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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2012年第8期
锁阳是重要的中药和蒙药植物，有清除氧自由
基、抗氧化、抗疲劳以及润肠通便等功效［1］。目前，
利用分子标记手段研究遗传多样性已建立了比较成
熟的研究体系［2-4］。随机扩增多态性 DNA（Random
amplified polymorphic DNA，RAPD）分析是研究较
大范围内的遗传多样性，特别是研究植物物种在亚
种和品种一级的最简单的分子标记方法［5］。随后新
技术的发展扩大了分子标记在遗传图谱、标记辅助
育种、调查遗传亲缘关系等方面的应用。扩增片段
长度多态性（Amplified fragment length polymorphism，
AFLP）相对于 RAPD 分辨力高，稳定性好［6］。ISSR
分子标记技术是 1994 年 Zietkiewicz 等［7］提出的一
种利用 PCR 扩增进行检测的 DNA 标记，所用的引
物是基于简单重复序列而设计的寡核苷酸引物，用
来检测两个 SSR 之间的一段短 DNA 序列的差异。该
技术由于具有多态性水平高、可重复性好、DNA 用
量少、成本低廉等优点，近年来广泛应用于优化试
验，品种鉴定、种质资源和遗传多样性分析、遗传
作图等研究［8-11］。由于 ISSR 技术也是基于 PCR 的
一种标记，其反应结果易受反应体系内各组分浓度
的影响，所以有必要针对不同物种进行 ISSR-PCR 反
应体系的优化。在 ISSR-PCR 体系中加入不同的添
加剂可以增强 PCR 反应的扩增效率、增强背景清晰
度，ISSR-PCR 中可使用的添加剂为去离子甲酰胺［10］、
牛血清白蛋白（BSA）［12］、Betaine［13］和甘油［14］等。
目前，有关 ISSR-PCR 体系优化在许多物种中均有报
收稿日期 : 2011-11-29
基金项目 : 国家科技支撑计划项目（2011BAI07B07）, 内蒙古科技创新引导奖励资金项目（2010）
作者简介 : 李伟 , 男 , 硕士研究生 , 研究方向 : 药用植物生物技术 ; E-mail: lw798449583@sina.com
通讯作者 : 陈贵林 , 男 , 博士 , 教授 , 博士生导师 , 研究方向 : 药用植物化学及生物技术 ; E-mail: guilinchen@yahoo.com.cn
锁阳 ISSR-PCR反应体系的优化研究
李伟1 刘广达1 陈青1 呼思勒2 陈贵林1
（1 内蒙古大学生命科学学院，呼和浩特 010021 ；2 暨南大学生命科学技术学院，广州 510632）
摘 要： 通过单因素试验、正交试验的方法，对影响锁阳 ISSR-PCR反应体系的 7种主要因素在 3个水平上进行优化筛选，
得到锁阳 ISSR-PCR反应的最佳体系：25 μL反应体系中含有 0.2 mmol/L dNTP、1.5 mmol/L Mg2+、10 μmol/L引物、50 ng模板 DNA、
2.0 U Taq酶、1%去离子甲酰胺和 2.5 μg/μL牛血清白蛋白。相应引物的最佳退火温度为 48.9℃。这一体系的建立为今后利用 ISSR-
PCR标记技术研究锁阳的遗传多样性奠定了基础。同时对 ISSR-PCR体系中添加剂的作用进行了探讨，为添加剂在其他植物 ISSR-
PCR反应中的应用提供借鉴。
关键词： 锁阳 正交设计 ISSR 优化
Optimization of ISSR-PCR System of Cynomorium songaricum Rupr.
Li Wei1 Liu Guangda1 Chen Qing1 Hu Sile2 Chen Guilin1
（1College of Life Science，Inner Mongolia University，Hohhot 010021；2College of Life Science and Technology，Jinan Univerisity，
Guangzhou 510632）
Abstract: Seven impact factors affecting ISSR-PCR reaction system were optimized in ISSR-PCR system of C. songaricum to lay
a foundation for studying genetic diversity of C. songaricum germplasm resources. The results showed that the best ISSR-PCR system of
C. songaricum is 25 μL reaction system including 0.2 mmol/L dNTP, 1.5 mmol/L Mg2+, 10 μmol/L primer, 50 ng DNA template, 2.0 U Taq
enzyme, 1.0% formamide deionized and 2.5 μg/μL albumin bovine the best annealing temperature is 48.9℃. This research also discussed
function of some additive chemicals in ISSR-PCR systerm.
