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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2014年第2期
盐 酸 克 伦 特 罗（Clenbuterol，CLEN） 是 一 种
β2 受体激动剂，属于拟肾上腺素类药物，分子量为
313.7［1］。20 世纪 80 年代初，美国的一家公司发现
盐酸克伦特罗可以明显地促进动物的生长，并能有
效地增加瘦肉率［2］，它能够改变动物体内的代谢途
径，促进肌肉特别是骨骼肌中蛋白质的合成，抑制
脂肪的合成，从而加快家畜生长速度，相对增加瘦
肉比例。这一新发现很快被一些国家用于养殖业。
饲料中添加了盐酸克伦特罗后，可使猪牛羊等畜禽
生长速度、饲料转化率及胴体瘦肉率提高 10% 以上，
所以盐酸克伦特罗作为饲料添加剂一度被广泛使用。
但是后来科学家们发现人类过度摄入克伦特罗
会引起巨大的不良反应，严重的可能会发生急性中
收稿日期 ： 2013-08-12
基金项目 ：潍坊科技学院校级课题（博士基金）（W13K007）
作者简介 ：董金华，男，副教授，研究方向 ：生物学 ；E-mail ：newbio2010@gmail.com
噬菌体展示抗克伦特罗抗体文库的构建及
单克隆抗体的筛选
董金华1  唐玉海1  乔宁1  韩金宏1  董美华1  董益阳2
（1. 潍坊科技学院生物工程研发中心，山东 262700 ；2. 北京化工大学生命科学与技术学院，北京 100029）
摘 要 ： 利用小白鼠免疫和噬菌体展示技术构建了噬菌体展示抗体文库，从文库中筛选获得了一株抗克伦特罗单克隆抗体。
该抗体的氨基酸序列尚未在世界基因数据库中登录，是一个新的抗体。该抗体对于游离克伦特罗的半抑制率 IC50 为 0.602 μg/mL。
该噬菌体展示的抗体片段可以用于竞争法检测克伦特罗的含量，其能够检测出的最低浓度为 15.6 ng/mL，具有较大的实用价值。
关键词 ： 克伦特罗 抗体 噬菌体展示 免疫检测
Construction of a Phage-displayed Anti-clenbuterol Antibody Library
and Selection of Monoclonal Antibody
Dong Jinhua1 Tang Yuhai1 Qiao Ning1 Han Jinhong1 Dong Meihua1 Dong Yiyang2
（1. Department of Research and Development，Weifang University of Science and Technology，Shandong 262700 ；2. College of Life Science
and Technology，Beijing University of Chemical Technology，Beijing 100029）
Abstract:  An anti-clenbuterol antibody was developed by immunization of mouse and construction of a phage displaying antibody library.
The antibody has a novel sequence and the utilization of gene segments in germline was also identified. With this antibody, a competitive assay
was performed and gave a limit of detection of 15.6 ng/mL. The IC50 of phage-antibody with free clenbuterol against immobilized bovine serum
albumin conjugated clenbuterol was 0.602 μg/mL. All the results suggested that the antibody is useful in practical applications.
