全 文 ：植物生理学通讯 第 45 卷 第 4 期，2009 年 4 月372
收稿 2009-01-19 修定 　2009-03-02
资助 国家科技部重大基础研究项目(2005CB120902)、国家
自然科学基金(30 2 30 2 2 0)和中国博士后科学基金。
* 通讯作者 ( E-ma i l : h l i a o@ sc a u . ed u . c n; T el : 0 2 0 -
85283380; Fax: 020-85281829)。
细菌双杂交系统(bacterial two-hybrid system,
简称BacterioMatch II)是一种体外检测蛋白质相互
作用的有效方法。该技术自建立以来, 其应用十分
广泛, 尤其在细胞信号传导研究中具有重要的应用
价值(Jobing和 Holmes 2000)。BacterioMatch II 系
统不仅可直接从cDNA文库中筛选与特定诱饵蛋白
质互作的新蛋白质, 而且还可用于鉴定一对已知蛋
白质之间的互作。一旦确定了一对蛋白质之间的
互作, 还可以进行诱饵或目标蛋白质的定点突变, 进
而定位蛋白质的互作区域。因此, 利用 Bacterio-
Match II 系统所建立的大豆根部全长 cDNA 文库,
对于研究大豆根部蛋白质与蛋白质、蛋白质与
RNA、蛋白质与小分子之间的相互作用有着重要
意义。同时, 大豆根部细菌双杂交 cDNA文库的构
建对于大豆根部基因的克隆和功能鉴定也具有十分
重要的意义, 有利于开展对大豆根部基因调控营养
吸收及发生发育等方面的研究。
WNK [with no lysine (K) kinase (无赖氨酸激
酶)]基因家族是最近被发现的一个新的基因家族。
在哺乳动物上已有深入的研究, 其功能主要通过调
控钾、钠、氯离子的转运调节体内的离子平衡,
该家族基因突变主要导致人类常见的一种疾病——
高血压(Wilson 等 2001)。相对于动物, 植物中的
WNK研究较少, 已有的研究主要集中在模式植物拟
南芥上。据报道, 拟南芥基因组有 10个编码WNK
的基因, 而目前仅有部分基因的功能被鉴定(Wang
等 2008)。GmWNK1 是本实验室首次从大豆上克
隆的编码该家族蛋白的基因, 其功能主要参与调控
脱落酸的信号途径(未发表)。但是, 迄今为止, 植
物 WNK 基因的功能和调控机制仍不清楚。
本研究利用细菌双杂交系统构建了一个大豆
根系的cDNA文库, 同时利用大肠杆菌双杂交表达
载体pBT构建融合表达质粒pBT-GmWNK1作为诱
细菌双杂交筛选大豆GmWNK1互作蛋白系统的建立及应用
王应祥, 郑焱, 梁翠月, 王秀荣, 庄楚雄, 严小龙 , 廖红*
华南农业大学根系生物学研究中心, 广州 510642
提要: 本研究利用大肠杆菌双杂交系统构建了一个高质量的大豆根系cDNA文库, 同时利用大肠杆菌双杂交表达载体pBT
构建了融合表达质粒pBT-GmWNK1, 经酶切和测序鉴定、诱饵融合蛋白的表达检测及诱饵融合蛋白的自激活鉴定后作为
诱饵, 从大豆根部 cDNA文库中筛选与 GmWNK1发生互作的蛋白质, 共获得 18个阳性克隆。经测序和同源性比对发现,
有10个阳性克隆编码已知蛋白, 8个为假阳性。研究结果为揭示WNK基因家族的生物学功能和调控机制提供了重要的参
考数据和研究材料。
关键词: 大豆; cDNA文库; 细菌双杂交; GmWNK1
Establishment and Application of Bacterial Two-Hybrid System for Screening
the Targets of GmWNK1 in Soybean
WANG Ying-Xiang, ZHENG Yan, LIANG Cui-Yue, WANG Xiu-Rong, ZHUANG Chu-Xiong, YAN Xiao-Long , LIAO Hong*
Root Biology Center, South China Agricultural University, Guangzhou 510642, China
Abstract: A soybean root cDNA library was constructed using the bacterial two-hybrid system. A bait plasmid
pBT-GmWNK1 was also constructed and sequenced. After expression detection and self-activation identifica-
tion of pBT-GmWNK1 fusion protein in bacterial two-hybrid system, we screened GmWNK1 interacting pro-
teins and isolated 18 positive clones. Among these 18 positive clones, 10 encoded known proteins and 8 were
false positive. These results provided important data for us to further investigate the biological functions and
regulation mechanism of with no lysine kinase (WNK) family.
