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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2013年第10期
苦瓜（Momordica charantia L.）为葫芦科苦瓜属
一年生雌雄同株异花草本植物，果实产量和采收时
间与植株性别分化密切相关。苦瓜性别分化易受环
境和激素调控，其中乙烯对苦瓜性别分化起重要调
控作用［1］。乙烯在苦瓜性别分化中的作用比黄瓜还
要复杂。例如，乙烯可明显促进黄瓜雌花形成［2-5］，
但在苦瓜上却表现为低浓度具有中等强度促雌效果，
收稿日期 ：2013-04-01
基金项目 ： 广西自然科学基金重点项目（2010GXNSFD013031），广西青年科学基金项目（桂科自 0991077），第 46 批教育部留学回国人员
科研启动基金，“广西特聘专家”专项经费
作者简介 ：王日升，男，硕士，副研究员，研究方向 ：蔬菜分子生物学 ；E-mail ：shengriwang@126.com
通讯作者 ：李杨瑞，男，教授，研究方向 ：植物分子生物学 ；E-mail ：liyr@gxaas.net
全雌系苦瓜 ACC 氧化酶基因 cDNA 克隆及序列分析
王日升1，2  张曼1  黄如葵1  刘文君1  董文斌1  车江旅2  方锋学1  李杨瑞2
（1. 广西农业科学院蔬菜研究所，南宁 530007 ；2. 广西作物遗传改良生物技术重点开放实验室，南宁 530007）
摘 要： 为研究 1-氨基环丙烷 -1-羧酸氧化酶（ACC 氧化酶，ACO）基因在苦瓜性别分化中的作用，以全雌系苦瓜 ‘X-Hei-d-d’
花蕾为试材，采用 RT-PCR 和 RACE 技术获得了 ACC 氧化酶基因（Mc-ACO1）的全长 cDNA 序列。该序列为 1 137 bp（GenBank 登录
号 ：FJ459813），其完整开放阅读框长 1 005 bp，编码 334 个氨基酸，预测分子量为 37.30 kD，肽链 N 端缺失 ACOs 家族典型的 1
个保守区和 2 个保守二价铁离子 / 抗坏血酸依赖型双加氧酶氨基酸残基。序列分析表明，植物 ACO 基因的演化与其来源植物亲缘
关系的一致性较高 ；与其他物种相比，苦瓜 Mc-ACO1 不同的氨基酸序列主要表现在肽链 N 端 ；苦瓜 Mc-ACO1 应属于黄瓜 Cs-ACO2
类成员，功能可能与性别分化相关。
关键词 ： 全雌系苦瓜 性别分化 ACC 氧化酶 基因克隆 序列分析
Cloning and Sequence Analysis of 1-aminocyclopropane-1-carboxylate
（ACC）Oxidase Gene cDNA from Gynoecious Momordica charantia
Wang Risheng1，2 Zhang Man1 Huang Rukui1 Liu Wenjun1 Dong Wenbin1
Che Jianglü2 Fang Fengxue1 Li Yangrui2
（1. Vegetable Research Institute，Guangxi Academy of Agricultural Sciences，Nanning 530007 ；2. Guangxi Crop Genetic Improvement and
Biotechnology Lab，Nanning 530007）
Abstract:  The full cDNA sequence of 1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid oxidase（ACO）gene was cloned by RT-PCR and RACE
from floral buds of gynoecious bitter melon ‘X-Hei-d-d’, which was named as Mc-ACO1（GenBank accession No. FJ459813）. The full length
cDNA of Mc-ACO1 is 1 137 bp, which includes 1 005 bp complete CDS and encodes 334 amino acid residues with a putative molecular mass of
37.30 kD. The protein encoded by Mc-ACO1 gene lacks one typically conserved domain and two amino acid residues of Fe2+ ascorbate family of
dioxygenases. The bioinformatics characterization indicate that the evolution of plant ACO has higher consistence with their genetic relationship；
and the different amino acid sequences of Mc-ACO1 are mainly at the N-terminal area compared with those of other plants ；Mc-ACO1 should
belong to the same member as cucumber Cs-ACO2, and the presumed function of Mc-ACO1 is probably related with sex differentiation.
