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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2015, 31(11):153-158
AP2/ERF（APETALA2/ethylene response factor）
是植物中特有的一类转录因子大家族，因含有由
60-70 个氨基酸组成的 AP2/ERF 结构域而得名，包
含 AP2、RAV、ERF、DREB 和其他类别共 5 个亚家
族［1］。1994 年第一个 AP2 基因从拟南芥（Arabidopsis
thaliana）中分离［2］，1995 年从烟草中分离出乙烯
响应元件结合蛋白（Ethylene-inducible DNA binding
proteins）ERF1、2、3、4， 含 有 保 守 的 ERF 结 构
收稿日期 ：2015-02-04
基金项目 ：国家自然科学基金资助项目（31360486）
作者简介 ：郭呈宇，男，博士研究生，研究方向 ：植物分子生物学及基因工程 ；E-mail ：gcynmg@126.com
通讯作者 ：牛一丁，男，副教授，研究方向 ：植物分子生物学及基因工程 ；E-mail ：ydniu@imu.edu.cn
甜瓜 CmERFIII-1 转录因子基因 cDNA 的克隆与
表达分析
郭呈宇1，2  孙晓蕾1  邵琪1  白立华2  牛一丁1  哈斯阿古拉1
（1. 内蒙古大学生命科学学院 内蒙古自治区牧草与特色作物生物技术重点实验室，呼和浩特 010021 ；
2. 巴彦淖尔市农牧业科学研究院，巴彦淖尔 015000）
摘 要 ： 根据甜瓜 ERF 亚家族成员聚类结果，选取第三亚群的 CmERFIII-1（甜瓜基因组数据库登录号 MELO3C005465）
基因为研究对象，根据其 cDNA 序列设计基因特异引物，应用 RT-PCR 技术从甜瓜品种河套蜜瓜果实的总 RNA 中克隆得到
CmERFIII-1 基因 cDNA，序列长 711 bp，编码 236 个氨基酸组成的多肽。序列比对及系统发育分析表明，CmERFIII-1 cDNA 编码
的蛋白质氨基酸序列与黄瓜中 ERF 亚家族两个成员的序列（GenBank 登录号 ：XP_004143677.1、XP_004158119.1）亲缘关系最
近。实时荧光定量 PCR 分析结果表明，该基因在甜瓜根、茎、叶和授粉后不同时期果实中均有不同程度表达，在叶片中表达量
最高。
关键词 ： 甜瓜 ；ERF ；转录因子 ；表达分析
DOI ：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.11.020
Cloning and Expression Analysis of the Ethylene-responsive
Transcription Factor III-1 Gene cDNA from Melon（Cucumis melo）
Guo Chengyu1，2 Sun Xiaolei1 Shao Qi1 Bai Lihua2 Niu Yiding1 Hasi Agula1
（1. College of Life Sciences，Inner Mongolia University，Inner Mongolia Key Laboratory of Herbage & Endemic Crop Biotechnology，
Hohhot 010021 ；2. Bayannaoer Academy of Agricultural and Animal Science，Bayannaoer 015000）
Abstract: According to the clustering results of the ERF subfamily in melon, CmERFIII-1（accession ID ：MELO3C005465）was
chosen to be studied. A pair of specific primers was designed based on the cDNA of CmERFIII-1. The full-length cDNA of CmERFIII-1 was
cloned by RT-PCR from the fruit of melon（Cucumis melo L. cv. Hetao）.The length of cDNA was 711 bp, encoding 236 amino acids. Sequences
analysis and the phylogenetic trees showed that the protein amino acid sequence of CmERFIII-1 was closely related to two ERF subfamily
member of Cucumis sativus（GeneBank ID ：XP_004143677.1、XP_004158119.1）. The Real-time quantitative RT-PCR assay showed
CmERFIII-1 gene was expressed and its expression levels were different in tissues of the plant and fruits of different developmental stages . The
expression level of this gene was highest in leaf.
