全 文 ：·技术与方法·
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2015, 31(7):69-75
收稿日期 ：2015-02-03
基金项目 ：贵州省中药攻关项目（黔科合 ZY［2011］3008 号），贵州省高层次人才特助经费（TZJF-2010-053 号）
作者简介 ：钱志瑶，女，硕士研究生，研究方向 ：中药资源及质量评价 ；E-mail ：15285135995@163.com
通讯作者 ：覃容贵，女，博士，教授，研究方向 ：中药资源及质量评价 ；E-mail ：1346812934@qq.com
宽 叶 缬 草（Valeriana officinalis L.var. latifolia
Miq）是败酱科（Valerianaceae）缬草属（Valeriana
Linn）植物，具有安心神、祛风湿、行气血、止痛
的功效，主治心神不安、心悸失眠、血狂、脏躁、
风湿痹痛、脘腹胀痛、痛经、经闭、跌打损伤等作
用［1，2］。贵州地区山多，气候温和，山阴多潮湿，
具有得天独厚的区域优势和自然条件，是缬草生长
最好的地理环境［3］。贵州缬草产业的主打产品就是
黔产宽叶缬草 ISSR 反应体系的建立与优化
钱志瑶 周道堂 黄秀平 周镁 陈祖云 覃容贵
（贵州医科大学药学院，贵阳 550004）
摘 要 ： 旨在建立稳定、可靠的宽叶缬草 ISSR 反应体系。以 10 个水平单因素试验为基础，应用 L16（4
5）正交设计对反应
体系中 4 个主要因子在 4 个水平上进行组合优化，并采用直观法、极差法和方差法对试验结果进行分析 ；利用优化的反应体系，
筛选引物以及最佳退火温度 ；同时，以 9 份不同产地宽叶缬草样品对反应体系进行稳定性检测。结果显示，宽叶缬草 25 μL ISSR
最佳反应体系为 ：2.5 μL 10×Taq Buffer，2.0 mmol/L Mg2+，0.28 mmol/L dNTPs，0.3 μmol/L 引物，1.75 U Taq DNA 聚合酶，60 ng
DNA 模板，ddH2O 补齐 ；影响大小依次是 ：Mg
2+ > 引物 >dNTPs>Taq DNA 聚合酶 ；确定了各引物的最佳退火温度以及筛选出扩增
条带清晰稳定的 17 条 ISSR 引物 ；稳定性实验表明，该体系稳定可靠。优化出宽叶缬草 ISSR 最佳反应体系并筛选出理想的引物。
关键词 ： 宽叶缬草 ；ISSR ；单因素试验 ；正交设计 ；体系优化
DOI ：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.07.011
Establishment and Optimization of ISSR Reaction System for Valeriana
officinalis L. var. latifolia Miq of Guizhou Province
Qian Zhiyao Zhou Daotang Huang Xiuping Zhou Mei Chen Zuyun Qin Ronggui
（School of Pharmacy，Guizhou Medical University，Guiyang 550025）
Abstract: This study is to establish a stable and reliable ISSR system for Valeriana officinalis L.var. latifolia Miq. Based on the single
factor experiment in 10 levels, L16（4
5）orthogonal design was applied to conduct combinatorial optimization in 4 levels of 4 major factors,
and the results were analyzed by visual method, range analysis and variance method. The primer and the optimal annealing temperature were
screened by optimized reaction system. The stability and reliability of this system were tested by 9 samples from different origins. The optimal
ISSR conditions in the experiments were as following: in 25 μL reaction system containing 2.5 μL 10×Taq Buffer, 2.0 mmol/L Mg2+, 0.28 mmol/
L dNTPs, 0.3 μmol/L primer, 1.75 U Taq DNA polymerase, 60 ng DNA template, and ddH2O completed. The order of the effect by the factors
was in Mg2+ > primer > dNTP s > Taq DNA polymerase. The optimal annealing temperature for each primer was determined, and 17 primers
with distinct and stable amplified bands were screened. Stability test showed that the optimized system was stable and reliable. By this study we
may reach the conclusion that the optimal ISSR reaction system for V. officinalis var. latifolia was generated, and the desired primers also were
screened, which may provide the technical foundation for the application of ISSR molecular marker technology in the study of genetic diversity of V.
officinalis var. latifolia.