Key words:  Gynoecious bitter melon Sex differentiation ACC oxidase Gene clone Sequence analysis
高浓度则促雌效果不明显甚至使雌花数减少［6，7］；
乙烯作用抑制剂 AgNO3 多数情况下可使雌性系黄瓜
性别分化为雄花和雌花同株［8，9］，在全雌系苦瓜植
株上却全部变为两性花［10，11］或两性花、雄花和雌
花同株［12］。这些研究成果的积累为从分子水平了解
乙烯在苦瓜性别分化中的作用提供了科学途径。
1-氨 基 环 丙 烷 -1-羧 酸 氧 化 酶（ACC oxidase，
2013年第10期 77王日升等 ：全雌系苦瓜 ACC 氧化酶基因 cDNA 克隆及序列分析
ACO）可直接催化 ACC 转变为乙烯，是植物内源乙
烯生物合成的最后一步［13，14］。研究表明，黄瓜植
株性别决定和雌性强弱与幼叶和茎尖中 ACO 转录水
平相关［15-18］。迄今为止，苦瓜 ACO 基因与苦瓜性
别分化关系的研究尚未报道。本研究利用 RT-PCR
（Reverse transcription PCR）和 RACE（Rapid-amplifi-
cation of cDNA ends）技术从全雌系苦瓜花蕾扩增
ACO 基因全长 cDNA，并分析序列特点，旨在为研
究 ACO 在苦瓜性别分化中的作用奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
试材为广西农业科学院蔬菜研究所选育的全雌
系苦瓜材料‘X-Hei-d-d’，特点是硝酸银诱雄后只产
生两性花［10，11］。
1.2 方法
1.2.1 总 RNA 的 提 取 参 照 植 物 总 RNA 提 取 试
剂盒（天根生化科技有限公司）提取花蕾总 RNA，
DEPC 水 溶 解 RNA， 用 分 光 光 度 计 测 定 OD260 和
OD280 数值，根据 OD260/OD280 值判断 RNA 的质量，
用琼脂糖凝胶电泳检测 RNA 的完整性。
1.2.2 cDNA 的合成 按 MMLV Reverase Transcript-
ase（TaKaRa）说明书合成 cDNA。
1.2.3 引物设计及 PCR 扩增 根据 GenBank 公布的
植物 ACO 基因 cDNA 序列设计一对克隆苦瓜 ACO
基因 CDS 区中间片段的简并引物 F1（5-GA（T/C）
TGGGAAAGCAC（T/C）TTCTTC（T/C）T-3）和 R1
（5-GCG TC（A/G）CT（T/C）CCCGGATTGTA-3），
PCR 总体积为 20 μL，含 2.0 μL 10×PCR Buffer，2.5
μL dNTPs（2.0 mmol/L），引物 F1 和 R1 各 1.0 μL（10
μmol/L），1.0 μL cDNA，0.3 μL rTaq（TaKaRa）， 加
ddH2O 至总量 20 μL。PCR 反应条件为 ：94℃ 5 min ；
94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s， 共 30 个 循 环 ；
72℃ 7 min。回收目标片段，连接 pMD18-T 克隆载
体并转化感受态细胞 DH5α（TaKaRa），蓝白斑筛选
及质粒酶切鉴定后，送上海生工测序。
在苦瓜 ACO 中间片段序列上设计上游引物 F2
（5-GAAGTACAAGAGCGTGGAGCACAGAGTG-3），
从其他物种 ACO 保守区序列设计下游引物 R2（5-
GCTTTCATGGCTTCAAATCTTGGC-3）；除引物为 F2
和 R2 外， 第 2 片 段 PCR 扩 增 体 系 和 程 序 同 中 间
片段。从其他物种 ACO 序列设计上游引物 F3（5-
GAAGAAGAAGGTGCTTTCCCA-3），在苦瓜 ACO 中
间片段序列设计下游引物 R3（5-TTGGGGTTTCTTT-
GAGTTGGTG-3）；除 引 物 为 F3 和 R3 及 退 火 温 度
54℃外，第 3 片段 PCR 扩增体系和程序同中间片段。