Key words: melon ；ERF ；transcription factor ；expression analysis
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.11154
域［3］。研究发现 AP2/ERF 家族中的成员参与植物
生长、发育以及多种胁迫下的多种生物学过程，包
括花发育［4］、果实发育［5］、种子发育［6］、病菌防
御［7］、高盐和干旱［8］等环境胁迫响应。同时，发现
AP2/ERF 转录因子家族成员参与乙烯、脱落酸、茉
莉酸、水杨酸等多种信号转导途径，并且一些家族
成员是逆境信号交叉途径中的连接因子［9，10］。目前，
拟南芥［11］、水稻［12］、甘蓝型油菜［13］、番茄［14］、桃［15］
等多种植物 ERF 家族基因的 cDNA 被克隆。Mizuno
等［16］利用酵母单杂交技术从甜瓜中分离出与 CM1-
ACS2 启动子上游 GCCGAC 序列相互作用的 3 个转
录 因 子 ——CMe-DREBl、CMe-ERF1、CMe-ERF2。
高峰等［17］从甜瓜中克隆获得 CMeERF1、CMeERF2
的 cDNA。Ma 等［18］对甜瓜 AP2/ERF 转录因子家族
基因进行了鉴定，得到 136 个成员，包括 AP2 亚家
族 13 个、ERF 亚 家 族 119 个、RAV 亚 家 族 4 个 ；
对 ERF 亚家族的 119 个成员进行聚类分析，将其
分为 11 个亚群。本研究选取其第三亚群的第一个
成员 CmERFIII-1，其在甜瓜基因组数据库（https ：//
melonomics.net）中的登录号为 MELO3C005465，克
隆其 cDNA，分析不同组织中的表达情况，旨在为
进一步研究该基因的功能提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料
植物材料为甜瓜品种“河套蜜瓜”原种，由本
实验室保存，种植于大田，采摘授粉后 30 d 的甜瓜
果实，取中果皮组织于液氮中速冻，-80℃保存，用
于基因克隆。采摘授粉后 0、10、20、30 和 40 d 的
甜瓜果实，取中果皮组织速冻于液氮中，-80℃保存，
用于不同发育阶段果实中基因的表达分析。分别取
培养于 1/2 MS 培养基 35 日龄河套蜜瓜无菌苗的根、
茎和叶片组织，速冻于液氮中，-80℃保存，用于不
同组织器官中基因的表达分析。
大 肠 杆 菌 E.coli DH5α 由 本 实 验 室 保 存。
pEASY®-Blunt 克 隆 载 体 购 自 北 京 全 式 金 公 司。
总 RNA 提 取 试 剂 盒 RNAiso Plus、 反 转 录 试 剂
盒 PrimeScriptTM II 1st Strand cDNA Synthesis Kit、
PrimeScriptTM Master Mix Perfect Real Time 及 实 时 荧
光 定 量 PCR 试 剂 盒 SYBR® Premix Ex Taq II、 高 保
真 DNA 聚 合 酶 PrimeSTAR® GXL DNA Polymeras、
dNTPs、氨苄青霉素、DNA Marker 等购自宝生物工
程（大连）有限公司 ；PCR 产物纯化试剂盒购自上
海生工生物工程有限公司 ；其余试剂为进口或国产
分析纯。
1.2 方法
1.2.1 总 RNA 提取 使用 RNAiso Plus 总 RNA 提取
试剂盒，按照说明书提取甜瓜根、茎、叶和不同发
育阶段甜瓜果实的总 RNA。
1.2.2 引 物 设 计 与 合 成 根 据 已 报 道 的
CmERFIII-1 基 因 cDNA 序 列， 使 用 Primer Premier
5.0 软 件 设 计 特 异 性 引 物。 上 游 引 物 P1 序 列 ：
5-CATAACCAATCAACCAATTCC-3， 下 游 引 物 P2
序列 ：5-TTATATGACTGTGCATTGAGGAT-3，引物
由上海生工生物工程有限公司合成。
1.2.3 cDNA 克隆 取采摘授粉后 30 d 甜瓜果实的
总 RNA 5 μg，按照反转录试剂盒 PrimeScriptTM II 1st
Strand cDNA Synthesis Kit 说明书进行反转录反应，
得到 cDNA 第一链。
以合成的 cDNA 第一链为模板，用高保真 DNA
聚合酶 PrimeSTAR® GXL DNA Polymeras 进行 PCR 扩
增。PCR 反应条件为 ：98℃预变性 10 s，49℃退火
15 s，68℃延伸 1 min，扩增 30 个循环 ；68℃延伸
10 min。PCR 产物经 1.2% 的琼脂糖凝胶电泳检测。
扩增片段用 San-prep 型柱式 PCR 产物纯化试剂盒
纯化。纯化产物与 pEASY®-Blunt 载体连接。连接物
转化到大肠杆菌 DH5α 中，在 Amp 抗性培养基上筛
选出阳性克隆并经 PCR 鉴定，随机选取 3 个独立的
重组克隆由上海生工生物工程有限公司测序。利用
DNAStar 软件比对测序序列与甜瓜基因组数据库中
目的基因 cDNA 序列（登录号 ：MELO3C005465）。
1.2.4 编码蛋白质分析 利用 NCBI 的 ORF Finder
软 件（http ：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html） 对
CmERFIII-1 序列进行开放阅读框分析。利用 ExPaSy
ProtParam（http ：//web.expasy.org/ protparam/）、
ExPASy ProtScale（http ：// web.expasy.org/cgi-bin/
protscale/ protscale.pl）、PredictProtein（http ：//www.
