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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2016, 32(1):103-108
现代甘蔗栽培种是甘蔗属热带种，割手密和印
度种等物种的种间杂交种，在长期的高贵化育种过
程中，减数分裂的异常使得现代甘蔗栽培种形成大
量的异源多倍非整倍体［1］，同时由于甘蔗对光周期
反应敏感，许多重要亲本在亚热带和温带地区很难
开花，即使开花也存在花粉数量不足，与近缘植物
的花期不遇等问题，给甘蔗常规杂交育种带来许多
困难［2］。而转基因技术是将人工分离和修饰过的基
因通过物理、化学及微生物介导的方式导入到生物
体基因组中，不受生物体间亲缘关系的限制，操作
时间短，改良目的性状明确。而且甘蔗组培技术成
熟，转基因技术相对较容易［3］，已成为甘蔗品种遗
收稿日期 ：2015-03-27
基金项目 ：国家自然科学基金项目（31371687），现代农业产业技术体系建设专项资金项目（CARS-20-2-5）
作者简介 ：王文治，男，硕士研究生，助理研究员，研究方向 ：甘蔗基因工程 ；E-mail ：wangwenzhi@itbb.org.cn
通讯作者 ：张树珍，女，博士，研究员，研究方向 ：甘蔗生物技术 ；E-mail ：zhangshuzhen@itbb.org.cn
甘蔗一次多基因遗传转化及多重 PCR 检测
王文治  杨本鹏  蔡文伟  熊国如  王俊刚  冯翠莲  张树珍
（中国热带农业科学院甘蔗研究中心 中国热带农业科学院热带生物技术研究所 农业部热带作物生物学与遗传资源利用重点实验室，
海口 571101）
摘 要 ： 通过多基因遗传转化策略，水稻、玉米等农作物实现了一次多个性状的遗传改良，为探索甘蔗一次多基因遗传转
化的可行性，用一个多基因植物表达载体，对甘蔗进行遗传转化。通过多重 PCR 法对 4 个外源基因在各个转基因株系内的整合与
缺失进行检测。结果证明，甘蔗一次多基因遗传转化是可行的，但因插入的 DNA 片段较大，会发生基因丢失现象。因此，一次多
基因遗传转化需要在转化的过程中获得相对较多的转化株系，才能从中筛选到有应用价值的株系。
关键词 ： 甘蔗 ；农杆菌介导法 ；多基因遗传转化 ；多重 PCR 检测
DOI ：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.01.017
Multiple Gene Transformation in Sugarcane and Multiple PCR
Detection
WANG Wen-zhi YANG Ben-peng CAI Wen-wei XIONG Guo-ru WANG Jun-gang
FENG Cui-lian ZHANG Shu-zhen
（Sugarcane Research Center of Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences，Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology of Chinese
Academy of Tropical Agricultural Sciences，Key Laboratory of Biology and Genetic Resources of Tropical Crops of Ministry of Agriculture，
Haikou 571101）
Abstract: Multiple traits of crops such as rice and corn had been improved in single time of transformation by the strategy of multiple
gene transformation. For exploring the feasibility of multiple gene transformation of sugarcane in this research, a multiple gene expression vector
was used and transformed to sugarcane and many transformed plants were produced. Multiple PCR method was used to analyze the integration
and deficiency of multiple genes in the transformed plants. Results showed that multiple gene transformation of sugarcane was feasible. But due
to the insertion of large DNA fragments some genes were lost during the integration. Thus it is a need to have sufficient transformed plants then
valuable transformed plants can be selected for further research.
