol/L NaCl 作为蛋白稀释
液。将蛋白稀释到适当浓度，-80℃预冻 4 h 后，真空冻
干 12 h，取出加盖密封保存，其外观呈白色疏松饼状。
在此冻干方案下，活性收率（溶液冻干后活
性 / 溶液冻干前活性）可达 85% 以上 ；37℃稳定保
存 10 d，冻干样品的外观仍为白色疏松饼状，活性
在 ±25% 参考范围以内。
2.6 Myo冻干样品稳定性试验结果
用广州万孚生物技术股份有限公司生产的肌红
蛋白检测试剂盒（荧光定量免疫层析法）对同一冻
干批次的 3 个不同浓度（H、M、L）的冻干样品的
稳定性进行跟踪。研究发现，冻干样品在 25℃、4℃
可以稳定保存 4 个月以上（表 2，表 3）；37℃可以
稳定保存 10 d 以上（表 4），所测得的蛋白浓度均在
起始浓度 ±25% 参考范围之内。
表 2 Myo 冻干样品 25℃稳定性试验结果
保存时间（月）
样品浓度（ng/mL）
H M L
0 209.30 69.87 31.55
0.5 202.44 83.47 36.25
1 215.71 62.71 28.26
1.5 237.57 72.03 25.28
2 202.82 64.02 25.04
3 193.4 77.56 28.41
4 161.26 62.71 30.86
浓度 H、浓度 M、浓度 L 的参考范围分别为 H（156.98-261.62 ng/mL）、M
（52.40-87.33 ng/mL）、L（23.66-39.43 ng/mL），下同
表 3 Myo 冻干样品 4℃稳定性试验结果
保存时间（月）
样品浓度（ng/mL）
H M L
0 209.30 69.87 31.55
1 252.19 87.29 38.70
2 204.00 78.15 26.16
3 201.42 79.82 28.79
4 219.66 89.09 41.51
3 讨论
目前，肌红蛋白测定方法很多，其敏感性和特
异性不同。有放射免疫方法（RIA）、高效液相色谱
法（HPLC）、滴金免疫测定法（DIGFA）、速率散射
浊度法（RAN）、酶联免疫方法（ELISA）、荧光免疫
法和胶乳凝集试验等［14-17］，而以上各检测方法的建
立，首先都必须获得优质的肌红蛋白抗原。但目前
人源肌红蛋白来源受限，重组肌红蛋白稳定性差，已
成为制约肌红蛋白检测技术发展的巨大障碍［6，7，13］。
张欣等［13］发表了关于基因工程重组肌红蛋白的表
达的相关研究，其纯度、特异性等方面能满足要求，
但稳定性仅做了重组抗原在 -20℃环境中保存 3 个
月，并没有做长途运输相关的 4℃和 25℃，及使用
时 37℃稳定性研究。安星兰［5］和崔大伟等［6］也发
表了关于重组肌红蛋白的研究，但该研究表达的重
组肌红蛋白主要用于下一步的免疫获得单克隆抗体，
并未对稳定性及抗原反应灵敏度做任何研究。
本研究在 NCBI 查询得到 Myo 氨基酸序列的基
础上，对 Myo 密码子经过优化得到大肠杆菌惯用的
密码子序列，参照 Young 等［18］提出的两步法进行
全基因合成的方法得到 Myo 基因序列。双酶切后与
pET-28a 连接，通过热激法将重组质粒 pET-28a-Myo
转入到 BL21（DE3）后进行诱导表达，经 Western
blot 及商品化检测试剂盒检测，该重组蛋白活性很
高。大量发酵后，进行 Ni Sepharose 6 Fast Flow（FF）
亲和层析纯化，其纯度大于 95%，满足生产浓度及
纯度的需求。并根据实际需求研究了肌红蛋白最佳
保护剂和冻干工艺，冻干样品 37℃稳定性、25℃稳
定性、4℃稳定性，以确保该蛋白冻干制品在常规储
存及运输条件下的稳定性。
真空干燥，又名解析干燥，是一种将物料置于