predictprotein.org/）、SWISS-MODEL（http ：//swwiss-
model.expasy.org/）对编码蛋白质进行理化性质、亲
2015,31(11) 155郭呈宇等：甜瓜CmERFIII-1 转录因子基因 cDNA的克隆与表达分析
疏水性、蛋白质二级结构、蛋白质结构域的空间结
构分析。利用 NCBI 的 protein blast 程序（http：//blast.
ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）进行同源比对分析，查找
与预测的 CmERFIII-1 蛋白序列一致性较高的蛋白质
序 列， 利 用 MEGA5.1 软 件 中 的 Neighbor-Joining 算
法进行聚类分析。
1.2.5 基因表达分析 利用 PrimeScriptTM Master Mix
Perfect Real Time 反转录试剂盒，分别以河套蜜瓜
根、 茎、 叶 和 授 粉 后 0、10、20、30 和 40 d 的 甜
瓜果实总 RNA 为模板进行反转录反应，将合成的
cDNA 第一链用 SYBR® Premix Ex Taq II 实时荧光定
量 PCR 试剂盒进行。根据测序结果设计 CmERFIII-1
基因的实时荧光定量 PCR 引物，上下游引物分别为
5-TACTCTGTAGGATCGGCGGTT-3 和 5-GCGGTA-
TCATAAGTTCCAAGCC-3。以甜瓜 GAPDH（登录号：
MELO3C002342T1）基因为内参基因，上下游引物
分 别 为 5-CGTGTTCCTACCGTTGATGTCTCT-3 和
5-TCAGTGTACCCCAAAATTCCCTTC-3。 以 反 转 录
产物为模板建立 25 μL PCR 扩增体系 ：加入 SYBR®
Premix Ex Taq II（Tli RNaseH Plus）（2×）12.5 μL，
上游、下游引物各 1 μL，模板 2 μL，ddH2O 8.5 μL，
混匀。PCR 反应条件 ：95℃预变性 30 s ；95℃ 5 s，
60℃ 30 s，40 个循环。数据采用 2- △△ CT［19］方法进
行分析，将叶片中 CmERFIII-1 基因表达量设定为 1。
标准误（SE）来自 3 个独立生物学样本，每个生物
学样品进行 3 次技术重复。
2 结果
2.1 cDNA的克隆及序列分析
2.1.1 RT-PCR 产 物 分 析 RT-PCR 扩 增 后 得 到 约
750 bp 的特异性条带（图 1），与预期相符。
2000
bp
1000
750
500
250
100
M 1
图 1 甜瓜 CmERFIII-1 基因 cDNA 扩增

97
172
246
322
397
471
547
621
691
772
*
807
实线框内的氨基酸是预测的 CmERFIII-1 转录因子的蛋白结合区 ；虚线框内的氨基酸是预测的 CmERFIII-1 转
录因子的 DNA 结合区 ；下划线氨基酸序列为该转录因子 AP2/ERF 结构域区域
图 2 河套蜜瓜 CmERFIII-1 基因 cDNA ORF 及推测的氨基酸序列
2.1.2 cDNA 序 列 及 蛋 白 质 一 级 结 构 分 析 将
克 隆 得 到 的 cDNA 序 列 与 甜 瓜 基 因 组 数 据 库 中
MELO3C005465 序 列 比 对， 两 条 序 列 一 致 性 达
100%。克隆到的 CmERFIII-1 cDNA 序列为 711 个核
苷酸，ORF Finder 软件分析结果（图 2）表明，该
基因编码由 236 个氨基酸组成的蛋白质。编码蛋白
质的分子量为 25.99 kD，理论等电点为 8.39，对该
蛋白质的亲疏水性分析表明其为亲水性蛋白质。
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.11156