Key words: sugarcane ；Agrobacterium-mediated ；multiple gene transformation ；multiple PCR detection
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2016,Vol.32,No.1104
传改良的重要途径。
然而转基因育种中单独的转化一个或两个基因，
很难真正对作物起到较大程度的改良。多基因转化
策略已成为基因工程在基础理论与实际应用研究中
的主流方向［4］。一次多基因转化可以缩短时间，减
少成本，减少筛选标记的积累。国内在大豆、水稻
等作物一次多基因多性状遗传改良方面的研究已有
报道［5，6］，而对甘蔗这方面开展的研究则很少，国
内所见的报道仅限于两个基因融合表达，未见有 3
个或 3 个以上同时多基因多性状的遗传改良。国内
研究单位对甘蔗遗传改良方面已经做了很多研究，
部分转基因甘蔗品系已进入环境释放阶段，但最后
取得成功的单位非常有限［7］。在甘蔗上开展一次多
基因遗传改良具有重要意义。
本实验构建一个多基因植物表达载体，对甘蔗
进行遗传转化，并通过多重 PCR 法对转化株系进行
PCR 检测，旨在探索甘蔗一次多基因遗传转化的可
行性。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 品种、质粒和菌株 本研究所用的受体材料
为甘蔗主栽品种新台糖 22 号，含 bar 筛选标记基因
及另外 3 个不同目的基因的植物表达载体为本实验
构建保存，载体总大小为 26 kb，左臂和右臂之间的
插入序列达 20 kb，转化所用农杆菌菌株为 EHA105。
1.1.2 引物合成 分别合成筛选标记基因 bar 和另外
3 个不同目的基因的特异引物 P-F/R、TG1-F/R、TG2-
F/R 和 TG3-F/R 共 4 对，4 对引物退火温度相近，扩
增产物彼此之间相差 100 bp 以上，以便于用于转基
因植株的多重 PCR 检测。各基因以及各引物扩增产
物大小分别为 ：筛选标记基因 bar（513 bp）、Gene 1
（643 bp）、Gene 2（359 bp）、Gene 3（743 bp）。
1.1.3 培养基配方 胚性愈伤组织诱导培养基 ：
MS+2，4-D 1 mg/L+ 蔗糖 30 g/L+ 卡拉胶 8 g/L，pH5.8。
分化培养基 ：MS+6-BA 1 mg/L+KT 0.5 mg/L+ 蔗
糖 30 g/L+ 卡拉胶 8 g/L，pH5.8。
生根诱导培养基 ：MS（大量元素减半，其它成
分不变）+NAA 2 mg/L+ 蔗糖 20 g/L+ 椰水 100 mL/L+
卡拉胶 8 g/L+ 活性炭 0.2 g/L，pH5.8。
YEP 培养基（1 L）：蛋白胨 10 g，酵母提取物
10 g，NaCl 5 g。
MR（1 L）：1/5MS 大 量 元 素 +MS 其 他 成 分
+2，4-D 1 mg/L+10 mmol/L 果 糖 +10 mmol/L 葡 萄 糖
+30 g/L 蔗糖，pH5.3。
1.2 方法
1.2.1 甘蔗胚性愈伤组织的诱导 以田间生长良好
的甘蔗顶端生长点处的幼叶组织为外植体，经酒精
及升汞消毒、无菌水冲洗后，于无菌滤纸上吸干其
表面的水分后，切成 1 mm 左右厚度的薄片接种于
诱导培养基上，于避光条件下进行培养至诱导出愈
伤组织。
1.2.2 农杆菌侵染菌液的制备 通过冻融法将多基
因植物表达载体导入到农杆菌菌株 EHA105 中。将
经酶切及多重 PCR 鉴定为阳性的农杆菌在含抗生素
的 YEP 平板上划线，挑取单菌落接种到 5 mL YEP
的液体培养基中，振荡培养至对数生长期，于 150
mL 三角瓶中扩大培养，培养至 OD 为 0.6 左右，将
菌液转移到离心管中，5 000 r/min 离心 5 min，弃上
清，吸干残液，用 MR 液体培养基重悬菌体，最后
置于 28℃，200 r/min 激活 2 h，诱导细菌 Vir 基因的
表达，作为转化材料的浸染液。
1.2.3 愈伤组织的转化 挑取生长旺盛的愈伤组织
于滤纸上吹干使其处于干缩状态，于工程菌液中浸
泡 30 min 后，滤去菌液，用滤纸吸干残液，吹干，
转移到 MR 固体培养基上。共培养 3-4 d 后，转移
到含有 Basta 的继代培养基上继代筛选培养 20 d 后，
转移到含有 Basta 的分化培养基上分化筛选培养 15
d。待愈伤长出 1 cm 左右的小苗后，转移至含有
Basta 的生根培养基上生根筛选培养 30 d。
1.2.4 抗性小苗 PCR 分子检测 当在抗性生根培养