Key words: Cynomorium songaricum Rupr. Orthogonal ISSR Optimization
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第8期136
道［15， 16］，但不同植物 ISSR-PCR 最佳反应体系差别
较大，迄今尚未见锁阳 ISSR 分子标记技术报道。本
研究通过分析不同添加剂对 ISSR-PCR 的影响，旨
在对其他植物高效 ISSR-PCR 体系的建立提供借鉴。
1 材料与方法
1.1 材料
用于反应体系优化的锁阳采自内蒙古自治区鄂
尔多斯市杭锦旗，从新鲜的肉质茎中提取 DNA 作
为 PCR 反应的模板。用于反应体系稳定性检测的锁
阳分别采集自内蒙古自治区额托克后旗、额济纳旗、
阿拉善左旗、杭锦后旗、宁夏银川、甘肃山丹、新
疆乌鲁木齐和甘肃安西县，并从采集自上述产地的
锁阳的干燥肉质茎中提取 DNA。
PCR 反应的 Taq酶，标准分子量（Marker）DL-
2000 均购自大连宝生物公司。前期筛选出的引物
816［（GA）8T］ 作为此次正交试验的固定引物，由
大连宝生物公司合成。DNA 提取试剂盒为百泰克新
型快速提取植物基因组试剂盒。
UV-2450 紫外可见分光光度计（日本岛津有限
公司），PCR 仪（Bio-Rad C1000 Thermal Cycler PCR
仪），电泳仪（DYY-12 型电泳仪），离心机（The-
rmo FRESO 21）， 电 泳 成 像 仪（Bio-Rad Universal
HoodⅡ 凝胶成像系统）。
1.2 方法
1.2.1 总 DNA 的提取与浓度测定 使用百泰克新型
快速提取植物基因组试剂盒提取锁阳基因组 DNA，
经 1.5% 的琼脂糖电泳检测 DNA 质量，用紫外分光
光度计测定 DNA 的含量，稀释至 25 ng/μL，-20℃保
存备用。
1.2.2 单因素设计 使用哥伦比亚大学公布的引物
816［（GA）8T］（已经过前期筛选），以大连宝生物
公司生产的 rTaq（DM001AM）说明书中的体系为基
础体系。预设的基本浓度为 dNTP 0.2 mmol/L、Mg2+
2 mmol/L、引物 0.4 μmol/L、模板 DNA 50 ng、 Taq酶
1 U。对各因素设定以下梯度，dNTP 浓度（0.05、 0.1、
0.15、0.2、0.25、0.3、 0.35 mmol/L）；Mg2+ 浓度（0.5、
1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 mmol/L）； 引物浓度（0.1、
0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 μmol/L）；DNA 浓度（12.5、
25、37.5、50、62.5、75、87.5 ng）；Taq酶添加量（0.5、
1、1.5、2、2.5、3、3.5 U）；去离子甲酰胺比例（0%、
0.5%、1.0%、2.0%、3.0%、4.0%）；牛血清白蛋白（BSA）
浓度（ 0 、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 μg/μL）；Betaine
浓度（0、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8 mol/L）；甘油比例（0%、
0.5%、1.0%、2.0%、3.0%、4.0%）。
1.2.3 正交试验设计及分析 为确定 PCR 反应中 7