2.1.3 蛋白质二级结构分析 对 CmERFIII-1 基因
cDNA 所 编 码 蛋 白 质 的 二 级 结 构 分 析， 发 现 α 螺
旋占 12.29%，无规则卷曲占 80.51%，链接部分占
7.21%。 推 测 该 蛋 白 质 序 列 中 第 52、77、79、92、
107、163、165-167、178 和 182 位氨基酸是该转录
因子的蛋白质结合区（protein-binding domain）；第
84-86、85-89、90-95 和 97 位氨基酸是该转录因子
的 DNA 结 合 区（DNA-binding domain）（ 图 2）。 对
蛋白质 GO 功能注释分析发现该蛋白质具有与 DNA
结合的分子功能可信度为 65%，具有转录因子活性
的可信度为 49%，具有与蛋白质结合的分子功能可
信度为 21%。亚细胞定位分析表明该蛋白质定位于
细胞核内。
2.1.4 CmERFIII-1 中 AP2/ERF 结构域的空间结构预
测 对 CmERFIII-1 的 AP2/ERF 结 构 域（ 图 2 中 下
划线氨基酸序列）分析发现，该结构域与拟南芥中
AtERF1［17］的 AP2/ERF 结构域一致性为 80.33%。以
拟南芥中 AtERF1 的 AP2/ERF 结构域（图 3-B）作
为模板，预测 CmERFIII-1 的 AP2/ERF 结构域的空间
结构（图 3-A）。
2.2 系统进化分析
通 过 对 CmERFIII-1 蛋 白 质 与 不 同 物 种 中 同
源蛋白质的比对分析发现，该蛋白氨基酸序列中
AP2/ERF 结构域与多种植物的 ERF 亚家族成员相
似。筛选序列一致性在 40% 以上的 12 条序列，利
用 MEGA5.1 分析并构建聚类关系图（图 4）。12 条
序列分别来自：甜瓜（Cucumis melo）、黄瓜（Cucumis
sativus）、大豆（Glycine max）、樱桃番茄（Solanum
lycopersicum）、 苹 果（Malus domestica）、 油 菜
（Brassica napus）、拟南芥（Arabidopsis thaliana）、葡
萄（Vitis vinifera）、 甘 薯（Coffea canephora）、 猕 猴
桃（Actinidia deliciosa） 和 柑 橘（Citrus clementina）。
克隆到的河套蜜瓜 CmERFIII-1 与 GenBank 中登录
号为 XP_008436974.1 的氨基酸序列一致性为 100%，
与 黄 瓜 的 2 条 氨 基 酸 序 列（GenBank 登 录 号 为
XP_004143677.1 和 XP_004158119.1）序列一致性分
别为 92% 和 88%。
2.3 表达特性分析
利用实时荧光定量 PCR 对 CmERFIII-1 基因在
甜瓜不同组织和果实发育不同时期的表达情况进行
检测。结果（图 5）显示，CmERFIII-1 基因在根、茎、
叶以及果实不同发育时期均有不同程度的表达，在
叶片中的表达量最高。
3 讨论
ERF 是一类植物特有的乙烯应答因子家族，位
于乙烯信号转导途径的下游，含有高度保守的 DNA
结合结构域，与乙烯诱导基因启动子的 GCC-box 结
合来调节一系列乙烯应答基因的转录［3］。拟南芥中
AtERF1 的 AP2/ERF 结构域可以与下游基因启动子
中 GCC-box 相互作用，从而实现对下游基因的表达
调控［20］。本研究对河套蜜瓜 CmERFIII-1 编码蛋白
的结构推测发现，该转录因子的 DNA 结合区位于其
AP2/ERF 结构域内 ；进一步对 CmERFIII-1 的 AP2/
ERF 结构域分析发现，该结构域与拟南芥中 AtERF1
的 AP2/ERF 结构域一致性较高，为 80.33% ；由此
推测该转录因子可能与 AtERF1 具有相似的功能，