Key words:  Clenbuterol Monoclonal antibody Phage display Detection
毒，甲状腺功能亢进，心律失调等症状［3］。20 世纪
80 年代末期开始，在世界各地发生了多起克伦特罗
中毒事件，我国在近几年也时有发生。1997 年中国
香港 17 位居民因食用含有克伦特罗的猪内脏而中
毒；1998 年中国大陆首次发生的“瘦肉精”中毒事件，
2001 年在浙江省桐庐县因食用被克伦特罗污染的猪
肉及猪内脏而导致 180 余人中毒，广东省河源市发
生特大瘦肉精中毒事件，共 484 人中毒 ；2006 年上
海连续发生“瘦肉精”食物中毒事故，300 多人中
毒；2011 年 3 月 15 日，央视“3·15”特别节目《“健
美猪”真相》再一次将瘦肉精推到风口浪尖。另外，
近几年有些运动员也因误食被克伦特罗污染的猪肉
而被检出体内有兴奋剂而受到影响。2004 年 3 月，
2014年第2期 137董金华等 ：噬菌体展示抗克伦特罗抗体文库的构建及单克隆抗体的筛选
国家食品药品监督管理局、公安部、农业部、商务部、
卫生部等八个部局联合发布文件，阻止违禁添加剂
留下养殖行业，加强对瘦肉精的防堵。但此后依然
有生产商非法制造、销售及使用该化学药品。目前
对该药品的检测多使用液相色谱或者气相色谱，而
上述方法均需要昂贵的设备及仪器，很难普及应用。
利 用 抗 体 测 定 抗 原 的 方 法 叫 免 疫 测 定 法
（Immunoassay），该方法不需要大型且昂贵的设备，
相对来说实施容易，测定成本低，近几年来得到了
很大的发展。抗体技术经历了多克隆抗血清及单
克隆抗体的开发，现在已经发展到了基因工程抗
体阶段。 抗体的抗原结合片段（Fragment，antigen
binding，Fab） 及 单 链 抗 体（Single chain variable
region，ScFv）作为基因工程抗体的代表，具有与全
长抗体同等的抗原结合功能，可以取代全长抗体用
于免疫学测定［4］。 抗体 Fab 片段包含有抗体的轻链
（Light chain）和重链的可变领域（Variable region，
VH）及一个恒定领域（Constant region 1，CH1），在
保持有抗体原有的抗原结合功能的同时，又具有很
强的稳定性。Fab 片段的分子量只有抗体分子量的
1/3，因此在用于医药时同 ScFv 片段相似，具有组
织传透能力强，免疫原性低等优点［5］。噬菌体抗体
展示技术最早是在 20 世纪 90 年代初由 Winter 等开
发成功［6］。该技术的核心是通过将抗体的表型和基
因型相联系，从构建的抗体库中筛选抗体的同时可
以获得编码该抗体的基因，为目前抗体开发中最常
用的技术之一。
本研究使用牛血清蛋白与克伦特罗的偶联物
（BSA-CLEN）对小白鼠进行免疫，利用噬菌体展示
技术构建噬菌体展示抗体文库，并通过对该偶联物
进行淘筛获得一株能够与克伦特罗特异结合的抗体。
1 材料与方法
1.1 材料
克伦特罗与牛血清蛋白的偶联物（BSA-CLEN）
系购自杭州南开日新生物技术有限公司 ；游离盐酸
克伦特罗购自中国药品生物制品检定所 ；总 RNA 提
取试剂盒购自北京百泰克生物技术有限公司 ；大肠
杆菌 DH5α 购自 TaKaRa 生物技术有限公司 ；大肠杆
菌 TG-1 购自 Amersham Bioscience（日本东京）；克
隆基因用的限制性内切酶、聚合酶等均购自 TaKaRa
生物公司 ；其他试剂均为国产分析纯。
载 体 pIT2 源 自 英 国 MRC。 辅 助 噬 菌 体 M13-
KO7 购自 New England Biolabs（MA，USA）。
扩增抗体用的引物是根据 GenBank 数据库中鼠
源抗体重链及轻链可变领域基因序列及其他文献中
的序列设计并由 Invitrogen Inc.（日本东京）合成。
所用引物的序列见表 1。
1.2 方法
免疫小白鼠后提取脾脏细胞的总 RNA，并以其
为模板扩增抗体的基因，用限制性内切酶处理后的
抗体基因克隆至噬菌体展示载体，转染感受态大肠
杆菌，制作抗体展示文库。固定抗原后对该抗体文
库进行淘筛，最后获得具有克伦特罗特异性的单克
隆抗体（图 1）。
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ᨀਆ㝮㜿㓶㜎㓶㜎ᙫRNA
