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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2015, 31(8):213-218
绿脓杆菌（Pseudomonas aeruginosa），又名铜绿
假单胞菌，自然界分布广泛，常存在于人与动物的
皮肤和肠道上，是一种人兽共患病原菌。当动物体
重大疾病创伤、免疫缺陷，以及身体烧伤后，易诱
发该病的感染［1，2］。目前，由于抗生素的大量使用，
绿脓杆菌耐药性不断提高，对该菌感染的治疗产生
一定的影响［3，4］。研究发现免疫原性较强的绿脓杆
菌 外 膜 蛋 白 有 OprF（Outer membrane lipoprotein）、
OprI 和 OprH［5］。其中，OprF 为细胞外膜孔道蛋白，
具有两种不同大小的孔径结构，在抗生素耐药性和
收稿日期 ：2015-03-20
基金项目 ：陕西省教育厅科学研究计划（2013JK0723），陕西理工学院人才启动项目（SLGQD13-15）
作者简介 ：陈春琳，女，硕士研究生，研究方向 ：分子生物学 ；E-mail ：chen2362505579@163.com
通讯作者 ：刘祥，男，博士，硕士生导师，研究方向 ：蛋白质组学与免疫学 ；E-mail ：liuxiang888525@163.com
重组绿脓杆菌外膜蛋白 OprF 的表达、纯化及多克隆
抗体制备与鉴定
陈春琳  刘祥  俱雄
（陕西理工学院生物科学与工程学院，汉中 723001）
摘 要 ： 绿脓杆菌外膜蛋白 OprF 可有效激活机体的免疫机制对抗细菌的感染，在疫苗上有很好的应用前景。采用分子克隆
方法获得绿脓杆菌外膜蛋白 OprF 表达菌株 ；利用 SDS-PAGE 电泳切胶纯化、尿素梯度复性获得 OprF 蛋白，免疫小鼠制备 OprF 蛋
白多克隆抗体。ELISA 法表明，OprF 抗血清滴度达 1∶12 800 倍，Western blotting 证实抗血清具有很好的特异性。通过 DNAMAN
软件对 OprF 序列同源性分析发现其 C 端在不同细菌间存在较高同源性 ；采用 MEGA 软件对 OprF 的系统发生分析发现假单胞菌属
细菌的亲缘关系高于其它属细菌。
关键词 ： OprF 蛋白 ；多克隆抗体 ；酶联试验 ；Western blotting ；系统发生分析
DOI ：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.08.031
Expression and Purification of Outer Membrane Lipoprotein OprF
in Recombinant Pseudomonas aeruginosa，and Preparation and
Identification of Polyclonal Antibody
Chen Chunlin Liu Xiang Ju Xiong
（College of Biological Sciences and Engineering，Shaanxi University of Technology，Hanzhong 723001）
Abstract ： The outer membrane lipoprotein of Pseudomonas aeruginosa（OprF）could antagonize bacterial infection by efficiently
activating body immunologic mechanism, and therefore has an important perspective in vaccine development. The expression strain for OprF
protein of P. aeruginosa was obtained by molecular clone ；OprF protein was purified by the way of SDS-PAGE gel extraction and urea gradient
renaturation, and the purified protein was used to immunize mice to prepare the polyclonal antibody. The titer of OprF antibody was 1∶12 800
according to ELISA, and Western blotting proved that the antiserum had good specificity. Homology analysis of OprF by DNAMAN showed
that the C-terminal regions shared high homology in different bacteria. Phylogenetic analysis by MEGA revealed that genetic relationship with
Pseudomonas genus bacteria was higher than that with others.
