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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2013年第8期
人 溶 血 磷 脂 酸 受 体 1（LPAR1） 是 G-蛋 白 偶
联受体家族、EDG 亚家族成员（EDG family）［1-3］，
LPAR1 在人体正常组织中普遍表达并可在溶血磷脂
收稿日期 ：2013-05-23
基金项目 ：国家自然科学基金项目（31260210），高等学校博士学科点专项科研基金联合资助课题（20121501110002）
作者简介 ：李铁威，男，研究方向 ：生物化学与细胞信号转导 ；E-mail ：litieweind@163.com
通讯作者 ：阿拉坦高勒，博士，教授，研究方向 ：生物化学电子与细胞信号转导 ；E-mail ：bigaole@imu.edu.cn
人溶血磷脂酸受体 1 基因的克隆、表达载体构建及
瞬时转染 293T 细胞
李铁威 赵鹏飞 马洁 阿拉坦高勒
（内蒙古大学生命科学学院，呼和浩特 010021）
摘 要 ： 从人胃癌细胞中提取 RNA 然后反转录成 cDNA，进而 PCR 克隆 LPAR1（Lysophosphatidic Acid Receptor1）基因，亚
克隆到 pCR2.1 载体，通过测序、酶切、连接到表达载体 pIRES2-EGFP，通过酶切、测序鉴定获得 pIRES2-EGFP-LPAR1 重组质
粒 ；表达载体以 Lipofectamine2000 介导转染 293T 细胞。用 Real-time PCR 法检测外源基因在 293T 细胞中表达，并通过 ELISA 检测
LPAR1 的活性。结果表明，克隆到 LPAR1 基因并获得了 pIRES2-EGFP-LPAR1 表达载体，在 293T 细胞中确认到 LPAR1 基因的过
量表达，并通过 LPAR1/Gi 信号通路抑制 cAMP 形成加以验证所克隆 LPAR1 活性。LPAR1 过表达细胞模型的建立，不仅为下一步
对该受体功能研究奠定了基础，还使利用 LPA 剂量依赖性的抑制 cAMP 的线性关系定量 LPA 的细胞学方法成为可能。
关键词 ： LPAR1 基因克隆 转基因细胞模型 cAMP 应答
Cloning and Construction of Expression Vector of Human
Lysophosphatidic Acid Receptor LPAR1 and Its Transient
Transfection into 293T Cell
Li Tiewei Zhao Pengfei Ma Jie Alatan Gaole
（College of Life Sciences，Inner Mongolia University，Huhhot 010021）
Abstract: To detect the over-expression of LPAR1 and the accumulation of cAMP in transfected 293T cells, human LPAR1 gene was
cloned and the LPAR1 expressing vector was constructed. LPAR1 CDS sequence was cloned from human gastric cancer cells and sub-cloned
into the pCR2.1 vector. By sequencing, digestion and ligation, LPAR1 was directionally cloned into eukaryotic expression plasmid pIRES2-
EGFP. The reconstructed plasmid was identified with enzyme digestion and sequencing ；the plasmid was transfected into 293T cells with
lipofectamine2000. Real-time PCR was performed to assess exogenous LPAR1 expression in 293T cells. ELISA was used to detect the activity
of LPAR1. These results indicate that the expression vector containing human LPAR1 gene has been established and LPAR1 gene has also
been over-expressed successfully in 293T cells. Through the signaling pathways downstream of LPAR1 mediated under the stimulation of LPA
demonstrates the activity of the cloned gene expression of LPAR1 protein. The establishment of LPAR1-overexpressing cell model, not only
provides the foundation to research the function of LPAR1 in the next step, but also make it possibly for quantitative the concentration of LPA
through the linear relationship between LPA and cAMP.