Key words: soybean; cDNA library; bacterial two-hybridization system; GmWNK1
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饵, 从大豆根部 cDNA 文库筛选与 GmWNK1发生
互作的蛋白质。为进一步揭示WNK家族的生物学
功能和调控机制提供了重要的参考数据和研究材
料。
材料与方法
1 材料
1.1 大豆培养方法 本研究材料为大豆[Glycine max
(L.) Merr.] ‘巴西 10号 ’(赵静等 2004), 种子用 10%
的过氧化氢进行表面消毒 1 min, 然后将种子均匀
卷在1/2Hoagland营养液浸泡过的催芽纸上(Liao等
2006), 卷纸底部以相应的营养液浸泡以保持湿润,
在昼 / 夜温度为 28℃/28 ℃ (12 h/12 h)、光照强度
为 180 μmol.m-2.s-1 和相对湿度为 75% 的条件下培
养 7 d。
1.2 载体和菌株 大肠杆菌表达载体 pBT、大肠杆
菌菌株XL1-Blue MRF和XL1-Blue MRF Kan购自
Stratagene 公司。
2 重组诱饵质粒的构建
本试验以GmWNK1全长和C端包括自抑制区
域分别构建诱饵质粒(图 1), 为文库筛选用。以
GmWNK1基因序列, 设计2对引物扩增GmWNK1和
GmWNK1C, 同时引入上游SmaI和下游XhoI酶切位
点, GmWNK1F: 5 AACCCGGGCCATGTAC-
AAGGGGAGATTTG 3; GmWNK1R: 5 AACTCGA-
GCCTTATGGAGATTGATGGAG 3; GmWNK1CF:
5 AACCCGGGACGGAACAACTAGACTCTCC 3;
反向引物GmWNK1CR与GmWNK1R相同。以大
豆 cDNA 为模板, 用 2 对引物扩增 GmWNK1 和
GmWNK1C。然后纯化连接 T载体, 测序验证后再
用 EcoRI和XhoI双酶切T载体和 pBT质粒酶切后
相互连接。重组质粒命名为 pBT-GmWNK1 和
图 1 GmWNK1 诱饵质粒的不同片段构建
Fig.1 Diagram of different constructions
of bait plasmids GmWNK1
KD: kinase domain, 激酶结构域; AD: autoinhibition domain,
自抑制结构域; GmWNK1C: C 端包括自抑制功能域; GmWNK1:
表示全长。
pBT-GmWNK1C。
3 重组融合蛋白的诱导表达检测
挑取 2种阳性转化子菌落, 接种至含25 mg.L-1
氯霉素的液体 M9+ His-dropout broth, 37 ℃振荡培
养至OD600 达到 0.5~0.6时, 加入 IPTG至终浓度 10
μmol.L-1, 37 ℃诱导表达。分别在诱导 0、1、2、
3 和 4 h 时各收集 1 mL 菌液, 提取蛋白。配制好
梯度胶或 12.5% 的分离胶、5% 的浓缩胶, 取定量
好的蛋白上样, 恒压80 V电泳30 min, 120 V电泳3
h。电泳完毕后切与胶相同大小的 NC 膜, 在转膜
缓冲液中平衡 10 min。低温下 350 mA 电转 1 h。
电转完后, 将膜放入平皿中, 加入50 mL封闭液, 37
℃摇床上封闭 2 h 或过夜, 0.1% 吐温 20 的 TBS 清
洗 3 次, 每次 5 min。然后在 3% BSA、0.1% 吐
温20的TBS按照1:1 000的稀释比例加入第一抗体,
将膜浸入杂交 1 h。37 ℃平皿, 摇床, 0.1% 吐温
20 的 TBS 液, 洗膜 2~3 次, 3% BSA、0.1% 吐温
20的TBS液, 洗膜 1次, 每次15 min。在3% BSA、
0.1%吐温20的TBS液按照1:20 000的稀释比例加
入第二抗体, 将膜浸入其中杂交 1 h。0.1% 吐温