Key words ： OprF protein ；polyclonal antibody ；ELASA ；Western blotting ；phylogenetic analysis
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.8214
维持细胞稳定性上起重要作用［6］；可激活机体特异
性免疫反应，从而抵抗绿脓杆菌的感染［7，8］，在疫
苗上具有很好的应用前景［9］。
本实验利用分子克隆方法获得绿脓杆菌 OprF 原
核表达菌株 ；纯化 OprF 蛋白，制备和鉴定 OprF 蛋
白多克隆抗体 ；并对 OprF 进行系统进化分析，旨在
为 OprF 蛋白功能与疫苗开发研究奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌株与载体 P. aeruginosa PAO1 菌株，E.coli
DH5α 菌株，E. coli BL21 菌株，pET-28a 质粒均由陕
西理工学院生物化学分子实验室保存。
1.1.2 实验动物 昆明鼠购于汉中市动物交易中心。
1.1.3 试 剂 蛋 白 胨、IPTG、 酵 母 粉， 以 及 琼 脂
糖购于西安沃尔森生物技术有限公司 ；Taq 酶、T4
DNA 连接酶、限制性内切酶、Protein Marker，以及
DNA Marker 均为宝生物公司产品 ；基因组提取试剂
盒、质粒提取试剂盒为西安沃尔森生物技术有限公
司 ；胶回收试剂盒为上海生物工程公司 ；引物合成、
基因序列测定均由西安沃尔森生物技术有限公司完
成 ；山羊抗小鼠 IgG 二抗购于 Sigma 公司。
1.2 方法
1.2.1 重组质粒的构建 根据 NCBI 公布的绿脓杆
菌基因序列，设计 oprF 基因引物 ：Primer 1 ：5-AC-
AGGATCCATGAAACTGAAGAACACC-3 ；Primer 2 ：
5-AGTCTCGAGTTACTTGGCTTCAGCTTC-3，下划线
分别为限制性内切酶位点 BamH I 和 Xho I。50 μL 的
PCR 反应体系 ：PCR 反应缓冲液 5 μL，模板 DNA 2
μL，10 mmol/L dNTP 2 μL，25 μmol/L 引 物 各 1 μL，
Taq 酶 0.5 μL， 补 水 至 50 μL。PCR 反 应 条 件 为 ：
94℃预变性 3 min ；94℃变性 30 s，55℃退火 45 s，
72℃延伸 45 s，30 个循环 ；72℃充分延伸 10 min ；
最 后 16℃ 保 温。 采 用 0.8% 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 检 测
PCR 片段大小，胶回收试剂盒回收目的 DNA 片段。
再将 PCR 产物与 pET-28a 质粒载体利用 BamH I 和
Xho I 双酶切后，T4 DNA 连接酶 16℃连接过夜，转
化 E. coli DH5α，提取重组质粒进行 BamH I 和 Xho
I 双酶切鉴定及测序鉴定，检验正确后转化 E. coli
BL21 表达菌株，制备 OprF 原核表达菌株。
1.2.2 重组蛋白的表达检测 将鉴定正确的 OprF 表
达菌株单克隆过夜培养，以 1∶100 倍转接入新鲜
的 LB 培养基中，待 OD600 ≈ 0.6 时，加入终浓度 0.5
mmol/L IPTG 诱导培养 5 h，离心收集 1 mL 菌体，加
入 200 μL 上样缓冲液，沸水中煮样 5 min，上样 10
μL，SDS-PAGE 蛋白电泳检测 OprF 蛋白表达情况。
1.2.3 重组蛋白的纯化 由于 OprF 的表达蛋白主要
以包涵体形式存在，因此采用 SDS-PAGE 蛋白电泳
切胶纯化 OprF 比较合适，主要步骤为 ：大量培养获
得 OprF 表达菌株，加入 50 mmol/L Tris-HCl（pH7.4）
缓冲液超声破碎，沉淀用洗涤液（含 0.05% Triton
X-100 的 Tris-HCl 溶液）洗涤后，将包涵体溶解于 8
mol/L 尿素溶液中 ；进行 SDS-PAGE 蛋白电泳，切下
目的条带，研钵中研磨后加入蛋白浸提液（含 0.1%
SDS 的 Tris-HCl 溶液），4℃浸提过夜，离心收集上
清， 加 入 1∶4（V/V） 的 丙 酮 沉 淀 蛋 白， 离 心 除
去丙酮后加入 50 mmol/L Tris-HCl（pH7.4）的蛋白