Key words: Valeriana officinalis L. var. latifolia Miq ；ISSR ；single factor experiment ；orthogonal design ；optimization
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.770
缬草油，宽叶缬草油利用价值高，用途广，国外已
有大面积栽培宽叶缬草［4，5］。近年来，由于野生宽
叶缬草供不应求，引种栽培成为市场上宽叶缬草的
主要来源之一，但是，贵州缬草自人工栽培以来，
普遍存在品种退化、产油率降低的问题。在前期的
黔产宽叶缬草 RAPD 遗传多样性的分析研究中，发
现贵州省不同地域栽培的宽叶缬草与野生宽叶缬草
基因组 DNA 之间具有明显的差异，统计分析也表明
黔产宽叶缬草的变异与地域有关，地域差异和生长
环境的不同，可能导致栽培宽叶缬草的遗传信息发
生了改变，最终导致其基因变异。
反向简单重复序列区间多态性分子标记（Inter-
simple sequence repeat，ISSR） 是 一 种 在 微 卫 星 技
术基础上创建起来的简单序列重复区间扩增多态
性 DNA 分子标记［6］。ISSR 分子标记产物的多态性
远比 SSR、RFLP、RAPD 丰富，可以提供更加丰富
的基因组信息，且精确度高、检测非常方便、所需
DNA 模板的量少、操作简单、稳定性较高等优点，
被广泛适用于不同物种遗传多样性与亲缘关系的研
究［7，8］。为了保证引种栽培宽叶缬草的最佳质量，
探讨其不同产地栽培与野生宽叶缬草遗传相似性，
为宽叶缬草资源开发和人工种植提供有参考价值的
实验依据，本研究就 ISSR 分子标记的反应体系进行
优化与分析，旨在找到最佳适用于黔产宽叶缬草的
ISSR 反应体系，为分析黔产宽叶缬草种质资源的遗
传多样性和亲缘关系奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
试验所用宽叶缬草由贵州省江口苗药生物科技
有限公司提供，经贵阳医学院覃容贵教授鉴定为败
酱科缬草属植物宽叶缬草。
DNAsecure 新型植物基因组 DNA 提取试剂盒、
DNA Marker DL2000，北京天根生化科技有限公司提
供 ；Taq DNA 聚合酶、dNTPs、Mg2+、GoldView Ⅰ核
酸染色剂、50×TAE 缓冲液等，北京索莱宝公司提
供 ；ISSR 引物参照加拿大哥伦比亚大学（UBC）公
布的引物序列，上海生工合成。
DYY-6C 电 泳 仪， 北 京 市 六 一 仪 器 厂 ；
BIOMATE 3S 核 酸 蛋 白 分 析 仪， 美 国 thermo Fisher
Scientific ；S1000PCR 扩增仪，美国 BIO-RAD ；凝胶
成像仪，香港 Gene Company Limited。
1.2 方法
1.2.1 基因组 DNA 的提取及检测 以宽叶缬草嫩叶
为材料，采用试剂盒法提取基因组 DNA ；核酸蛋白
分析仪检测纯度及浓度 ；0.8% 琼脂糖电泳检测完整
性 ；提取原液 -20℃保存，用于 PCR 反应体系的优
化试验。
1.2.2 单因素试验 参考相关文献［9，10］，确定宽叶
缬草初始 ISSR 反应体系 ：总体积 25 μL，包含 2.5
μL 10×Taq Buffer，1.5 mmol/L Mg2+，0.24 mmol/L
dNTPs，0.5 μmol/L 引 物，1.25U Taq DNA 聚 合 酶，
60 ng DNA 模板，ddH2O 补齐 ；单因素试验时，采
用变化单一因素，其他因素不变的方法，以确定该
因素对 ISSR 结果的影响［11］，每个因素设置 10 个梯
度浓度水平，见表 1。PCR 反应程序 ：94℃预变性 5
min ；然后按 94℃变性 30 s，55.6℃退火 45 s，72℃