20 的 TBS 液, 洗膜 2~3 次, 3% BSA、0.1% 吐温
20 的 TBS 液, 洗膜 1 次, 每次 15 min。将膜放入
有 20 mL 染色液中显色至清晰条带出现为止。
4 pBT-GmWNK1和pBT-GmWNK1C自身转录激
活活性的鉴定
将构建的pBT-GmWNK1和pBT-GmWNK1C质粒
与空pTRG质粒共转化感受态大肠杆菌BacterioMatch
II reporter菌株, 观察细菌在筛选和非筛选的培养基
上的生长状况, 以确定其是否具有自身转录激活活
性。
5 大豆根部pTRG载体cDNA文库的构建
5.1 RNA的提取和mRNA的分离 参照 Invitrogen
Trizol 试剂产品说明, 提取大豆根部组织的 RNA。
使用 Promega mRNA isolation Kit (Promega)从总
RNA 中分离纯化 Poly(A)+mRNA。
5.2 第一链和第二链cDNA合成及其末端的钝化
参照Stratagene细菌双杂交cDNA文库构建试剂盒
方法。
5.3 cDNA片段分级和加工 充分悬浮 Sepharose
CL-2B 树脂填充胶, 装入 10 mL 注射器中, 让存储
液借重力自然流出; 加入 2.0 mL 1×STE缓冲液, 借
重力自然流出; 加入 10 mL 1×STE 缓冲液充分洗
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柱; 再加入 cDNA 样品, 柱填充染料将随溶液慢慢
渗入树脂中; 当染料距离移液管端大约 0.4 mL 开
始收集样品, 每个片段收集 3 滴; 供收集 12 个样
品。分别取 8 μL 样品用 5% 非变性聚丙烯凝胶电
泳检测。然后向每个样品中加入等量的酚:氯仿:异
戊醇(25:24:1)蜗旋混匀, 再次抽提纯化cDNA, 最后
溶解于 5 μL 的灭菌水中。
5.4 cDNA文库和pTRG质粒载体的预连接和转化
参照Stratagene细菌双杂交cDNA文库构建试剂盒
方法 。
5.5 计算转化子数目确定 cDNA文库的连接效率
cDNA文库和阳性对照按不同的稀释比例分别涂加
四环素的LB平板; 根据克隆的生长情况, 按下列公
式确定转化子并推算文库容量。克隆数 × 总转化
体积(μL)/涂板的体积(μL)=总转化子(cfu); 例如: 以
pUC18 DNA为对照, 250个克隆表示转化感受态细
胞的效率是 1×109 cfu.μg-1 pUC18 DNA。
5.6 文库的插入子的大小和百分比的验证 通过
PCR扩增检测cDNA文库的插入片段大小, 引物序
列如下: pTRG正向引物5 TGGCTGAACAACTGG-
AAGCT 3; pTRG反向引物5 ATTCGTCGCCCGC-
CATAA 3。
5.7 放大文库连接并转化XLl-blue MRF感受态
细胞和收获 连接体系放大 10 倍, 转化步骤如 5.5
节所述, 转化培养后, 如下涂加四环素的LB平板, 1
号板(加 2 μL 转化产物到 98 μL SOC 中)和 2 号板
(加5 μL转化产物到95 μL SOC中), 以上两板用来
推算转化效率并计算文库容量。其余每板涂 250
μL 共 18 板。30 ℃培养 24 h 或以上, 根据克隆的
生长情况, 收获文库。然后分别涂 2 μL 和 5 μL 收
获的文库于2个LB加四环素的板, 用来推算转化效
率并计算文库容量。剩下一半用于保存, 另一半用
于抽提质粒。质粒的抽提采用质粒大量提取试剂
盒(QIAGEN)提取。
6 大豆根系 cDNA文库的筛选
6.1 cDNA文库的预筛 取筛选报告感受态细胞100
μL; 加入1.7 μL β-琉基乙醇混匀, 冰上放置10 min,
然后: 将 10 ng pTRG、100 pg pUC18、50 ng pTRG
(cDNA library)、10 ng pTRG-Gal11p和 pBT LGF2分
别加入筛选报告感受态细胞中; 转化方法同前; 30