溶解液，最后取适量溶液电泳检测蛋白的纯度与
浓度。
1.2.4 重组蛋白的复性 SDS-PAGE 电泳切胶纯化
获得的 OprF 蛋白无生物学活性，可采用尿素浓度梯
度的方法复性蛋白，主要步骤为 ：将纯化的 OprF 蛋
白溶解于 8 mol/L 尿素溶液，置透析袋中，再将其放
入含 6 mol/L 尿素的 50 mmol/L Tris-HCl（pH7.4）中，
4℃放置 4 h ；接着依次为 4、2、1 和 0.5 mol/L 尿素，
最后置于 50 mmol/L Tris-HCl（pH7.4）中，4℃放置
4 h ；然后离心取上清溶液，取 2 μL 溶液进行 SDS-
PAGE 蛋白电泳检测。
1.2.5 重组蛋白小鼠多克隆抗体的制备 选用约 5
周龄的雄性昆明鼠 6 只，每只免疫纯化的 OprF 蛋白
50 μg/ 每次。首次免疫采用弗氏完全佐剂，之后均
采用弗氏不完全佐剂。将佐剂与 OprF 蛋白充分乳化，
直至冰水中不扩散为止。首次免疫 10 d 后进行第 2
次免疫，7 d 后进行第 3 次加强免疫。第 3 次免疫 7
d 后，小鼠眼球取血的方法获得血清，置于 4℃冰箱
中过夜析出，离心取上清，最后将血清保存于 -80℃
冰箱中备用。
1.2.6 ELISA 法检测抗体效价 利用 ELISA 酶联法
检测抗血清效价，主要步骤为 ：将复性的 OprF 蛋
白溶解至 0.05 μg/μL，于对应的 96 孔板中加入 100
2015,31(8) 215陈春琳等：重组绿脓杆菌外膜蛋白 OprF 的表达、纯化及多克隆抗体制备与鉴定
μL，37℃作用 1 h，排空液体，加入 200 μL 封闭液，
37℃孵育 2 h，然后每孔加 100 μL 不同稀释度的小
鼠一抗血清（对照加入 PBS 溶液），并且同一稀释
度血清采用 3 个重复 ；37℃孵育 30 min ；洗涤后加
入 100 μL 二 抗，37℃ 孵 育 30 min ；加 入 50 μL 底
物 A（双氧水）与 50 μL 底物 B（TMB）的混合液，
37℃ 避 光 显 色 10 min， 最 后 加 入 终 止 液，450 nm
读数［10］。
1.2.7 Western blotting 法检测抗体特异性 Western
blotting 显色方法检测小鼠 OprF 抗血清特异性［11］。
为消除 pET-28a 质粒上自带的 His 标签蛋白所产生
抗体的影响，采用绿脓杆菌 OprF 蛋白进行特异性检
测。主要步骤为 ：收集培养的绿脓杆菌，加入上样
缓冲液，沸水中煮样 5 min，上样 10 μL 进行蛋白电
泳，然后转 NC 膜，与不同稀释度的小鼠抗血清（对
照加入阴性抗血清）相作用，洗涤后，加入二抗孵
育，最后 DAB 显色，确定 OprF 抗血清的特异性。
1.2.8 OprF 蛋白序列系统发生分析 根据 NCBI 数
据库公布的细菌 OprF 蛋白氨基酸序列，利用 DNA
MAN 软件进行同源性分析 ；通过 MEGA5.02 软件，
并结合 Neighbour-Joining 方法构建系统发生树［10］。
2 结果
2.1 重组质粒的构建
以绿脓杆菌基因组为模板，进行 PCR 扩增 oprF
基因。获得约 1 053 bp 的基因片段，与目的基因大
小一致（图 1）。将 pET-28a 质粒与 PCR 产物进行双
酶切后，连接酶连接转化 E. coli DH5α 菌株，提取
重组质粒，双酶切检测获得约 1 053 bp 片段（图 2），
与目的基因大小一致。此外，重组基因的测序结果
显示与 NCBI 公布的基因序列一致。
2.2 重组蛋白的表达检测与蛋白纯化
将检测确认的含有 OprF 重组质粒的菌株经过
IPTG 诱导，SDS-PAGE 电泳获得约 38 kD 的蛋白条带，
重组蛋白表达大小情况与预期一致 ；并利用 SDS-
PAGE 蛋白电泳切胶的方法获得 OprF 蛋白，经尿素
梯度复性获得纯化的 OprF 蛋白（图 3）。
2000
bp
M 1 2
1000
750
500
250
100
M ：DNA Marker ；1 ：阴性对照 ；2 ：oprF 基因
图 1 绿脓杆菌 oprF 基因 PCR 扩增
2000
bp
M 1 2
1000
750
500
250
100
M：DNA Marker ；1 ：oprF 重组质粒 ；2 ：oprF 重组质粒 BamH I 和 Xho I 双
酶切
图 2 OprF 重组质粒的双酶切检测
97.2
kD
M 1 2 3 4