将苦瓜 ACO 基因 CDS 区中间片段、第 2 和第 3
片段序列拼接，获得完整 CDS 序列。按照 Invitrogen
公司 GeneRacerTM Kit（For full-length，RNA ligase-me-
diated rapid amplification of 5 and 3cDNA ends）手册
的引物设计要求在完整 CDS 序列上设计 RACE 引物：
5 端第 1 轮引物 C1（5-ATCCGGCTTCGGGCACGG-
CGGGTA-3），5 端第 2 轮引物 D1（5-CGCAATCC-
CGTGGTTCACCAACT-3），3 端第 1 轮引物 E1（5-
CCCCCGCTCCGCCACTCCATCGTCG-3），3 端 第 2
轮 引 物 G1（5-GATAGCACAGGCAGATGGGGAAGG
-3）。3RACE 第 1 轮 和 第 2 轮 PCR 的 引 物 分 别
为 Gene Racer 3 initial Primer、E1 和 Gene Racer 3
nested Primer、G1，退火温度分别为 68℃和 65℃，
扩增体系和程序参照 Gene RacerTM Kit 手册 ；第 3 轮
扩增以第 2 轮扩增产物为模板，引物和退火温度
等同第 2 轮扩增。5RACE 第 1 轮和第 2 轮 PCR 的
引物分别为 Gene Racer 5 initial Primer、C1 和 Gene
Racer 5nested Prime、D1，退火温度分别为 68℃和
65℃，扩增体系和程序参照 Gene RacerTM Kit 手册 ；
第 3 轮扩增以第 2 轮扩增产物为模板，引物和退火
温度等同第 2 轮扩增。
2 结果
2.1 苦瓜ACO基因的克隆
根据已公布的植物 ACO 基因序列，设计兼并
引物和特异引物，利用 RT-PCR 技术扩增出 521 bp、
240 bp 和 181 bp 的中间片段、第 2 片段和第 3 片段
（图 1），基于 3 个 cDNA 片段的重叠区序列拼接后
得到了该基因完整 CDS 序列 ；采用 RACE 技术扩增
得到了包含 19 bp polyA 在内的长 365 bp 3 端和长
239 bp 5 端（图 2）。序列拼接后得到 1 137 bp 的苦
瓜 ACO 基因 cDNA 全长，将其命名为 Mc-ACO1（Gen-
Bank 登录号 ：FJ459813），该基因 3 utr 和 5 utr 长
度 分 别 为 87 bp 和 45 bp，CDS 长 1 005 bp， 包 含
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第10期78
1 个编码 334 个氨基酸的开放阅读框。 酸残基，缺失 1 个保守区和 2 个保守的二价铁离子 / 抗
坏血酸依赖型双加氧酶家族成员中氨基酸残基。
1 ：中间片段扩增产物 ；2，3 ：第 2 片段和第 3 片段扩增产物 ；
M ：DL2000 DNA Marker
图 1 RT-PCR 扩增产物检测
1，2 ：3RACE 产物 ；3，4 ：5RACE 产物 ；M ：DL2000 DNA Marker
图 2 RACE 技术 PCR 产物检测
240
bp
521
bp
M 1 M 2 3
239
bp
365
bp
M 1 2 M 3 4
2.2 序列分析
2.2.1 同源性比较 将其核酸序列提交 NCBI 在线
比 对（http ：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）， 结 果
表明，Mc-ACO1 与 NCBI 公布的 46 个其他物种 ACO
基因核酸序列同源性达 73%-80%，其中与黄瓜 Cs-
ACO1（ 登 录 号 ：AB006806）、Cs-ACO2（ 登 录 号 ：
AB006807）和 Cs-ACO3（登录号 ：AF033583）同源
性达 77% 以上 ；Mc-ACO1 与 NCBI 公布的 100 个其
他物种 ACO 基因氨基酸序列同源性达 77%-85%。
2.2.2 聚类分析 将同源性较高的其他物种 ACO 序