延 伸 1.5 min， 进 行 35 个 循 环 ；最 后 72℃ 延 伸 10
min ；4℃保存。选择预试验中扩增效果较好的引物
UBC807，对宽叶缬草基因组 DNA 进行 ISSR 扩增，
PCR 产物于 1.8% 琼脂糖凝胶上，100 V 恒压电泳 1 h，
凝胶成像系统观察并拍照。
表 1 ISSR 单因素试验条件设计
水平
因素
DNA/
ng
Mg2+/
mmol/L
dNTPs/
mmol/L
Taq DNA
聚合酶 /U
引物 /
μmol/L
1 10 1.00 0.12 0.50 0.20
2 20 1.25 0.16 0.75 0.30
3 30 1.50 0.20 1.00 0.40
4 40 1.75 0.24 1.25 0.50
5 50 2.00 0.28 1.50 0.60
6 60 2.25 0.32 1.75 0.70
7 70 2.50 0.36 2.00 0.80
8 80 2.75 0.40 2.25 0.90
9 90 3.00 0.44 2.50 1.00
10 100 3.25 0.48 2.75 1.10
1.2.3 正交试验 根据单因素试验结果，确定因素
Mg2+、dNTPs、引物、Taq DNA 聚合酶为正交试验因子，
并选择各因素有效的扩增范围，采用 L16（4
5）正交
试验设计，以直观法、极差法及方差法相结合的统
计分析方式（表 2）考察各因素间的相互作用对反
2015,31(7) 71钱志瑶等 ：黔产宽叶缬草 ISSR 反应体系的建立与优化
应体系的影响，确定宽叶缬草最佳 ISSR 反应体系。
反应体系与扩增程序沿用单因素试验所用条件。
1.2.4 退火温度及引物的筛选 以最佳 ISSR 反应体
系，引物 Tm±5℃的梯度扩增模式［12］，自动生成以
引物 Tm 值为中心的 10 个梯度退火温度，从中确定
最佳退火温度。在对引物退火温度筛选的同时，从
50 条候选 ISSR 引物中筛选出稳定的、多态性好的
宽叶缬草 ISSR 引物。
1.2.5 反应体系稳定性检测 以最佳 ISSR 反应体系
为基础，采用 UBC807 引物对 9 份不同地区的宽叶
缬草样品进行扩增，检测反应体系的稳定性。
2 结果
2.1 基因组DNA的质量检测
核 酸 蛋 白 分 析 仪 检 测 所 提 宽 叶 缬 草 基 因 组
DNA，OD260/280 比 值 在 1.70-1.90 之 间， 纯 度 较 好，
浓度在 50.00-85.00 μg/mL 之间 ；琼脂糖电泳检测结
果（图 1）显示，DNA 的主带清晰明亮，无降解现象，
点样孔无杂质，即基因组 DNA 的完整性较好。结果
说明所提样本 DNA 可用于 ISSR 体系的构建及后续
的试验。
表 2 ISSR 正交试验水平
水平
Mg2+/
mmol/L
dNTPs
mmol/L
Taq DNA
聚合酶 /U
引物
μmol/L
1 1.50 0.16 0.75 0.20
2 2.00 0.20 1.25 0.30
3 2.50 0.24 1.75 0.40
4 3.00 0.28 2.25 0.50
表 3 ISSR 正交试验计划表
实验号
Mg2+/
mmol/L
dNTPs/
mmol/L
Taq DNA
聚合酶 /U
引物 /
μmol/L
评分
1 1.5 0.16 0.75 0.2 12
2 1.5 0.20 1.25 0.3 10
3 1.5 0.24 1.75 0.4 8
4 1.5 0.28 2.25 0.5 6
5 2.0 0.16 1.25 0.4 9
6 2.0 0.20 0.75 0.5 6
7 2.0 0.24 2.25 0.2 10
8 2.0 0.28 1.75 0.3 15
9 2.5 0.16 1.75 0.5 5
10 2.5 0.20 2.25 0.4 9
11 2.5 0.24 0.75 0.3 10
12 2.5 0.28 1.25 0.2 13
13 3.0 0.16 2.25 0.3 6