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图 1 盐酸克伦特罗单克隆抗体制备流程图
1.2.1 动物试验 两只 BALB/c 小白鼠用于 BSA-CL-
EN 免疫。免疫隔周进行 4 次，每次用量为 100 μg。
完全弗氏佐剂用于增加免疫效果。最后一次免疫 1
周后，从小白鼠的尾部取血确认免疫效果。免疫成
功后，提取小白鼠脾脏细胞，用于提取总 RNA。
1.2.2 脾细胞总 RNA 的提取 按照试剂盒的说明，
运用 Trizol 法提取总 RNA，并对之进行甲醛变性
琼脂糖电泳分析。同时通过紫外分光光度法测定总
RNA 的纯度。
1.2.3 扩增抗体可变区域的基因 抗体可变区域的
基因是利用 TaKaRa 公司的 PrimeScript One Step RT-
PCR Kit Ver.2 进行扩增。根据试剂盒说明书，首先利
用 PrimeScript® RTase 以 RNA 为模板合成 cDNA，然
后直接在反应系中利用 TaKaRa Ex Taq® HS 完成抗体
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第2期138
基因的 VH 和 VL 扩增。扩增条件为 94℃预变性 30 s，
55℃退火 30 s，72℃延伸 30 s，进行 35 个循环后
72℃延伸 10 min，1.5% 琼脂糖凝胶电泳对 PCR 扩增
产物进行检测，并使用胶回收试剂盒回收扩增产物。
1.2.4 构建抗体文库载体 使用限制性内切酶 Sal I
和 Not I 将回收的抗体可变领域基因 VL 消化并纯化
后，将其与用同样酶处理的 pIT2 载体［7］连接，连
接反应使用 TOYOBO 的 Ligation High Ver.2 进行 30
min，然后将连接产物转化进大肠杆菌 DH5α 感受态
细胞，稀释培养菌液滴定 VL 文库库容的大小，培
养剩余大肠杆菌过夜提取质粒。将载体进行 Sfi I 和
Xho I 双酶切处理后回收纯化目的片段，并使之与
同样双酶切处理的 VH 基因连接，转化入大肠杆菌
TG-1，滴定抗体文库的大小，随机挑斑进行培养并
对抗体文库进行鉴定。培养剩余菌液用于制作噬菌
体展示抗体文库。
1.2.5 制作抗体展示文库 使用 2YTA 液态培养基
（含有 100 μg/mL 的 Amp 的 2YT 培养基） 培养转化
后的大肠杆菌 TG-1 至 OD600 约为 0.6，以 MOI=20 的
比例加入辅助噬菌体 M13-KO7（New England Biola-
bs，MA，USA），保持菌液在 37℃ 30 min，然后以
3 000×g 的速度离心 10 min，去上清后加入 50 mL
的 2YTAK（含有 100 μg/mL 的 Amp 和 50 μg/mL Kan
的 2YT 培养基），悬浮菌体，30℃振荡培养过夜。
1.2.6 噬菌体展示抗体文库的回收 以 1 000×g 的
速度离心培养菌 30 min 后，量取上清并加入 1/4 体
表 1 用于扩增抗体可变领域基因的引物
引物名称 序列（5- 3）
VH1 TATGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCSAGGTYCAGCTBCAGCAGTC（Sfi Ⅰ位点）
VH2 TATGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCCAGGTTCACCTGCAGCARTC（Sfi Ⅰ位点）
VH3 TATGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCCAGGTRCAGCTGAAGGAGTC（Sfi Ⅰ位点）
VH4 TATGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCCAGGTCCAACTVCAGCARCC（Sfi Ⅰ位点）
VH5 TATGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCCAGATCCAGTTGGTVCAGTC（Sfi Ⅰ位点）
VH6 TATGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCCAGGTGCAGCTGAAGSASTC（Sfi Ⅰ位点）