个因素（dNTP、Mg2+、模板 DNA、引物和 Taq酶、
去离子甲酰胺、牛血清白蛋白）的最佳水平，采用
正交试验设计 L18（37），每因素水平由单因素试验
确定。试验方案，见表 1。依据扩增出的谱带特异
性及谱带多少、亮度和清晰度对 PCR 扩增结果从高
到低依次打分。最好的处理定为 9 分，最差的处理
定为 1 分，以这两个处理的结果为比较标准，再将
其他处理的谱带结果与这两个标准比较依次评分，
对得到的数据进行正交直观分析。
1.2.4 退火温度筛选 在正交试验的最佳反应体系
的基础上，对退火温度进行梯度试验，筛选出合适
的退火温度。在 TC-XP 基因扩增仪上设置温度最
小为 45℃，最大为 55℃，自动形成 8 个梯度，分
别为 45℃、45.6℃、47℃、48.9℃、51.3℃、53.3℃、
54.4℃、55℃，其他反应程序均与 PCR 正交试验设
计的相同。
1.2.5 反应体系稳定性测定 选择内蒙古自治区鄂
托克后旗、额济纳旗、阿拉善左旗、杭锦后旗、宁
夏银川、甘肃山丹、新疆乌鲁木齐和甘肃安西县的
样品，对已确定的锁阳 ISSR-PCR 优化体系及反应
参数的稳定性进行检测。
2 结果
2.1 单因素试验结果
2.1.1 dNTP 对体系的影响 图 1 可见，当 dNTP 浓
度为 0.05 mmol/L 时虽有扩增产物，但是电泳条带不
清晰 ；浓度为 0.1、0.15、0.2 mmol/L 时，反应稳定，
扩增出的电泳条带多，而且条带清晰；浓度为0.3、0.35
mmol/L时，虽然有条带，但是数目很少。我们选择0.1、
0.15、0.2 mmol/L 3 个浓度作为正交试验中 dNTP 的
3 个水平因子。
2.1.2 Mg2+对体系的影响 图2可见，Mg2+浓度为0.5
mmol/L 时，无条带，没有扩增产物 ；Mg2+ 浓度为 1
mmol/L 时，有少量条带；Mg2+ 浓度从 1.5 mmol/L 到 3.5
2012年第8期 137李伟等 ：锁阳 ISSR-PCR 反应体系的优化研究
mmol/L 时，都有清晰扩增产物清晰条带。所以选取
1.5、2.5、3.5 mmol/L 3 个浓度为正交试验中 Mg2+ 的
3 个水平因子。
2.1.3 引物浓度对体系的影响 图 3 可见，PCR 扩
增产物量在总体上随着引物量增加而增多。当引物
浓度达到0.4 μmol/L时，才有清晰条带。所以选取0.4、
0.55、0.7 μmol/L 3 个浓度为正交试验 3 个水平。
2.1.4 模板 DNA 对体系的影响 图 4 可见，DNA
M. DNA Marker; 1-7. 引物浓度分别为 0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 、0.6、0.7 μmol/L
图 3 引物浓度梯度对锁阳 ISSR-PCR体系的影响
处理 因素dNTP（mmol/L） Mg2+（mmol/L） 引物（μmol/L） DNA（ng） Taq DNA 聚合酶（U） 牛血清白蛋白（μg/μL） 去离子甲酰胺（%）
1 0.10 1.5 0.40 50.0 0.50 1.5 0.50
2 0.10 2.5 0.55 62.5 1.25 2.0 0.75
3 0.10 3.5 0.70 75.0 2.00 2.5 1.00
4 0.15 1.5 0.40 62.5 1.25 2.5 1.00
5 0.15 2.5 0.55 75.0 2.00 1.5 0.50
6 0.15 3.5 0.70 50.0 0.50 2.0 0.75