14 3.0 0.20 1.75 0.2 0
15 3.0 0.24 1.25 0.5 5
16 3.0 0.28 0.75 0.4 7
k1 9.00 8.00 8.75 8.75
k2 10.00 6.25 9.25 10.25
k3 9.25 8.25 7.00 8.25
k4 4.50 10.25 7.75 5.50
R 5.50 4.00 2.25 4.75
M 1 2 3
2000
bp
1000
750
500
250
100
图 1 DNA 检测电泳图
2.2 单因素试验结果与分析
2.2.1 DNA 模板浓度对反应体系的影响 模板 DNA
的浓度设置在 10-100 ng/25 μL，共 10 个梯度，从
图 2 可观察，所扩增出的条带在清晰度与条带数上
达到一致，并无明显的变化，即模板 DNA 的浓度在
10-100 ng/25 μL 之间时，对宽叶缬草 ISSR 反应体系
无明显影响，故 DNA 模版浓度的大小在正交试验中
不予作为考察对象。
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
2000
bp
1000
750
500
250
100
图 2 DNA 浓度对 ISSR 反应体系的影响
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.772
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
2000
bp
1000
750
500
250
100
图 5 Taq DNA 聚合酶浓度对 ISSR 反应体系的影响
2.2.2 Mg2+ 浓度对反应体系的影响 由图 3 可知，
在 Mg2+ 浓度小于 1.75 mmol/L 时，所扩增的条带数
较 少 ；Mg2+ 浓 度 在 1.75-2.5 mmol/L 时， 大 部 分 扩
增条带稳定、清晰、明亮 ；在 Mg2+ 浓度大于 2.75
mmol/L 时， 扩 增 条 带 变 少， 且 不 稳 定， 不 清 晰。
Mg2+ 作为 ISSR 反应中的一个主要因素，不仅会影
响 Taq DNA 聚合酶的活性，还能与反应体系中的
dNTPs、模板 DNA 及引物结合，影响引物与模板的
结合率，同时 Mg2+ 浓度太高或太低都可能导致扩增
不完全或无扩增。由结果可知，宽叶缬草 ISSR 反应
体系中 Mg2+ 的浓度在 1.75-2.5 mmol/L 时为最佳扩增
浓度范围。
原料，其浓度直接影响扩增产物的生成，dNTPs 浓
度 不 足 时，DNA 合 成 速 率 低，dNTPs 过 早 耗 尽 而
使产物单链化，扩增效果差 ；dNTPs 浓度过高时，
容易与 Mg2+ 结合而降低游离 Mg2+ 浓度，从而影响
Taq DNA 聚合酶的活性。dNTPs 的浓度过低或过高
都不能得到有效的扩增。因此，dNTPs 的浓度在
0.20-0.28 mmol/L 为宽叶缬草 ISSR 反应的有效扩增
浓度。
2.2.4 Taq DNA 聚合酶浓度对反应体系的影响 对
ISSR 的 Taq DNA 聚合酶浓度这一单因子进行试验，
结 果（ 图 5） 显 示， 当 Taq DNA 聚 合 酶 的 浓 度 在
0.5 U/25 μL 时，扩增出的条带弱且少 ；当浓度为
0.75-1.750 U 时，扩增条带数增加，条带清晰 ；Taq
DNA 聚合酶的浓度继续增大时，扩增条带变得模糊，
不易区分。Taq DNA 聚合酶是 ISSR 反应的关键因素，
用量过多时会引起非特异性扩增，有时甚至会出现
比较重的背景，影响扩增结果，用量过少导致扩增
产物减少 ；同时，它还受 Mg2+ 浓度及 dNTPs 浓度大
小的综合影响。故本试验将 0.75-1.750 U/25 μL Taq
DNA 聚合酶浓度定为宽叶缬草 ISSR 反应体系的有
效扩增浓度。