VH7 TATGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCGAGGTGCAGSKGGTGGAGTC（Sfi Ⅰ位点）
VH8 TATGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCGAGGTGAARSTTGAGGAGTC（Sfi Ⅰ位点）
VH9 TATGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCGAKGTSVAGCTTCAGGAGTC（Sfi Ⅰ位点）
VH10 TATGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCGAGGTGAASSTGGTGGAATC（Sfi Ⅰ位点）
VH11 TATGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCGAGGTGAAGCTGRTGGARTC（Sfi Ⅰ位点）
VH12 TATGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCGARGTGAAGCTGRTGGAGTC（Sfi Ⅰ位点）
VH13 TATGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCGAAGTGCAGCTGTTGGAGAC（Sfi Ⅰ位点）
VH14 TATGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCGARGTGAAGCTTCTCSAGTC（Sfi Ⅰ位点）
VH15 TATGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCCARGTTACTCTGAAAGAGT（Sfi Ⅰ位点）
JH1 ACTGCTCGAGACGGTGACCGTGGTCCC（Xho I 位点）
JH2 ACTGCTCGAGACTGTGAGAGTGGTGCC（Xho I 位点）
JH3 ACTGCTCGAGACAGTGACSCAGAGTCCC（Xho I 位点）
JH4 ACTGCTCGAGACGGTGACTGAGGTTCC（Xho I 位点）
VK1 TATTCGTCGACGGATATTGTGATGACBCAGDC（Sal I 位点）
VK2 TATTCGTCGACGGATRTTKTGATGACCCARAC（Sal I 位点）
VK3 TATTCGTCGACGGAAAATGTGCTCACCCAGTC（Sal I 位点）
VK4 TATTCGTCGACGGAYATTGTGATGACACAGTC（Sal I 位点）
VK5 TATTCGTCGACGGACATCCAGATGACACAGAC（Sal I 位点）
VK6 TATTCGTCGACGGAYATTGTGCTSACYCARTC（Sal I 位点）
VK7 TATTCGTCGACGGACATCCAGATGACYCARTC（Sal I 位点）
VK8 TATTCGTCGACGCAAATTGTTCTCACCCAGTC（Sal I 位点）
JK1/2 TTCTCGTGCGGCCGCACGTTTKATTTCCAGCTTGG（Not I 位点）
JK4 TTCTCGTGCGGCCGCACGTTTTATTTCCAACTTTG（Not I 位点）
JK5 TTCTCGTGCGGCCGCACGTTTCAGCTCCAGCTTGG（Not I 位点）
划线部分为导入限制酶的序列
2014年第2期 139董金华等 ：噬菌体展示抗克伦特罗抗体文库的构建及单克隆抗体的筛选
积的 PEG/NaCl 溶液（20% 聚乙二醇 6000，2.5 mol/L
NaCl），于 4℃保持 60 min，然后 4℃，1 000×g 的速
度离心，完全弃上清后加入适量的高压灭菌的 PBS
溶 液（KH2PO4 1.47 mmol/L ；Na2HPO4 8.10 mmol/L ；
NaCl 136.89 mmol/L ；KCl 2.68 mmol/L）将沉淀溶解，
制得噬菌体展示抗体文库。滴定该抗体库的滴度，
并用于抗体的筛选。
1.2.7 抗 体 的 筛 选 将 100 μL 的 BSA-CLEN（10
μg/mL）分别加入到 3 个微孔中，4℃过夜 ；第 2 天