负压条件下，并适当通过加热达到负压状态下的沸
点来干燥物料的干燥方式，是目前用于微生物、蛋
白质等生物制品干燥保存的一种最常用、最有效的
表 4 Myo 冻干样品 37℃稳定性试验结果
保存时间（d）
样品浓度（ng/mL）
H M L
1 209.30 69.87 31.55
2 242.11 66.53 30.14
3 216.14 72.34 33.29
4 196.32 70.89 35.67
5 203.90 69.51 31.29
6 194.52 62.14 31.78
7 198.23 61.89 30.86
8 184.79 59.43 29.46
9 186.52 58.71 48.57
10 172.38 54.21 26.91
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第8期194
方法［19］。目前，常用的蛋白冻干保护剂包括糖类及
多元醇、聚合物、无水溶剂、表面活性剂、氨基酸
以及某些盐和胺［20］。在低温下干燥，各有效成分活
性丧失少 ；复溶性好，能很快地吸水还原成干燥前
的鲜活状态 ；脱水彻底，保存期长，储存运输、销
售方便。但是，在真空冷冻干燥过程中，冷冻和干
燥不可避免地会造成部分蛋白的损伤及降解［21，22］。
为了减少冻干过程中 Myo 活性成分的损失，根据
Myo 本身的结构，通过 37℃加速破坏试验对 Myo 的
保护剂、赋形剂、缓冲液进行筛选。同时对冻干压
强、湿度、冻干时间、仪器最适冻干量等进行优化，
初步确定 Myo 的最佳冻干工艺。
为了使该肌红蛋白冻干品稳定性和冻干品复溶
后稳定性达到最佳，在初步冻干工艺的基础上对保
护剂、赋形剂、盐浓度进行深入研究。结果发现，
保护剂人血清白蛋白浓度为 0.04% 时达到最佳冻干
效果，降低人血清白蛋白的浓度会导致活性收率降
低，提高人血清白蛋白浓度对活性收率没有明显影
响，但成本明显增加 ；赋形剂乳糖的浓度为 3% 时
外观形态最好，提高乳糖浓度对活性和外观无明显
影响，但降低乳糖浓度冻干制品严重变形，呈玻璃状；
盐浓度对肌红蛋白稳定性的影响比较大，随着 NaCl
浓度的升高（0-100 mmol/L），冻干制品的 37℃稳定
性逐渐降低，肌红蛋白冻干制品的复溶稳定性逐渐
提高。随着 NaCl 浓度的降低（100-0 mmol/L），肌
红蛋白冻干制品的 37℃稳定性逐渐提高，冻干制品
复溶稳定性逐渐降低。综合考虑各种因素，最终确
定冻干方案（3% 乳糖、0.04% 人血清白蛋白、20
mmol/L NaCl）。按照此冻干工艺，冻干样品在 25℃、
4℃和 -20℃可以稳定保存 4 个月以上 ；在 37℃可以
稳定保存 10 d 以上 ；复溶后在 4℃和 25℃分别能稳
定保存 6 d。
4 结论
本 研 究 将 人 源 肌 红 蛋 白（Myo） 的 基 因 片 段
连 接 到 表 达 载 体 pET-28a、 转 入 BL21（DE3） 后，
37℃诱导表达得到活性高、特异性好的目的蛋白
Myo。将纯化后的 Myo 按一定比例稀释后，加入赋
形剂乳糖 3%、保护剂人血清白蛋白 0.04%、增加蛋
白水化程度的中性盐 NaCl 20 mmol/L，-80℃预冻 4 h
后，真空冻干 12 h 得到外观呈白色疏松饼状冻干制
品。该冻干制品在 25℃、4℃和 -20℃可以稳定保存
4 个月以上 ；在 37℃可以稳定保存 10 d 以上 ；复溶
后在 4℃和 25℃分别能稳定保存 6 d。
参 考 文 献
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（责任编辑 马鑫）