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
2000
bp
1000
750
500
250
100
图 3 Mg2+ 浓度对 ISSR 反应体系的影响
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
2000
bp
1000
750
500
250
100
图 4 dNTP 浓度对 ISSR 反应体系的影响
2.2.5 引物浓度对反应体系的影响 由图 6 可知，
当引物浓度为 0.20-0.40 μmol/L 间时，为有效扩增，
扩增条带多且清晰，反之，当引物浓度过高时，扩
增条带不稳定，条带变模糊。实验在确保 PCR 产率
的前提下，确定较低引物浓度 0.20-0.40 μmol/L 为有
效扩增引物浓度，其结果稳定，重现性较好。
2.3 正交试验结果与分析
2.3.1 正交直观分析 根据 5 因素 4 水平正交设
2.2.3 dNTPs 浓度对反应体系的影响 对 dNTPs 的
10 个不同浓度分别进行了 PCR 扩增，如图 4 所示，
dNTPs 在 低 浓 度 为 0.12、0.16 mmol/L 时，PCR 的
产率低，条带亮度不足 ；而 dNTPs 的浓度在 0.20-
0.28 mmol/L 时，条带明亮，清晰且稳定 ；当 dNTPs
的浓度较高为 0.32-0.48 mmol/L 时，未得到有效扩
增，条带少，甚至无条带。dNTPs 是 ISSR 扩增的
2015,31(7) 73钱志瑶等 ：黔产宽叶缬草 ISSR 反应体系的建立与优化
计，共有 16 个试验组合，PCR 扩增结果见图 3，16
个组合间存在明显差异，14 号组合效果最差，没
有扩增出条带 ；6 号、9 号和 15 号组合扩增出少量
条带，但部分条带带型不完整，不易识别，清晰度
差 ；2 号，3 号、4 号、5 号、7 号、10 号、11 号、
13 号以及 16 号组合扩增条带数相对多，但条带清
晰度不高，其中 2 号、7 号和 13 号组合的背景弥散
严重 ；1 号、8 号和 12 号组合扩增效果相近，扩增
出的条带数最多，清晰，宜于区分，但又以 8 号组
合效果最好，条带较其余组合明亮。综合以上分析，
确定选用 8 号为最佳组合，即 25 μL 总体积，包含
2.5 μL 10×Taq Buffer，2.0 mmol/L Mg2+，0.28 mmol/L
dNTPs，1.75 U Taq DNA 聚 合 酶，0.3 μmol/L 引 物，
60 ng DNA 模板，ddH2O 补齐。
就越大。根据表 3 的 R 值判断 4 个因素对黔产宽叶
缬草 ISSR 反应体系的影响大小顺序为 ：Mg2+ > 引物
>dNTPs>Taq DNA 聚合酶 ；最佳因素水平组合为 ：
Mg2+ k2（2.0 mmol/L）、dNTPs k4（0.28 mmol/L）、Taq
DNA 聚合酶 k2（1.25 U）、引物 k2（0.3 μmol/L）。
2.3.3 正 交 方 差 分 析 实 验 数 据 用 SPSS17.0 进
行方差分析，表 4 所示，由 F 值大小可知影响宽
叶缬草 ISSR 反应体系的大小次序为 ：Mg2+ > 引物
>dNTPs>Taq DNA 聚合酶，与极差分析的结果相一致，
其中 Taq DNA 聚合酶的浓度大小对反应体系的影响
最小。在 α=0.05 水平各因素水平间的差异对扩增结
果没有达到显著水平。
表 4 宽叶缬草 ISSR 反应体系各因素方差分析
变异来源 平方和 自由度 均方 F 值 P 值
Mg2+ 74.688 3 24.896 2.320 0.254
dNTPs 32.187 3 10.729 1.000 0.500
Taq DNA 聚合酶 12.188 3 4.063 0.379 0.777
引物 47.187 3 15.729 1.466 0.380
误差 32.188 3 10.729