℃, 250 r.min-1振荡培养 1.5 h; 将离心管 2 000×g离
心 10 min 沉淀细胞; 小心去除上清, 然后用 1 mL
M9+ His-dropout培养基室温重悬细胞; 按照上述方
法沉淀细胞, 小心去除上清, 然后用 1 mL M9+ His-
dropout 培养基重悬细胞; 37 ℃培养 2 h。然后分
别如下涂板: 各涂 100 μL 正对照 pTRG-Gal11p 和
pBT LGF2 于筛选和非筛选培养基上; 取出 100 μL
的转化液, 然后重复操作稀释到1:10和1:100, 取出
1:100最终稀释的转化细胞涂板至有氯霉素和四环
素, 但不含 3-AT 的筛选培养基平板上, 37 ℃培养
过夜。
6.2 cDNA文库的初筛和阳性相互作用子的强化 取
报告感受态细胞BacterioMatch II screening reporter
500 μL; 加入 8.5 μL β-琉基乙醇混匀, 冰上放置 10
min; 混合200 ng pTRG (cDNA library)和200 ng pBT
诱饵质粒转化方法同前;分别如下涂板; 取出100 μL
的转化液, 然后重复操作稀释到1:10和1:100, 取出
100 μL最终稀释的转化细胞涂板至有氯霉素和四环
素, 但不含 3-AT的筛选培养基平板上,计算转化效
率和推算总的筛选克隆数。剩下的全部涂于有氯
霉素、四环素和 5 mmol.L-1 3-AT的筛选培养基平
板, 37 ℃培养 24 h 以上至阳性克隆出现。24 h 后,
挑取以上筛选培养基上的阳性克隆, 再次点于含有
氯霉素、四环素和 5 mmol.L-1 3-AT的筛选培养基
平板上, 标记每个位置。再把培养皿室温避光放置
15~16 h, 弱的相互作用子慢慢出现, 也挑取相应的
克隆涂于筛选培养基上。37 ℃培养直到克隆出现。
6.3 阳性相互作用子的复筛和验证 挑取上述阳性
克隆分别于含有氯霉素、四环素、链霉素和 5
mmol.L-1 3-AT的双筛选培养基平板和LB含氯霉素
和四环素培养基上。同时点上正对照 ( p B T -
LGF2+pTRG-Gal11P)和负对照(重组 pBT+pTRG空
质粒)。37 ℃培养 24 h, 记录克隆的生长情况。
再把培养皿室温避光放置 15~18 h, 记录克隆的生
长情况。然后进行菌落 PCR 快速鉴定。分析用
pBT 和 pTRG 两对引物进行扩增。两对引物都能
扩增出条带的即为阳性克隆, 而且pBT引物扩增出
的是诱饵片段长度。筛出的克隆, 以备后来分离质
粒用。
6.4 目标pTRG质粒的分离 将质粒抽提方法参照
上面质粒提取, 提取混合质粒再转化XL1-Blue MRF
Kan感受态细胞(方法同前); 涂布含有四环素平板,
30 ℃培养24 h; 挑取50个阳性克隆, 再在含氯霉素
平板画线, 30 ℃培养 24 h, 没有生长菌落的克隆为
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只含有 pTRG 质粒, 找出对应的阳性克隆, 再抽提
质粒后, 得到目标 pTRG 和 pBT 载体的引物进行
PCR扩增, 挑取pTRG引物扩增有相应长度的片断,
而 pBT 引物的扩增没有产物出现。
6.5 再次共转化验证分离的目标pTRG质粒 重组
pBT质粒与分离出的目标pTRG质粒共转化报告感
受态菌株。在非筛选培养基上验证共转化成, 再在
筛选培养基上验证其互作。空 pBT 质粒与分离出
的目标 pTRG质粒共转化报告株系, 在筛选培养基
上, 验证缺少诱饵的 pTRG质粒能否单独激活双杂
交系统。重组pBT质粒DNA与分离出的目标pTRG
质粒 DNA 共转化报告株系, 保存阳性克隆。
6.6 目标 pTRG质粒测序和分析 序列分析采用
Blast 软件进行比较(NCBI, National Center for Bio-
technology Inform-ation) (http://www.ncbi.nlm.nih.