倒掉溶液并加入 MPBS（含有 2% 脱脂牛奶的 PBS
溶液）在室温下保持 2 h 封闭微孔 ；将 1.2.6 中回收
的噬菌体溶液以 MPBS 稀释至 109CFU/100 mL（CFU：
Colony Form Unit）的浓度并在每个微孔中加 100 μL，
室 温 保 持 1 h ；用 PBST（ 含 有 0.1%TWEEN20 的
PBS 溶液）在洗板机（BIO-RAD，1575）上洗板 10
次后用甘氨酸-HCl（pH2.7）将固定在微孔板上的噬
菌体溶出 ；溶出的噬菌体用于感染大肠杆菌并制作
第二轮淘筛用抗体文库。重复以上操作 3 次，浓缩
抗体文库中的抗原特异抗体，并用 ELISA 法来鉴定
抗原特异性抗体的浓缩效果。
1.2.8 单克隆抗体的筛选 在 96 孔培养用孔板内
加入 200 μL 的 2YTA 培养基，挑取 96 个克隆并在
37℃培养至 OD600 约为 0.6，用辅助噬菌体感染菌体
如 1.2.6 所述制作噬菌体 ；同时在 96 孔的微孔板内
4℃ 过 夜 加 入 100 μL 的 BSA-CLEN（1 μg/mL）， 封
闭后每个孔内加入 100 μL 的噬菌体溶液（80 μL 的
MPBS 中加入 20 μL 的噬菌体溶液）并在室温下保持
1 h ；使用洗板机洗板 3 次后加入抗噬菌体抗体 Anti-
M13 antibody/HRP（GE health，MA，USA）； 再 次
在 室 温 下 保 持 1 h， 洗 板 后 加 入 底 物 TMBZ 溶 液
（Sigma ；100 μg/mL TMBZ 和 0.04 μL/mL H2O2 in 100
mmol/L NaOAc，pH6.0）；室 温 保 持 5 min 后 加 入
10% 的 H2SO4 终止反应，测定样品在 450 nm 波长下
的吸光度。
1.2.9 单克隆抗体的分析 挑选 8 个阳性克隆 A2、
A3、B1、D1、E1、G12、H5 及 H6 培养后委托上海
生物工程有限公司对其序列进行了分析。重链和轻
链序列解析用的引物分别为 M13RV ：5-GGAAACA-
GCTATGACCATG-3 和 pVLBack ：5-CACTGGCTGGT-
TTCGCTAC-3。抗体序列的分析使用了 GENYTYX 软
件（GENETYX CORPORATION，日本东京），抗体
可变领域的互补决定区（Complementarity-Determining
Region，CDR）［8］ 的 分 析 使 用 了 NCBI IgBLAST
（http ：//www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/）。
1.2.10 竞争法测定溶液中克伦特罗的浓度［9］ 利
用噬菌体展示的 A2 克隆测定了溶液中克伦特罗的
浓 度。 即 在 96 孔 的 微 孔 板 上 固 定 BSA-CLEN（1
μg/mL）后进行封闭，然后将噬菌体-抗体溶液和系
列稀释的游离克伦特罗溶液（浓度为 0、0.016、0.08、
0.4、2 和 10 μg/mL）混合后加入到微孔中，每个浓
度设置 3 个重复；室温下保持 1 h 后，用洗板机洗板，
然后加入 HRP 修饰的抗噬菌体抗体，继续在室温下
保持 1 h，清洗微孔板后添加底物 TMBZ 显色，测定
在波长 450 nm 下吸光度，绘制标准曲线。
2 结果
2.1 抗体基因的扩增
抗体重链及轻链可变区域的基因 VH 及 VL 得以
成功扩增，如图 2 所示，VL 基因的大小约为 350 bp，
VH 基因稍大。虽然在目的条带的上方有两条非特异
DNA 也被扩增，但通过电泳后切出目的条带，不会
对基因的克隆造成影响。
M ：100bp DNA ladder ；VL ：抗体轻链可变区域基因 ；VH ：抗体重链可变区
域基因
图 2 抗体可变区域基因的增幅（A）与噬菌体展示抗体库
的构建（B）
1000
bp
M VL M VL
500
100
lac RBS pelB linker myc glll
VL
Not ISal I
Xho ISfi I
VH
promoter leader
pCLEN-Lib
colE1 ori amp M13 ori
A
B
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第2期140
2.2 噬菌体展示抗体文库的构建