列，用 DNAMAN 软件进行聚类分析，结果（图 3）
表明，4 个葫芦科来源的 ACO 聚为一大类，其他物
种 ACO 未表现出植物分类学上的亲缘关系，表明植
物 ACO 基因的演化与其来源植物的亲缘关系一致性
较高。
2.2.3 蛋白质序列比对 推定的 Mc-ACO1 蛋白预测
氨基酸序列的等电点为 6.02，分子量为 37.298 kD。
利用 BioEdit 软件对 12 个 ACO 氨基酸序列进行比较，
结果（图 4）表明，苦瓜 Mc-ACO1 具有植物 ACO
基因普遍具有的 6 个保守区和 7 个二价铁离子 / 抗
坏血酸依赖型双加氧酶家族成员中保守存在的氨基
0.05
X66719 Arabisopsis thaliana-ACO 拟南芥
AF321533 Citrus sinensis-ACO5 脐橙
DQ337251 Paeonia suffruticosa-ACO1牡丹
DQ116442 Gossypium hirsutum-ACO 棉花
X87097 Pyrus communis-ACO 梨
AB013101 Solanum lycopersicum-ACO 番茄
AB006806 Cucummis sativus-ACO1黄瓜
AF033583 Cucummis sativuss-ACO3 黄瓜
AB006807 Cucummis sativus-ACO2 黄瓜
FJ459813 Momordica chrantia-ACO1 苦瓜
AB042107 Prunus persica-ACO 桃
EU216549 Ziziphus jujuba-ACO 枣
图 3 苦瓜与其他物种 ACO 氨基酸序列构建的系统树
3 讨论
5 和 3RACE 是 克 隆 基 因 cDNA 全 长 的 关 键。
除了提高退火温度外，本研究发现换用 Buffer 也是
提高成功率的有效措施。例如，本研究以开始以
Buffer Ⅰ为缓冲液，3 RACE 扩增出条带模糊且难回
收的 3 条带，换用 Buffer Ⅱ则扩增出一条清晰的目
标条带 ；同样，虽然以 Buffer Ⅰ和 Buffer Ⅱ为缓冲
液的 5 RACE 均扩增出 3 条带，但以 Buffer Ⅱ为缓
冲液的 5 RACE 扩增出目的条带更清晰。
Mc-ACO1 与 其 他 物 种 ACO 基 因 氨 基 酸 序 列
同源性达 77%-85%，与基因的核苷酸序列同源性
达 73%-80% 结果相近，也与不同物种 ACO 基因在
蛋白质水平上的同源性一般在 80% 左右的观点一
致［16］，说明植物 ACO 氨基酸序列在系统进化上具
有高度保守性。苦瓜 Mc-ACO1 预测编码 334 个氨
基酸，而一般植物 ACO 基因通常可编码 306-326
个氨基酸［19］，Mc-ACO1 氨基酸序列比西兰花和牡
丹［19， 20］等物种的少 1 个保守区和 2 个保守氨基酸
残基，说明 Mc-ACO1 氨基酸排列或三维空间结构均
与其他物种的相似性较低。多序列比较结果显示，
Mc-ACO1 缺失的保守区和保守氨基酸残基及与其
他物种相比多的 8-28 个氨基酸都出现在肽链 N 端，
这一特点体现了苦瓜 ACO 基因的特殊性，但是否与
本试材经硝酸银诱雄后只产生两性花有关尚待深入
研究。
本研究表明，苦瓜 Mc-ACO1 与黄瓜 Cs-ACO2、
Cs-ACO3 在系统进化上聚为一大类，在核苷酸和氨
2013年第10期 79王日升等 ：全雌系苦瓜 ACC 氧化酶基因 cDNA 克隆及序列分析
和 分别表示其他物种 ACO 基因的保守氨基酸残基和保守区 ；△和□分别表示 Mc-ACO1 缺失的保守氨基酸残基和保守区
图 4 苦瓜 Mc-ACO 推导氨基酸序列与其他物种氨基酸的多重序列比较
ᤏই㣕X66719哴⬌AB006807㝀₉AF321533ỹ㣡DQ116442ỘX87097ṳAB042107⮚㤴AB013101ᷓEU216549哴⬌AB006806哴⬌AF033583㤖⬌FJ459813⢑ѩ DQ337251
At-ACO
Cs-ACO2
Cs-ACO5
Gh-ACO
Pc-ACO
Pp-ACO