gov/BLAST)。
实验结果
1 pBT-GmWNK1和pBT-GmWNK1C质粒的鉴定
对获得的诱饵重组质粒, 采用不同的方法验证
其准确性, 确定是否用以文库的筛选。用 pBT 质
粒两端通用引物进行 PCR 扩增。电泳结果显示, 2
条带与预期的大小相吻合, 表示2个片段已经成功
插入 pBT质粒(图 2-a)。同时采用EcoRI和XhoI双
酶切 pBT-GmWNK1和BT-GmWNK1C两个质粒。
如图 2-b 显示, 酶切 2 条带, 上面为 pBT质粒, 下面
为GmWNK1和GmWNK1C两个片段, 大小与目标
片段吻合, 进一步说明 2个重组质粒装载成功。为
了鉴定重组质粒是否能够表达出目标蛋白, 本试验
在大肠杆菌中用 IPTG 诱导 pBT-GmWNK1 和 BT-
GmWNK1C重组质粒, 结果证明能够表达出目标蛋
白。同时我们利用 pBT 质粒上提供的抗体进行免
图 2 验证 pBT-GmWNK1 和 pBT-GmWNK1C 的质粒构建
Fig.2 Identification of the pBT-GmWNK1 and pBT-GmWNK1C constructions
a: PCR 扩增 2 个片段, M 为 DNA 分子量标准; 1 为 GmWNK1; 2 为 GmWNK1C, 以下相同; b: EcoRI 和 XhoI 双酶切 pBT-GmWNK1
和 pBT-GmWNK1C; c: Western blot 检测 pBT-GmWNK1 和 pBT-GmWNK1C 的蛋白表达。
疫杂交。如图 2-c 显示, 明显有一条杂交带, 说明
该基因在 pBT 质粒可以正确的表达出蛋白。
2 pBT-GmWNK1和pBT-GmWNK1C自身转录激
活活性的鉴定
本试验将 pBT-GmWNK1和 pBT-GmWNK1C
两个重组质粒分别与 pTR G 空质粒、阳性对照
(pBT-LGF2与pTRG-Gal11p)和阴性对照(pBT-LGF2
与 pTRG)共转化大肠杆菌感受态菌株 Bacterio-
Match II reporter。结果显示在筛选培养基上(含 5
mmol.L-1 3-AT), 共转化 pBT-GmWNK1 和 pBT-
GmWNK1C质粒分别与pTRG空质粒, 及阴性对照
均不生长出克隆, 而在非筛选的培养基上(不含 3-
AT)能够生长, 说明共转化是成功的。但是, 阳性
对照在非筛选和筛选培养基上均能生长。说明该
重组质粒没有自激活活性, 可以用于下一步文库筛
选。
3 大豆根部pTRG载体cDNA文库的构建
3.1 大豆根系总RNA提取、mRNA的分离和cDNA
的合成 大豆根部RNA采用Trizol (Invitrogen)提取
方法。由于全长 cDNA文库构建需要的 mRNA 量
较大, 本试验分离大约 8 μg的 mRNA, 结果如图所
示(图3-a), 表明分离的mRNA的完整性和总量都较
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好。OD260/OD280在 2.0左右, 而且mRNA主要分布
于 800~4 000 bp范围内, 完全可以用于 cDNA文库
构建。图3-b是检测cDNA的合成, 结果表明cDNA
合成的量和大小都很好。
3.2 cDNA片段分级 经 XhoI 酶切后的双链 cDNA
与大量的小片段DNA及引物混合在一起, 这些小片
段的核苷酸不仅会影响后期载体的连接, 还会影响
文库的片段大小和全长 cDNA的比例。双链DNA
在与载体连接之前需要对其作分级处理, 以消除小
片段核苷酸对连接的影响。本试验采用过柱方法,
尽量收集大的片段构建文库。分别从收集的不同
大小的片段中取出电泳检测, 结果如图 4 所示, 从
1到11泳道片段从大到小呈梯度排列, 根据结果取
大于 500 bp 的片段用于文库构建。
3.3 通过计算转化子数目确定cDNA文库的连接效
率和文库插入子大小的验证 库容量是cDNA文库
质量评价的最为重要的参数之一, 它是指原始文库
图 4 cDNA片段的大小分级