基上生长旺盛，浓绿的小苗生长至 4-7 cm 后，按
编号剪取小苗叶片组织约 10-20 mg 左右，剪碎置
于 eppendorf 管中，用 CTAB 法提取 DNA。用 1.1.2
合成的筛选标记基因 bar 和另外 3 个不同目的基因
的特异引物 P-F/R、TG1-F/R、TG2-F/R 和 TG3-F/R，
进行单个基因 PCR 检测和 4 个基因四重 PCR 检测，
扩增时设置非转基因甘蔗叶片为负对照，质粒载体
为正对照。最后统计筛选标记基因 bar 和另外 3 个
2016,32(1) 105王文治等：甘蔗一次多基因遗传转化及多重 PCR检测
目的基因的 PCR 检测阳性率。同时分析 4 个基因四
重 PCR 检测转基因植株的可行性。
2 结果
2.1 多基因植物表达载体转化农杆菌的鉴定
多基因植物表达载体构含有 bar 筛选标记基因
以及 3 个不同的目的基因（图 1）。在冻融法转化农
杆菌之前，首先对载体进行酶切鉴定，结果（图 2）
显示，在不同限制性内切酶的作用下，bar 基因及
3 个目的基因均能切出与预期片段大小一致的条带，
证明质粒准确。通过冻融法转农杆菌菌株后，平板
上挑起单克隆，进行菌液四重 PCR 鉴定，图 3 表
明，菌液四重 PCR 能扩增出与正对照质粒载体相同
的 4 个条带，证明质粒载体已经准确导入到农杆菌
中。四重 PCR 所用 4 对引物为 bar 基因及 3 个目的
基因的特异性扩增引物 P-F/R、TG1-F/R、TG2-F/R
和 TG3-F/R，PCR 扩增引物与质粒 DNA 的结合位置
如图 1 所示，设计引物时，4 对引物退火温度相近，
且 4 对引物彼此之间距离均超过 3 000 bp，在较短
的 PCR 延伸时间内（30 s）不会发生不同对引物之
间的交叉扩增（如 TG1-F 与 TG2-R 之间）。
2.2 转基因植株的获得
通过农杆菌介导法，用多基因植物表达载体
对甘蔗进行遗传转化，用除草剂进行筛选。侵染过
后的愈伤组织经继代筛选培养后，部分愈伤组织能
产生乳白色健康的抗性愈伤组织（图 4-A）。抗性
愈伤组织继续进行分化筛选培养后，生长出抗性的
密集纵生芽（图 4-B）。抗性纵生芽继续进行生根
筛选培养后生长成健康浓绿的抗性植株。待抗性植
株长到 5 cm 以后即可进行后续的 PCR 等分子检测
（图 4-C）。
bNRB
Ubi
Target Gene 3
Target Gene 2
Target Gene 1
cSpec
bNLB
VirG TG3-F/R
TG2-F/R
TG1-F/R
P-F/R
26000 bp
ཊสഐ䖭փRepA VS1 COLE tNOS
tNOS
tNOS
tNOS
bar selection
marker gene
Ubi
Ubi
Ubi
图 1 多基因植物表达载体
bar gene Gene 1 Gene 2 Gene 3 M
2000
bp
1000
750
500
250
图 2 质粒酶切鉴定
Agro Vector H2O M
2000
1000
3000
5000
bp
750
500
250
Gene 2
bar gene
Gene 1
Gene 3
图 3 农杆菌菌株多重 PCR 鉴定
A B C
A ：继代筛选后的抗性愈伤组织 ；B ：分化筛选培养后的抗性小芽群 ；
C ：生根筛选培养后的抗性植株
图 4 甘蔗遗传转化
2.3 抗性植株的单基因PCR检测
单基因 PCR 检测结果（图 5）显示，进行 PCR
检测的 23 株抗性植株中，bar 基因 PCR 呈阴性的仅
有编号 11，Gene 1 为 PCR 呈阴性的也仅有编号 11，
Gene 2 呈 PCR 阴性的有编号 4、11、16 三株，而
Gene 3 呈 阴 性 的 有 2、3、4、7、11、13、16 和 19
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2016,Vol.32,No.1106
共 8 株。
2.4 抗性植株的多重PCR检测
以所提 23 株抗性小苗的 DNA 为模板，进行四
基因的四重 PCR 检测。结果（图 6）显示，bar 基因
PCR 显阴性的仅有编号 11，Gene 1 为 PCR 显阴性
的也仅有编号 11，Gene 2 为 PCR 阴性的有编号 4、
11、16 三株，而 Gene 3 为阴性的有 2、3、4、6、7、
11、13、16、19 共 9 株。 多 重 PCR 检 测 结 果 与 单
基因 PCR 结果大致相同，仅有编号 6 的植株单基因
PCR 显阳性，而多重 PCR 检测显示阴性。说明多重
转基因植株多重 PCR 检测，基本可以准确反映转基
因植株的外源基因的整合情况 。