S1-ACO
Zj-ACO
Cs-ACO1
Cs-ACO3
Mc-ACO1
Ps-ACO1
Cons
ᤏই㣕X66719哴⬌AB006807㝀₉AF321533ỹ㣡DQ116442ỘX87097ṳAB042107⮚㤴AB013101ᷓEU216549哴⬌AB006806哴⬌AF033583㤖⬌FJ459813⢑ѩ DQ337251
At-ACO
Cs-ACO2
Cs-ACO5
Gh-ACO
Pc-ACO
Pp-ACO
S1-ACO
Zj-ACO
Cs-ACO1
Cs-ACO3
Mc-ACO1
Ps-ACO1
Cons
ᤏই㣕X66719哴⬌AB006807㝀₉AF321533ỹ㣡DQ116442ỘX87097ṳAB042107⮚㤴AB013101ᷓEU216549哴⬌AB006806哴⬌AF033583㤖⬌FJ459813⢑ѩ DQ337251
At-ACO
Cs-ACO2
Cs-ACO5
Gh-ACO
Pc-ACO
Pp-ACO
S1-ACO
Zj-ACO
Cs-ACO1
Cs-ACO3
Mc-ACO1
Ps-ACO1
Cons
ᤏই㣕X66719哴⬌AB006807㝀₉AF321533ỹ㣡DQ116442ỘX87097ṳAB042107⮚㤴AB013101ᷓEU216549哴⬌AB006806哴⬌AF033583㤖⬌FJ459813⢑ѩ DQ337251
At-ACO
Cs-ACO2
Cs-ACO5
Gh-ACO
Pc-ACO
Pp-ACO
S1-ACO
Zj-ACO
Cs-ACO1
Cs-ACO3
Mc-ACO1
Ps-ACO1
Cons
ᤏই㣕X66719哴⬌AB006807㝀₉AF321533ỹ㣡DQ116442ỘX87097ṳAB042107⮚㤴AB013101ᷓEU216549哴⬌AB006806哴⬌AF033583㤖⬌FJ459813⢑ѩ DQ337251
55
55
56
57
56
56
57
56
56
56
70
56
125
125
126
127
125
126
127
126
126
126
140
123
195
194
195
196
194
195
196
195
195
195
209
192
263
263
264
264
262
263
264
263
265
265
278
260
186
319
314
319
319
313
319
320
319
317
317
334
312
At-ACO
Cs-ACO2
Cs-ACO5
Gh-ACO
Pc-ACO
Pp-ACO
S1-ACO
Zj-ACO
Cs-ACO1
Cs-ACO3
Mc-ACO1
Ps-ACO1
Cons
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第10期80
基酸水平有 77% 以上同源性，据此初步推断它们应
属于同类基因。Kahana 等［16］研究表明，Cs-ACO2
和 Cs-ACO3 主要在黄瓜雌花发育中后期的蜜腺、雌
蕊和子房中表达，并且在叶中表达量与植株雌性强
弱呈正相关，再依据苦瓜 Mc-ACO1 与黄瓜 Cs-ACO2
首先聚为一类和 Cs-ACO2 与黄瓜雌性位点连锁，我
们有理由认为苦瓜 Mc-ACO1 应属于黄瓜 Cs-ACO2
类成员，功能可能与性别分化相关。
4 结论
利用 RACE 技术克隆了全雌系苦瓜 ‘X-Hei-d-d’
的 ACC 氧化酶基因（Mc-ACO1）全长 cDNA 序列。
该序列为 1 137 bp，其完整开放阅读框长 1 005 bp，
编码 334 个氨基酸，预测分子量为 37.30 kD，肽链
N 端缺失 ACOs 家族典型的 1 个保守区和 2 个保守
二价铁离子 / 抗坏血酸依赖型双加氧酶氨基酸残基。
植物 ACO 基因的演化与其来源植物亲缘关系的一致
性较高 ；与其他物种相比，苦瓜 Mc-ACO1 不同的氨
基酸序列主要表现在肽链 N 端 ；苦瓜 Mc-ACO1 应属
于黄瓜 Cs-ACO2 类成员，功能可能与性别分化相关。
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（责任编辑 狄艳红）