Fig.4 Size fractionation of cDNA
1~11 表示不同大小的分离样品; M: DNA 分子量标准。
中所包含的独立克隆个数, 反映了此文库能否真正
代表建库所用组织的实际表达的基因。计算 1 号
板的克隆数是 20 个, 2 号板的克隆数 46 个, 6 号板
的克隆是 40个。根据公式可以推算该文库的容量
大于 1×106 转化子。从文库中随机挑取克隆进行
PCR 扩增。如图 5 所示, 插入片段的大小不等, 均
大于 500 bp。说明本文库的重组率接近 100%。
图 5 cDNA文库插入片段检测
Fig.5 Detection of the insertion fragment size
of the cDNA library
3.4 从cDNA文库筛选与GmWNK1相互作用的阳
性克隆 通过共转化 p B T - G m W N K 1、p B T -
GmWNK1C质粒分别与大豆pTRG-cDNA文库, 同
时转化阳性对照 pBT-LGF2和pTRG-Gal11p。根据
转化子在非筛选培养基上的生长数, 推算出本试验
筛选了 10 万个以上转化子。转化培养 36 h 后, 能
够在筛选培养基上生长的转化子共有 85个。延长
培养时间还可以长出一些相互左右较弱的转化子。
图 3 mRNA和 cDNA的电泳检测结果
Fig.3 PCR of mRNAs and cDNAs
a: mRNA; b: cDNA; M: DNA 分子量标准。
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相对于试剂盒提供的操作步骤, 本试验对共转化子
的进一步筛选作了一些改进。首先采取 PCR筛选
方法, 用pBT和pTRG两个载体两端的通用引物, 对
转化子进行PCR扩增, 当转化子同时能够扩出诱饵
片段和目的片段的转化子初步确定为候选克隆。
然后再通过复筛和双筛选, 最终分离 18 个阳性克
隆, 测序结果有10个编码已知蛋白(表1), 其他8个
为假阳性, 测序结果比对为载体序列。从测序结果
中挑选了 3 个克隆进一步验证。P2-19 编码催化
ABA代谢一个关键酶——8羟化酶。此酶与菜豆
的8羟化酶同源性达到93%, 拟南芥8´羟化酶达到
7 4% , 命名为 G mC YP70 7A 1 ( N CB I 序列号:
EF377341) (未发表); P1-29编码核酸结合蛋白(EST
图 6 细菌双杂交鉴定部分 GmWNK1 的相互作用蛋白
Fig.6 Identification of GmWNK1 interacting proteins by
bacterial two-hybrid system
表 1 细菌双杂交 cDNA文库筛选结果
Table 1 Screening fragments from cDNA library using pBT-GmWNK1 and pBT-GmWNK1C as baits
编号 同源基因 一致性 /% 相似性 /% 物种
P1-24 Ribosomal protein S15-like 9 1 9 6 拟南芥
P1-28 Auxin-repressed protein 7 4 7 7 洋槐
P1-29 Nucleic acid binding 5 6 6 3 拟南芥
P2-20 Protein transporter protein SEC61 gamma subunit-like 9 7 9 8 拟南芥
P2-19 Abscisic acid 8-hydroxylase 9 3 9 6 菜豆
CYP707A1 7 4 8 4 拟南芥
CYP707A3 7 4 8 5
CYP707A2 5 8 7 7
CYP707A4 5 6 7 4
P2-6-1 ATP binding/kinase/protein kinase/protein serine/threonine 6 7 8 0 拟南芥
kinase/protein-tyrosine kinase
P2-7-1 Repetitive proline-rich cell wall protein 1 precursor 9 8 9 8 大豆