噬菌体展示抗体文库分两步构建，因为在抗体
与抗原结合时，抗体的重链的作用大于轻链，所以
为保证抗体文库库容中重链的多样性，首先将 Sal I
和 Not I 双酶切处理的 VL 基因连接至目标载体，得
到 1 个 4.3×106 的轻链文库。然后将用 Sfi I-Xho I 处
理的抗体重链基因连接到含有轻链抗体基因的载体
内，转化大肠杆菌，完成了抗体文库的构建。经过
滴定确定构建的抗体文库的库容为 5.6×106 CFU。
2.3 克伦特罗抗体的浓缩
通过噬菌体 ELISA 对特异抗体的浓缩效果做了
鉴定。如图 3 所示，原始文库 R0 及淘筛过程中的 3
个子文库 R1，R2，R3 都不能跟 BSA 结合，而对于
BSA-CLEN，虽然 R0，R1 噬菌体未与其结合，但使
用了 R2 和 R3 噬菌体试验样的信号显著增加，其中
R2 的信号强度高于 R3。这表明在 R2 和 R3 子抗体
文库中能够跟 BSA-CLEN 特异结合的抗体明显增多，
显示针对 BSA-CLEN 的淘筛获得成功。
0.7
0.6
R0
R1
R2
R3
0.5
0.4
0.3
A
bs
or
ba
nc
e45
0
nm

0.2
0.1
0
BSA CLEN-BSA
Immobilized protein
R0 ：原始抗体文库 ；R1，R2，R3 ：淘筛过程中得到的子文库 ；BSA ：牛血
清蛋白 ；BSA-CLEN ：牛血清蛋白与克伦特罗的偶联物
图 3 盐酸克伦特罗特异噬菌体抗体的富集
株抗体的基因序列完全相同，系同一个克隆。图 5
显示 A2 抗体的基因及氨基酸的序列。抗体重链的
可变领域分为 V 片段，D 片段及 J 片段，而轻链为
V 片段和 J 片段。每个片段的基因又由几个到几十
个不同序列的基因组成，这些基因的自由组合构成
了具有一个 V-D-J 编码的重链和一个 V-J 编码的轻
链。 其自由组合在抗原刺激 B 细胞而形成浆细胞后
完成，从而在 V（D）J 编码下分泌含有不同氨基酸
的序列，产生多种多样的免疫应答。A2 抗体重链的
V 片段与鼠源抗体 IGHV3-21*04 的相同性最大，为
85.1%，D/J 片 段 则 与 IGHD3-16*02 及 IGHJ4*02 有
100% 的相同性。该抗体的轻链 V 片段与鼠源抗体
轻链 IGVKV-11*01 相同性最大，为 70.5%，其 J 片
段为 IGKJ4*02。在抗体数据库中没有检索到与 A2
抗体具有完全相同氨基酸序列的单克隆抗体，因此
该抗体是一个新型抗体。
抗体可变区中的互补决定区 CDR 是与抗原表位
直接结合的部位，决定该抗体的抗原特异性。图 5
方框内的序列为抗体可变区的 6 个互补决定区。
2.6 应用A2抗体测定溶液中克伦特罗的含量
利用噬菌体展示的抗体（Phage-A2Fab），竞争
法（Competitive ELISA）测定溶液中克伦特罗的含量。
结果如图 6 及表 2 所示，当溶液中游离的克伦特罗
含量低时，溶液中的 Phage-A2Fab 跟固定在微孔板
上的 BSA-CLEN 结合，洗板后在微孔中加入 HRP 修
饰的抗噬菌体抗体，该抗体跟固定在微孔板表面的
Phage-A2Fab 结合，洗板后加入底物显色。因结合的
Phage-A2Fab 多，其最终的信号强度也大。而随着溶
0
A B C D
Clone name
E F G H
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
1.4
1.6
1.8
2.0 1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
A
bs
or
ba
nc
e45
0
nm

* 英文字母与阿拉伯数字的组合表示克隆在 96 孔微孔板上的位置
图 4 盐酸克伦特罗单克隆抗体的筛选
2.4 单克隆抗体的筛选
制作了 96 种展示不同抗体克隆的噬菌体，并通
过 ELISA 法对这 96 种噬菌体的抗原结合特性作了
评价。结果如图 4 所示，数十个克隆显示了对 BSA-
CLEN 的特异性。其中挑选 8 个阳性克隆 A2、A3、
B1、D1、E1、G12、H5 及 H6，对其序列进行了分析。
2.5 抗体的序列
通过对挑选的 8 株抗体的序列分析发现，这 8
2014年第2期 141董金华等 ：噬菌体展示抗克伦特罗抗体文库的构建及单克隆抗体的筛选
图 5 抗体 A2 重链（A）及轻链（B）可变领域基因的核苷酸以及氨基酸序列