总计 198.438 15
综合直观分析、极差分析与方差分析的结果，
确定宽叶缬草 ISSR 最佳反应体系组合为正交试验 8
号 ：2.0 mmol/L Mg2+，0.28 mmol/L dNTPs，0.3 μmol/L
引物，1.75 U Taq DNA 聚合酶。
2.4 退火温度及引物的筛选
50 个候选 ISSR 引物以 10 个梯度 Tm±5℃退火
温度进行扩增。结果（表 5）表明，不同退火温度
的扩增带型间具有差异，选择重复性好、扩增条带
清晰的退火温度为最佳退火温度。
2.5 ISSR体系稳定性检测
通过对 9 份不同产地宽叶缬草样品进行扩增，
结果（图 8）显示，9 份样品均得到有效扩增，扩增
所得条带清晰，即所建立的黔产宽叶缬草 ISSR 反应
体系稳定。
3 讨论
ISSR 分子标记技术建立在 PCR 的基础上，受模
板 DNA、Taq DNA 聚 合 酶、 引 物、Mg2+ 和 dNTPs5
个因素的影响［13，14］。任伟等［11］通过单因素试验确
2.3.2 正交极差分析 在对 L16（4
5）正交试验的
16 个组合进行直观观察时，并根据扩增条带的多少
及强弱、清晰度及背景强度 4 个指标进行计分，每
项 4 分共计 16 分。对统计结果进行极差分析，极
差用 R 值表示，R 值越大，反应因素对体系的影响
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 M
2000
bp
1000
750
500
250
100
图 7 正交试验 PCR 扩增结果
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
2000
bp
1000
750
500
250
100
图 6 引物浓度对 ISSR 反应体系的影响
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.774
定了朝鲜碱茅的最佳 ISSR 扩增反应体系，但 ISSR
反应体系是一个因素间相互效应的组合，仅通过单
因素试验直观确定最佳反应体系，具有一定的不稳
定性。包蕊等［15］、欧立军等［16］、代文娟等［17］利
用正交设计分别确定了华扁穗草、天门冬及广西火
桐的 ISSR 最佳反应体系，正交设计可以使各因素快
速的组合，确定最佳反应体系，但在因素水平的选
取上存在一定的不确定性。本研究采用单因素试验，
首先确定各个因素的有效扩增浓度范围，再通过正
交试验确定因素最佳水平组合，这种单因素试验与
正交试验相结合的方法，不仅可以克服正交试验因
素水平的难以确定问题，还可以避免单因素试验顾
此失彼的缺点，明确、均衡、综合性的确定各个试
验因素，以最有效的方式在最短的时间内找到最优
的试验水平组合。目前，两面针［14］、锁阳［18］、阳
春砂［19］等多种药用植物利用单因素与正交设计相
结合的方法，优化得到准确稳定的 ISSR 反应体系。
本次实验中，尽管正交设计的各因素的水平都
是基于单因素的有效扩增浓度范围内，但不同的组
合对宽叶缬草的 ISSR 扩增结果影响也是比较大的，
通过对扩增谱图的直观分析以及统计学的极差分析
与方差分析，使分析结果相对以往的 PCR 反应体系
优化更科学、完善。极差分析中所确立的最佳 ISSR
反应体系组合，与直观分析中所确立的最佳水平组
合仅 Taq DNA 聚合酶的浓度不一致，但极差分析与
方差分析的结果显示，Taq DNA 聚合酶浓度并不是
反应体系的主要影响因素。方差分析结果显示，各
个影响因素的 P 值都大于 0.05，说明各影响因素在
水平范围内对反应体系都存在不显著影响，这可能
是因为通过单因素试验确立了各因素有效扩增的浓
度范围的原因。
ISSR 分子标记适用于物种的遗传多样性分析，
但不同的物种其 ISSR 体系也有一定的差异。单因素
试验结果表明，模板 DNA 浓度大小对黔产宽叶缬草