7 0.20 1.5 0.55 50.0 2.00 2.0 1.00
8 0.20 2.5 0.70 62.5 0.50 2.5 0.50
9 0.20 3.5 0.40 75.0 1.25 1.5 0.75
10 0.10 1.5 0.70 75.0 1.25 2.0 0.50
11 0.10 2.5 0.40 50.0 2.00 2.5 0.75
12 0.10 3.5 0.55 62.5 0.50 1.5 1.00
13 0.15 1.5 0.55 75.0 0.50 2.5 0.75
14 0.15 2.5 0.70 50.0 1.25 1.5 1.00
15 0.15 3.5 0.40 62.5 2.00 2.0 0.50
16 0.20 1.5 0.70 62.5 2.00 1.5 0.75
17 0.20 2.5 0.40 75.0 0.50 2.0 1.00
18 0.20 3.5 0.55 50.0 1.25 2.5 0.50
表 1 锁阳 ISSR-PCR体系正交设计
图 4 DNA浓度梯度对锁阳 ISSR-PCR体系的影响
M. DNA Marker; 1-7. 12.5、25.0、37.5、50.0、62.5、75.0、87.5 ng DNA
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第8期138
模板的量在 12.5-87.5 ng 时，都有条带出现。但是
浓度 12.5、25、37.5 ng 时，条带不清晰，有非特异
性扩增产物产生。所以选取 50、62.5、75 ng 3 个浓
度为正交试验 3 个水平。
2.1.5 Taq DNA 聚合酶对体系的影响 图 5 可见，
Taq DNA 聚合酶 0.5-3.5 U 都有扩增产物，当浓度大
于 2.0 U 后，非特异性扩增造成的条带模糊。所以
选取 0.5、1.5、2.0 U 3 个浓度为正交试验 3 个水平。
2.1.6 去离子甲酰胺对体系的影响 图 6 可见，只
有 0%、0.5%、1.0% 有扩增产物条带 ；0% 为没有加
入去离子甲酰胺，电泳条带不清晰。浓度为 0.5%、
1.0% 时，扩增结果明显，条带清晰。所以选择 0.5%、
图 6 去离子甲酰胺浓度梯度对锁阳 ISSR-PCR体系的影响
M. DNA Marker; 1-6. 0%、0.5%、1.0%、2.0%、3.0% 、4.0% 去离子甲酰胺
图 5 Taq酶浓度梯度对锁阳 ISSR-PCR体系的影响
M. DNA Marker; 1-7. 0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 U Taq酶
0.75%、1.0% 3 个浓度为正交试验的 3 个水平因子。
2.1.7 BSA 对体系的影响 图 7 可见，相比 0 μg/mL
不加 BSA 的条带，加入不同浓度 BSA 确实能够使条
带更加清晰。2 号条带与其他条带相比不清晰，说
明扩增产物体系不稳定。所以，综合考虑，选取 1.5、
2.0、2.5 μg/μL 3 个浓度为正交试验的 3 个水平。
2.2 正交试验结果及数据处理
试验 PCR 产物电泳结果（图 8）按照遗传多样
图 7 BSA浓度梯度对锁阳 ISSR-PCR体系的影响
M. DNA Marker; 1-6. 0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 μg/μL BSA M. DNA Marker; 1-18. 正交试验结果（具体组合见表 1）