66.4
44.3
29.0
20.1
14.3
M ：蛋白 Marker ；1 ：未诱导菌株 ；2 ：IPTG 诱导菌株 ；3 ：SDS-PAGE 切胶
纯化的 OprF 蛋白 ；4 ：复性纯化的 OprF 蛋白
图 3 OprF 蛋白的表达与纯化
2.3 OprF蛋白的小鼠抗血清效价检测
将纯化的 OprF 蛋白免疫小鼠，获得的抗血清
经 ELISA 法检测。结果（图 4）表明，其抗体效价
达到 1∶12 800 倍。
2.4 OprF蛋白小鼠抗血清的特异性检测
利用 Western blotting 显色技术，发现绿脓杆菌
株与不同稀释度的 OprF 抗血清作用后有蛋白条带显
现，而对照组未出现（图 5），表明 OprF 小鼠多克
隆抗体特异性较好。
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.8216
3.0
2.0
2.5
1.5
1.0
0.5
0.0
1:200 1:400 1:800
OprF㹰␵䱤ᙗሩ➗
〰䟺ؽᮠOD
45
0
1:1600 1:3200 1:6400 1:12800 1:25600
图 4 OprF 多克隆抗体效价的检测
A B C D
A ：1∶200 倍稀释的抗血清 ；B ：1∶400 倍稀释的抗血清 ；C ：1∶800 倍稀
释的抗血清 ；D ：阴性对照（1∶200 倍稀释的血清）
图 5 Western blotting 检测 OprF 多克隆抗体特异性
2.5 OprF蛋白的氨基酸序列分析
利用 DNAMAN 软件，对 NCBI 公布的 10 种细
菌的 OprF 蛋白氨基酸序列进行同源性分析，结果
（图 6）发现不同的细菌 OprF 存在较高的同源性，
尤其 C 端不同种细菌同源性更高 ；假单胞菌属细
菌的同源性明显高于其它属细菌（食烷菌）。采用
MEGA 软件构建的 OprF 系统进化树结果（图 7）显
示，假单胞菌属的亲缘关系相对于食烷菌更近。
3 讨论
绿脓杆菌是医院感染最常见的条件致病菌之
一［12，13］，其耐药性的不断增加，给防治带来一定的
困难［14］。OprF 为绿脓杆菌主要外膜蛋白之一，具
有很强的免疫原性［5，15］，动物免疫实验表明其激
活机体产生的特异性免疫能有效抵抗绿脓杆菌的感
染［7，8］；且自身无耐药性等特点［16，17］，在疫苗上具
有研究价值。然而，获得抗体是 OprF 蛋白免疫学功
能研究的基础。有实验成功制备了 OprF 的单克隆抗
体，但制备程序复杂［18］，某些实验也无需使用单抗。
多克隆抗体以其成本低、周期短及效果好等优点得䬌㔯ٷঅ㜎㧼Pseudomonas aeruginosa:㦗ݹٷঅ㜎㧼Pseudomonas fluorescens:㫉∿ٷঅ㜎㧼Pseudomonas monteilii:ᚦ㠝ٷঅ㜎㧼Pseudomonas putida:б俉ٷঅ㜎㧼Pseudomonas syringae:丙ഭٷঅ㜎㧼Pseudomonas koreensis:Վ㧼ٷঅ㜎㧼Pseudomonas agarici:ᯭ∿ٷঅ㜎㧼Pseudomonas stutzeri:に㥹ٷঅ㜎㧼Pseudomonas straminea:伏✧㧼Alcanivorax borkumensis:䬌㔯ٷঅ㜎㧼Pseudomonas aeruginosa:㦗ݹٷঅ㜎㧼Pseudomonas fluorescens:㫉∿ٷঅ㜎㧼Pseudomonas monteilii:ᚦ㠝ٷঅ㜎㧼Pseudomonas putida:б俉ٷঅ㜎㧼Pseudomonas syringae:丙ഭٷঅ㜎㧼Pseudomonas koreensis:Վ㧼ٷঅ㜎㧼Pseudomonas agarici:ᯭ∿ٷঅ㜎㧼Pseudomonas stutzeri:に㥹ٷঅ㜎㧼Pseudomonas straminea:伏✧㧼Alcanivorax borkumensis:䬌㔯ٷঅ㜎㧼Pseudomonas aeruginosa:㦗ݹٷঅ㜎㧼Pseudomonas fluorescens:㫉∿ٷঅ㜎㧼Pseudomonas monteilii:ᚦ㠝ٷঅ㜎㧼Pseudomonas putida:б俉ٷঅ㜎㧼Pseudomonas syringae:丙ഭٷঅ㜎㧼Pseudomonas koreensis:Վ㧼ٷঅ㜎㧼Pseudomonas agarici:ᯭ∿ٷঅ㜎㧼Pseudomonas stutzeri:に㥹ٷঅ㜎㧼Pseudomonas straminea:伏✧㧼Alcanivorax