1
61
121
181
241
301
1
61
121
181
241
301
60
120
180
240
300
348
60
120
180
240
300
324
液中游离克伦特罗浓度的上升，溶液中部分 Phage-
A2Fab 与游离的克伦特罗结合，因此跟微孔板上固
定的 BSA-CLEN 结合的抗体便减少，信号的强度也
逐渐降低。通过绘制标准曲线，求得该曲线的半抑
制率（IC50）为 0.602 μg/mL。同时以未添加抗原的
样品的吸光度减去 3 倍标准偏差计算得出该测定法
能够检测出克伦特罗的最低量（Limit of detection ；
LOD）为 15.6 ng/mL。
河［10］。而在其后由 Winter 等开发噬菌体展示技术
则实现在了抗体的表型和基因型的连接，即在获得
抗体的同时也能够得到抗体的基因，为开发抗体的
分子药物奠定了基础。 抗原结合片段 Fab 与单链可
变领域抗体片段（ScFv）因为具有分子小，组织穿
透性好，在血液中的半衰期短等特点，相对于全长
抗体具有很大的优势。
本研究通过用克伦特罗与 BSA 的偶联物免疫小
白鼠及制作噬菌体展示抗体文库的方法克隆了一株
抗克伦特罗的单克隆抗体 A2。因为在现有的抗体数
据库中没有检索到与 A2 具有相同序列的抗体，所以
这是一个新的抗体。通过对 A2 抗体基因的分析发
现，该抗体重链可变领域的 CDR2 部分由 17 个氨基
酸组成，远远长于只有 5-9 个氨基酸组成的其他的
CDR，这符合小分子及半抗原鼠源抗体的特点［11， 12］。
0 0.0016 0.08 0.4 2 10
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
A
B
S4
50
n
m

Concentration of free Clenbuterolµg/mL
图 6 利用 A2 噬菌体抗体竞争法检测测克伦特罗含量的标
准曲线
表 2 克伦特罗标准溶液的测定结果
克伦特罗浓度
（μg/mL）
450 nm 吸光值
标准偏差
样品 1 样品 2 样品 3 平均值
0 0.907 0.91 0.915 0.911 0.00404
0.0016 0.884 0.872 0.867 0.874 0.00874
0.08 0.812 0.81 0.802 0.808 0.00529
0.4 0.548 0.56 0.55 0.553 0.00643
2 0.221 0.235 0.213 0.223 0.0111
10 0.068 0.063 0.066 0.0657 0.00252
3 讨论
抗体开发有着较长的历史，其中 20 世纪 70 年
代开发的杂交瘤技术为制作单克隆抗体开创了先
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第2期142
利用免疫动物的抗体基因构建抗体文库，因为
经过了免疫系统的选择压力，抗体文库中针对免疫
抗原的特异性丰度高于其他非特异性抗体，其中一
部分抗体经过了免疫系统的亲和力成熟过程，因此
从这次构建的抗体中筛选到了具有高亲和力和特异
性的抗体。一般而言，噬菌体展示抗体文库的库容
与所筛选到的抗体的亲和力成正比关系，即库容越
大，能够筛选到的抗体的亲和力就越大［13］。 尽管
该抗体能够跟克伦特罗特异性结合并能应用于竞争
法检测溶液中克伦特罗的含量，但因为受抗体文库
库容的限制，其亲和性依然有较大的开发余地。噬
菌体展示法的另外一个优势是可以通过制作合成抗
体库完成抗体的试管内进化。今后我们将以该抗体
为框架，并将其 CDR 的一部分随机变异，制作合成
抗体文库并进行淘筛，开发具有更高亲和性的抗体。
在本研究中，将 A2 抗体应用于竞争法测定游
离克伦特罗的浓度，其 LOD 为 15.6 ng/mL。随着科学
技术的进步，科学家们已经开发出了如 Quenchbody
Technology［14］，MusTag Technology［15］， 及 Phage-Im-
muno PCR［16］等测定迅速且灵敏度高的免疫测定方
法。若将本研究中开发的 A2 抗体应用于以上科研
成果，可开发出灵敏度更高，操作更加简单的克伦
特罗检测技术。
参 考 文 献
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（责任编辑 李楠）