图 8 正交试验不同组合 PCR扩增产物凝胶电泳图谱
性分析，依据扩增出的谱带特异性及谱带多少、亮
度和清晰度对 PCR 扩增结果依次打分。依处理得
1-18 条带记分结果为：6、4、5.5、5、5、6.5、6、7、
6、6、6、7、8、6、6、6、9、8。
如图8所示，条带17的效果最为理想， 综合表1，
得到 dNTP、Mg2+、引物、模板 DNA、Taq酶、BSA、
去离子甲酰胺的最佳理想组合浓度依次为 0.2 mmol/L、
3.5 mmol/L、1 μmol/L、87.5 ng、0.1 U、2.5 μg/μL、1.0%。
2.3 退火温度的确定
退火温度低于 47℃时，ISSR-PCR 扩增条带多
但模糊，背景不清晰。退火温度较高时，扩增出的
条带很少而且很弱，甚至在 55℃时，已经不能扩增
出产物。当退火温度为 48.9℃时，反应稳定，扩增
产物多，条带清晰 （图 9）。所以确定 48.9℃为本引
物的最佳退火温度。
2.4 ISSR-PCR反应体系优化验证
根据以上试验结果确定的ISSR-PCR最佳反应体
系配比和扩增程序，对 9 份锁阳种质材料进行 DNA
2012年第8期 139李伟等 ：锁阳 ISSR-PCR 反应体系的优化研究
扩增，以检测现已确定的 ISSR-PCR 反应体系的实
用性和稳定性。图 10 可见，9 份锁阳种质资源均扩
增出清晰、重复性好、多态性高的 DNA 条带，说明
经试验优化的锁阳 ISSR-PCR 反应体系稳定可靠，可
图 9 退火温度梯度对锁阳 ISSR-PCR体系的影响
M. DNA Marker; 1-8. 55℃、54.4℃、53.3℃、
51.3℃、48.9℃、47℃、45.6℃、45℃
M. DNA Marker; 1. 内蒙古自治区额托克后旗 ; 2. 额济纳旗 ; 3. 阿拉善左旗 ; 4.
杭锦后旗 ; 5. 宁夏银川 ; 6. 甘肃山丹 ; 7. 新疆 ; 8. 乌鲁木齐 ; 9. 甘肃安西县
图 10 用优化的 ISSR-PCR体系对 9个产地的锁阳进行 PCR扩增
用于锁阳遗传多样性分析、种质资源鉴定等研究。
3 讨论
在影响 ISSR-PCR 扩增结果的各重要因素中，
酶是最关键的影响因素，直接影响扩增的结果。在
研究遗传多样性时如果使用高浓度的 Taq酶不仅增
加试验成本，而且会产生非特异性扩增产物，但浓
度过低则会导致扩增产物的合成效率下降，因此应
选择合适的酶用量。同时 Taq DNA 聚合酶对 Mg2+ 有
很强的依赖性，作为 Taq酶的辅助因子，Mg2+ 不仅
影响 Taq酶活性及合成的稳定性，还能与反应液中
的 dNTP、模板 DNA 及引物结合，影响引物与模板
的结合效率、模板与 PCR 产物的解链温度以及产物
的特异性和引物二聚体的形成［14］，它是 PCR 成功
与否的关键因素，选择最合适 Taq DNA 聚合酶活性
的Mg2+ 浓度至关重要。 dNTP作为PCR反应的原料，
量太少会使扩增反应进行不完全，而用量过多的磷
酸基团能定量地与 Mg2+ 结合，使实际反应中 Mg2+ 的
浓度下降而影响聚合酶的活力。引物浓度偏高会引
起错配和非特异性产物扩增，增加引物二聚体的形
成几率，浓度过低则会导致无法扩增。ISSR-PCR 反
应体系的各个组分相互影响，所以有必要在单因素
试验确定各组分浓度范围的基础上进行正交试验来
筛选最佳的组合。
在 ISSR-PCR 体系中加入不同的添加剂可以增
强 PCR 反应的扩增效率、增强背景清晰度。在反应
体系中加入了去离子甲酰胺能使 DNA 内的靶序列在
DNA 复制过程中存在滑动和不均等交换现象减弱，
使条带更加清晰［17］。而 BSA 对于酶活性有一定的
促进作用，可以提高聚合酶对热变性的抗性，对主
要条带的位置及数量影响较小，使条带更加清晰［12］。
Betaine 具有渗透保护作用，与 BSA 相似，可以提高
聚合酶对热变性的抗性［13］；甘油可以稳定 Taq DNA
聚合酶，提高反应的特异性，添加 2% 的甘油可以
降低 ISSR-PCR 扩增的背景［14］。但在本试验的前
期试验中（未列出），Betaine 和甘油都未得到理想
的扩增效果，所以，针对不同植物需要选择不同的
ISSR-PCR 体系的添加剂。本研究已初步建立了一
套稳定、可靠的锁阳 ISSR-PCR 反应体系，从而为
ISSR 分子标记在锁阳遗传多样性上的研究提供了技
术支持。也为添加剂在其他植物 ISSR-PCR 体系中
的应用提供了借鉴。
4 结论
试验证实在 ISSR-PCR 反应体系中添加去离子
甲酰胺和牛血清白蛋白，可以增强 PCR 反应的扩
增效率和背景清晰度。通过单因素试验、正交试验
的方法，建立了锁阳 ISSR-PCR 反应的最佳体系为
25 μL 反应体系中含有 0.2 mmol/L dNTP、1.5 mmol/L
Mg2+、10 μmol/L 引物、50 ng 模板 DNA、2 U Taq酶、1%
去离子甲酰胺和 2.5 μg/μL 牛血清白蛋白，相应引物
的最佳退火温度为 48.9℃。
参 考 文 献
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（责任编辑 李楠）