borkumensis:䬌㔯ٷঅ㜎㧼Pseudomonas aeruginosa:㦗ݹٷঅ㜎㧼Pseudomonas fluorescens:㫉∿ٷঅ㜎㧼Pseudomonas monteilii:ᚦ㠝ٷঅ㜎㧼Pseudomonas putida:б俉ٷঅ㜎㧼Pseudomonas syringae:丙ഭٷঅ㜎㧼Pseudomonas koreensis:Վ㧼ٷঅ㜎㧼Pseudomonas agarici:ᯭ∿ٷঅ㜎㧼Pseudomonas stutzeri:に㥹ٷঅ㜎㧼Pseudomonas straminea:伏✧㧼Alcanivorax borkumensis:
:91
:91
:84
:89
:89
:86
:91
:65
:88
:97
:189
:191
:179
:184
:184
:184
:190
:161
:184
:190
:262
:239
:251
:256
:256
:256
:239
:211
:233
:291
:350
:326
:316
:344
:344
:321
:322
:299
:398
:384
图 6 OprF 蛋白氨基酸序列的多重比对
2015,31(8) 217陈春琳等：重组绿脓杆菌外膜蛋白 OprF 的表达、纯化及多克隆抗体制备与鉴定
到广泛运用［19］。目前，使用原核表达蛋白免疫小鼠
制备多克隆抗体仍是最常见的手段之一［20］。本实验
利用分子方法获得 OprF 原核表达载体，纯化 OprF
蛋白，并成功制备与鉴定多克隆抗体 ；但获得的抗
体滴度较低，因而采用多只小鼠免疫的方式，以抵
消滴度低的影响。为进一步研究 OprF 蛋白免疫学功
能奠定基础。
OprF 蛋白具有重要的生物学功能，在遗传进化
上具有相对保守性。本研究通过 OprF 系统进化研究
证实不同菌株的氨基酸序列具有很高的同源性，并
且 C 端同源性更高，这可能与其执行特定的功能有
关 ；研究还证实假单胞菌属细菌的同源性高于其他
属的细菌。这些发现为 OprF 蛋白的交叉免疫保护作
用研究提供依据。因而，可结合后续的免疫攻毒保
护实验，为开发广谱抑菌的 OprF 蛋白疫苗制剂研究
奠定基础。
4 结论
利用分子克隆方法获得绿脓杆菌外膜蛋白 OprF
表达菌株 ；通过 SDS-PAGE 电泳切胶纯化、尿素梯
度复性获得 OprF 蛋白，免疫小鼠制备 OprF 蛋白多
克隆抗体。ELISA 法结果显示，OprF 抗血清滴度
达 1∶12 800 倍，Western blotting 证实抗血清具有很
好的特异性。采用 DNAMAN 软件对 OprF 序列同源
性分析发现其 C 端在不同细菌间存在较高同源性 ；
MEGA 软件对 OprF 的系统发生分析发现假单胞菌属
细菌的亲缘关系高于其它属细菌。
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98
81
99
97100
100 100
100
100
100
100
88
87
99
90
65
0.05
䬌㔯ٷঅ㜎㧼Pseudomonas aeruginosa㦗ݹٷঅ㜎㧼Pseudomonas fluorescens㫉∿ٷঅ㜎㧼Pseudomonas monteiliiᚦ㠝ٷঅ㜎㧼 Pseudomonas putidaб俉ٷঅ㜎㧼Pseudomonas syringae丙ഭٷঅ㜎㧼Pseudomonas koreensis㧃ᇎٷঅ㜎㧼Pseudomonas fragi㔯䪸ٷঅ㜎㧼Pseudomonas chlororaphisӗ哴ٷঅ㜎㧼Pseudomonas synxantha⺍ส䘈৏ٷঅ㜎㧼Pseudomonas nitroreducens
伏⋩ٷঅ㜎㧼Pseudomonas oleovoransᆏ∿ٷঅ㜎㧼Pseudomonas mandelii䱤෾ٷঅ㜎㧼Pseudomonas umsongensis㊣∿ٷঅ㜎㧼Pseudomonas migulae㔯哴ٷঅ㜎㧼Pseudomonas viridiflava
Վ㧼ٷঅ㜎㧼Pseudomonas agariciᯭ∿ٷঅ㜎㧼Pseudomonas stutzeri
に㥹ٷঅ㜎㧼Pseudomonas straminea
伏✧㧼Alcanivorax borkumensis
图 7 MEGA 软件构建的 OprF 氨基酸序列系统进化
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（责任编辑 马鑫）