P2-4-2 Asparagine synthetase 9 8 9 8 大豆
P2-12-5 ATP binding/damaged DNA binding 7 7 8 8 拟南芥
P2-13-2 Uclacyanin 3-like protein 8 9 8 9 大豆
P1 和 P2 分别代表 pBT-GmWNK1 和 pBT-GmWNK1C。
序列号: TC239815); P2-7-1 细胞壁富脯氨酸蛋白
(NCBI 序列号: P08012) (图 6)。
讨　　论
本研究选用大豆为实验材料, 主要因为大豆不
仅是影响国民经济的重要作物, 而且其基因组(1 300
Mb)目前基因组测序尚没有完全公布, 以致从大豆
上分离的完整基因非常有限。构建不同组织
cDNA 文库, 一方面可以永久保存基因资源, 另一
方面可以利用功能筛选、免疫学筛选、Southern杂
交和 EST 序列测定等现代分子生物学技术寻找与
生长代谢相关的功能基因, 探讨选择育种的理论机
制, 为提高大豆育种水平打下基础。评价一个文库
是否有实用价值主要在于文库的含量和插入片段的
大小两个方面。所构建的文库中必须有足够多的
克隆数, 这样才能确保基因组cDNA中的每一个序
列至少有一个拷贝存在于重组文库中。为达到这
一要求, 文库的容量应不小于 1.7×105 bp.mL- 1
(Lopian 等 2003)。同时为保证 cDNA 片段的完整
性, 插入片段的平均大小应不小于 1.0 kb。本研
究使用 Sepharose-2B 柱处理合成后的 cDNA, 收集
大于 500 bp 的 cDNA 片段。除去了多余的 EcoRI
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接头和小片段以保证文库中cDNA的长度, 减少后
期基因筛选的工作量(图 4)。我们所构建的 cDNA
文库容量为 1.0×106 bp.mL-1, 插入片段平均大小接
近为 1.0 kb, 完全符合构建文库的要求(图 5)。
蛋白质间相互作用的研究是了解蛋白质生物
功能的重要手段之一, 在功能基因组学研究中极为
重要。近年来, 随着微生物学、遗传学、生物化
学和分子生物学理论与技术的发展, 为解决蛋白质
间相互作用的问题提供了诸多解决方案。双杂交
系统就是其中一类具有特别意义的技术, 其中最为
常见的是酵母双杂交系统(Brachmann 和 Boeke
1997; Colas 和 Brent 1998)。而采用细菌代替酵母
双杂交系统具有如下优点: 大肠杆菌比酵母生长
快、转化效率比较高、质粒 DNA 抽提操作简便、
灵敏度高、一定程度上反映了细胞内的真实情
况。利用大肠杆菌筛选互作蛋白还可以大大减少
酵母中含有互作蛋白同源基因的不利影响。哺乳
动物上研究报道, WNK基因的不同结构域有着不同
的功能(Kahle等 2003, 2006)。本研究以GmWNK1
的2个不同片段做诱饵(图1), 运用该系统最终从大
豆根系cDNA文库中分离18个阳性克隆, 测序分析
有 10 个编码已知蛋白(表 1), 其他 8 个为假阳性。
其中有一个克隆编码脱落酸代谢分解酶, 体内体外
研究表明植物上该家族基因可能参与依赖ABA的
信号调控途径(未发表)。如前所述, 动物无赖氨酸
基因家族主要受渗透胁迫调控, 而作用不同的阳离
子和氯离子共转运子, 最终导致钠离子和氯离子的
过量吸收而导致高血压和高血钾(Kahle 等 2006)。
相对于动物, 本研究发现植物无赖氨酸基因家族主
要调控脱落酸信号途径是合乎逻辑的。此外, 细胞
壁富脯氨酸蛋白主要信号传导上游的因子, 该蛋白
与GmWNK1相互作用, 表明GmWNK1可能受细胞
壁富脯氨酸蛋白, 而再作用于下游目标因子。总
之, 本研究结果为揭示无赖氨酸基因家族未知的生
物学功能和调控机制提供了重要的参考数据和研究
材料。同时该系统的建立为大豆功能基因组研究
提供重要平台。
参考文献
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