1 2 3 4 5 6 7 8 9 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 CK- CK+
bar Gene
10
Gene 3
Gene 2
Gene 1
1-23 ：生根筛选培养后的抗性植株 ；CK- ：非转基因植株 ；CK+ ：质粒 DNA
图 5 单基因 PCR 检测
1 2 3 4 5 6 7 8 9 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 CK- CK+10
bar Gene
Gene 3
Gene 2
Gene 1
1-23 ：生根筛选培养后的抗性植株 ；CK- ：非转基因植株 ；CK+ ：质粒 DNA
图 6 转化植株多重 PCR 检测
2.5 多基因遗传转化的片段遗失
根据单基因 PCR 检测结果，可以看出多基因大
片段的遗传转化会出现部分片段的断裂与缺失现象。
而图 7 则清晰地显示了筛选标记基因与 3 个目的基
因的插入与缺失的情况。除编号 11 为整个插入片段
均缺失以外（怀疑为培养基上的假抗性植株），另外
22 个株系均成功的整合了 bar Gene 和 Gene 1。而随
着 Gene 2 和 Gene 3 离 bar Gene 越来越远，缺失的现
象也随着加重。而且基因缺失遵循着前一个基因缺
失，后面的基因必缺失 ；后面的基因不缺失，前面
的基因也不缺失的现象。
3 讨论
随着后基因组时代的到来，人类将克隆到越
来越多、生物学意义明确的有用基因，并通过基因
工程手段对生物体进行遗传改良。以往的植物基因
工程，大多数是通过转单个或两个外源基因而获得
某个新的性状或改善某个性状。但是生物体的绝大
多数性状和生理功能都是依靠多基因的协调表达而
实现的。因此单独的转化一个或两个基因，效果往
往不大理想，很难真正对作物起到较大程度的改
良。例如甘蔗蔗糖的合成，受到了很多关键酶基因
的影响，如果单一对某一个基因进行改良，是无法
真正起到增糖的效果的。好比一条公路有多个限速
环节，只打通其中一个限速点，而忽略了其他的限
速点，对公路的提速效果肯定不理想。一次多基因
遗传转化可以有效地解决这一问题，是很有应用前
2016,32(1) 107王文治等：甘蔗一次多基因遗传转化及多重 PCR检测
景的作物转基因改良技术手段。一次多基因遗传转
化可以同时将多个基因插入植物基因组，同时对多
个性状进行遗传改良，减少了不同单基因多次遗传
转化的多个筛选标记基因的累赘，减少了工作量与
成本。但是一次多基因遗传转化，表达载体上左臂
和右臂之间的片段就比单基因的大。而在遗传转化
的过程中会出现 DNA 片段断裂缺失的现象，而且随
着插入片段越大，DNA 片段断裂与缺失的现象就越
严重［8，9］。本研究的实验结果充分印证了这一现象
的存在。在遗传转化筛选的过程中，培养基筛选是
针对筛选标记基因进行的，因此只要筛选剂添加的
浓度合适，在筛选培养基上获得的抗性植株基本为
筛选标记 PCR 阳性。本研究室所建立的甘蔗转基因
bar/Basta 筛选系统与 pmi/Mannose 筛选系统最后在得
到的抗性植株，筛选标记基因的 PCR 阳性率基本接
近于 100%［10，11］。但是连接在筛选标记基因之后的
目的基因就会或多或少的出现一些缺失的现象。其
缺失的规律为插入片段越大，缺失概率越大 ；离筛
选标记基因越远，缺失概率越大 ；前一个基因缺失，
后面的基因必缺失 ；后面的基因不缺失，前面的基
因也不缺失。
4 结论
本研究用一个多基因植物表达载体，通过农杆
菌介导法，对甘蔗进行遗传转化，获得多个抗性株
系。挑取其中的 23 株进行单基因多次 PCR，与多
重 PCR 进行检测。结果证明同其他作物一样，甘蔗
一次多基因遗传转化也是可行的。然而一次多基因
遗传转化会出现基因遗失现象，插入区域基因越多，
片段越长，缺失现象就越严重。因此必须在遗传转
化与筛选的过程中获得较大数量的抗性植株，才能
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 14 15 16 17 18 19 20 21 22 2313
bar Gene Gene 1 Gene 2 Gene 3
1-23 ：生根筛选培养后的抗性植株
图 7 DNA 片段插入与缺失
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2016,Vol.32,No.1108
从中筛选到所有目的基因未缺失，表达稳定，有应
用价值的转基因株系。
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（责任编辑 马鑫）