ISSR 的扩增影响不明显，DNA 的浓度对扩增的效果
不显著，这与吴鸣谦［20］建立的拟茎点霉最佳 ISSR
反应体系的结论相似。本研究同时也发现，黔产宽
叶缬草 ISSR 扩增的因素影响大小依次是 ：Mg2+ > 引
物 >dNTPs>Taq DNA 聚合酶，而在节瓜［9］ 的 ISSR
体系研究中，认为因素 dNTPs 是影响最大的因子 ；
而薰衣草［21］的 ISSR 优化体系的相对影响程度从大
到小依次为 ：Mg2+、dNTPs、引物和 DNA 浓度。基
于研究结果，表明优化黔产宽叶缬草的 ISSR 反应体
系是十分必要的，不仅建立了专属于黔产宽叶缬草
ISSR 反应体系，同时也为同种、其他来源的宽叶缬
草的相关研究提供实验依据。
在进行某物种的 ISSR 分子标记研究时，一个稳
定、有效的扩增体系是基础，而适合该物种的 ISSR
引物就是研究的前提［16，22］。在筛选引物的工作中，
退火温度能明显地影响扩增条带的特异性［23］，甚至
是条带的有无，不同引物有着各自的退火温度，因
此，对不同引物退火温度的优化筛选是一项非常必
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9
2000
bp
1000
750
500
250
100
图 8 9 份不同产地宽叶缬草样品扩增结果
表 5 备选的 ISSR 引物
编号 引物名称 序列 退火温度 /℃
1 807 AGAGAGAGAGAGAGAGT 55.6
2 808 AGAGAGAGAGAGAGAGC 58.8
3 809 AGAGAGAGAGAGAGAGG 58.8
4 810 GAGAGAGAGAGAGAGAT 55.6
5 811 GAGAGAGAGAGAGAGAC 53.2
6 812 GAGAGAGAGAGAGAGAA 52.7
7 824 TCTCTCTCTCTCTCTCG 50.4
8 826 ACACACACACACACACC 58.8
9 827 ACACACACACACACACG 56.1
10 830 TGTGTGTGTGTGTGTGG 56.1
11 834 AGAGAGAGAGAGAGAGYT 58.8
12 835 AGAGAGAGAGAGAGAGYC 58.1
13 836 AGAGAGAGAGAGAGAGYA 58.8
14 840 GAGAGAGAGAGAGAGAYT 57.6
15 841 GAGAGAGAGAGAGAGAYC 59.6
16 842 GAGAGAGAGAGAGAGAYG 59.6
17 848 CACACACACACACACARG 59.6
注 ：R =（A，G）；Y =（C，T）
2015,31(7) 75钱志瑶等 ：黔产宽叶缬草 ISSR 反应体系的建立与优化
要的工作，也是引物筛选的必要前提。本研究以优
化的最佳 ISSR 反应体系对 50 条候选引物的退火温
度进行一一筛选，以确保每一条引物扩增条带稳定，
重现性好并且清晰，同时通过 ISSR 体系的验证试验，
为应用 ISSR 分子标记技术进行黔产宽叶缬草的遗传
多样性研究奠定技术基础。
4 结论
在 单 因 素 实 验 中， 确 立 了 模 板 DNA、Mg2+、
dNTPs、引物、Taq DNA 聚合酶这 5 个主要影响黔
产宽叶缬草 ISSR 扩增的有效浓度范围，并在此基础
上通过正交设计实验得到适合宽叶缬草的 ISSR 反应
体系：总体积 25 μL，包含 2.5 μL 10×Taq Buffer，2.0
mmol/L Mg2+，0.28 mmol/L dNTPs，0.3 μmol/L 引 物，
1.75 U Taq DNA 聚合酶，60 ng DNA 模板，ddH2O 补
齐。所建立的 ISSR 反应体系适用于黔产宽叶缬草的
ISSR 扩增。
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（责任编辑 狄艳红）