即与乙烯诱导基因启动子的 GCC-box 发生相互作
用，调控下游基因的表达。目前对 ERF 亚家族成员
研究发现，不同的 ERF 成员在不同植物中表达部位
不同。在苹果（Malus domestica）中 ERF 亚家族成
员 MdERF1 主要在成熟果实中表达，在其它组织中
A
B
A ：CmERFIII-1 中 AP2/ERF 结 构 域 的 预 测 空 间 结 构 ；B ：AtERF1 中 AP2/
ERF 结构域的空间结构
图 3 CmERFIII-1 中 AP2/ERF 结构域的预测空间结构
2015,31(11) 157郭呈宇等：甜瓜CmERFIII-1 转录因子基因 cDNA的克隆与表达分析
表达量很低［21］。而从李（Prunus salicina）中分离
得到的 PsERF2a 和 PsERF2b 在果实发育过程中则
没有呈现递增或递减的表达规律，而是在花中高水
平 表 达［15］。 猕 猴 桃（Actinidia deliciosa）AdERF4、
AdERF6 随 果 实 的 发 育 成 熟 表 达 量 逐 渐 下 降， 而
AdERF5 在根、茎、叶、花和果实中的表达量均很
低，但在花和成熟果实中的表达量高于其他组织［22］。
甜瓜中 CMeERF1和 CMeERF2 两个基因的表达与内
源乙烯生成量显著相关［17］。本研究通过对河套蜜瓜
CmERFIII-1 基因在根、茎、叶和不同发育时期果实
进行实时荧光定量 PCR 检测，发现该基因在根、茎、
叶及果实的不同发育时期均有不同程度表达，在叶
片中表达量最高，推测该蛋白在叶片中发挥重要作
用。AP2/ERF 类转录因子在植物整个生命周期中参
与多种生理生化和生长发育调控过程，因此对该类
转录因子基因的分离及其表达和功能的研究有重要
意义。
4 结论
从河套蜜瓜果实中克隆得到 CmERFIII-1 基因
711 bp cDNA，编码一个由 236 个氨基酸组成的蛋白
质，该 cDNA 序列与甜瓜基因组数据库中 ERF 基因
（登录号 MELO3C005465）的核苷酸序列一致性达
100%。由该 cDNA 所编码的蛋白质氨基酸序列与黄
瓜 ERF 亚家族 2 个成员的氨基酸序列（GenBank 登
录号 ：XP_004143677.1 和 XP_004158119.1）一致性
较高。实时荧光定量 PCR 检测显示，该基因在河套
蜜瓜叶片中表达量最高。
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XP 008436974.1 ⭌⬌ˈCucumis melo
XP 004158119.1 哴⬌ˈCucumis sativus
XP 004143677.1哴⬌ˈCucumis sativus
XP 002282181.1㪑㨴ˈVitis vinifera
ADJ67440.1⥅⥤ṳˈActinidia deliciosa
XP 008376370.1 㤩᷌ˈMalus domestica
XP 003535939.1བྷ䉶ˈGlycine max
XP 006421525.1ḁ₈ˈCitrus clementina
CDX71695.1⋩㨌ˈBrassica napus
NP 568755.1ᤏই㣕ˈArabidopsis thaliana
XP 004245805.1⁡ṳ㭳㤴ˈSolanum lycopersicum
CDP10017.1⭈㯟ˈCoffea canephora100
94
100
100
83
65
60
57
42
0.05
图 4 CmERFIII-1 系统进化聚类
1.2
1.0
0.8
0.6⴨ሩ㺘䗮䟿
0.4
0.2
0
Root Stem Leaf 0 d 10 d 20 d 30 d 40 d
图 5 CmERFIII-1 基因表达分析
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（责任编辑 马鑫）