Key words: LPAR1 Gene cloning Transgenic cell model cAMP response
酸（Lysophosphatidic Acid，LPA） 的 诱 导 下 与 Gi、
Gq、G12/13 偶联介导诸多的细胞生理反应，如细胞
增殖、分化、血小板凝集以及在肿瘤细胞中促进细
2013年第8期 171李铁威等 ：人溶血磷脂酸受体 1 基因的克隆、表达载体构建及瞬时转染 293T 细胞
胞的能动性、迁移等生物活性［4-8］。人的 LPAR1 基
因位于人基因的 9q31.3 区，CDS 区长 1 095 bp，编
码 364 个氨基酸形成七次疏水跨膜蛋白结构，分
子量大约为 41 kD［7，9-11］。LPAR1 能够感知细胞外
LPA 的 刺 激 与 Gi 蛋 白 偶 联 抑 制 cAMP 的 生 成［9］。
随着对 LPAR1 介导的信号通路的深入研究发现，
LPAR1 可能参与细胞增殖与迁移及其相关疾病过
程［3，12，13］。为进一步研究 LPAR1 参与动脉硬化、
肿瘤等疾病的发生、发展及迁移等问题，本研究克
隆了 LPAR1 基因并构建表达载体，瞬时转染细胞，
检测细胞内 cAMP 的积累，旨在为进一步研究溶血
磷脂酸受体 LPAR1 的功能研究奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 试验细胞及主要试剂 人胃癌细胞 BGC803
（本研究室保存）。限制性内切酶 BamH Ⅰ、Xho Ⅰ、
DNase 及 T4 DNA 连接酶（Thermo Scientific 公司）；
TranStart Taq DNA polymerase（北京全式金公司）；
总 RNA 提取试剂盒、胶回收试剂盒（上海生工生
物有限公司）；胎牛血清（Hyclone 公司）；DMEM
高糖（Gibco 公司）；胰酶（Hyclone 公司）；脂质体
LipofectamineTM2000（Invitrigen 公司）；DNA 分子量
标准（北京中科瑞泰公司）、反转录试剂盒（TaKaRa）、
实 时 定 量 试 剂 盒（ 北 京 康 为 世 纪 ），pCR2.1 载 体
（Invitrogen 公 司 ）；pIRES2-EGFP（Clontech）；293T
细胞（本研究室保存），LPA（Sigma），ISP（Isopr-
oterenol，异丙肾上腺素，Sigma），ELISA 试剂盒（AAT
Bioquest），其他试剂均为国产分析纯。
1.1.2 主要仪器 PCR 仪为 ABI 公司产品，凝胶电
泳仪和荧光定量 PCR 仪为 Bio-Rad 公司产品，荧光
倒置显微镜为尼康公司产品。
1.2 方法
1.2.1 LPAR1 基 因 的 克 隆 从 人 胃 癌 细 胞 BGC-
803 提取总 RNA，以反转录得到的产物为模板，基
因库查找编码人 LPAR1 的 mRNA 序列，用 primer
5 软 件 设 计 引 物， 序 列 如 下 ：上 游 引 物 P1 ：5-
CTCGAGATGGCTGCCATCTCTACTTC-3， 下 游 引 物
P2 ：5-GGATCCCTAAACCACAGAGTGGTCATTG-3
（ 上 海 生 工 生 物 有 限 公 司 合 成 ）， 其 中 下 划 线 为
Xho Ⅰ 和 BamH Ⅰ 酶 切 位 点 ；扩 增 长 度 1 107 bp。
PCR 反应体系 ：上游引物（10 μmol/L）1.5 μL，下
游引物（10 μmol/L）1.5 μL，双蒸水 31.5 μL，10×
GC Enhance 5 μL，dNTPs（各 2.5 mmol/L）4 μL，10×
TranStart Taq Buffer 5 μL，TranStart Taq DNA polym-
erase 0.5 μL， 模 板 1 μL。 反 应 条 件 ：94 ℃ 预 变 性
5 min；94℃变性 30 s，58℃退火 30 s，72℃延伸 60 s，
30 个循环 ；最后再于 72℃延伸 10 min。扩增产物进
行琼脂糖凝胶电泳，纯化回收 PCR 产物，回收产物
与 pCR2.1 载体连接，连接产物转化 DH5α 大肠杆菌
感受态细胞，蓝白斑筛选阳性（pCR2.1-LPAR1）克隆，
送测序。
1.2.2 构建表达载体 用 Xho Ⅰ、BamH Ⅰ双酶切
pCR2.1-LPAR1 与 pIRES2-EGFP 载体，酶切产物回
收后用 T4 DNA 连接酶在 16℃连接过夜，连接产
物转化 DH5α 大肠杆菌感受态细胞，挑取阳性克隆
PCR 鉴定，送测序。
1.2.3 瞬 时 转 染 293T 细 胞 293T 细 胞 培 养 在 含
10% 胎牛血清的 DMEM 培养基中，胰酶消化制成
单细胞悬液，以 2×105 个 / 孔接种于 6 孔板。提取
并纯化 pIRES2-EGFP-LPAR1 和 pIRES2-EGFP 质粒，
用 NanoDrop 核酸蛋白测定仪 nd1000 测定质粒浓度
和纯度，分别转染 293T 细胞。24 h 后观察荧光照相，
36 h 提取细胞总 RNA。
1.2.4 实时定量 PCR 检测目的基因的表达 收集未
转染及转染上述 2 种质粒的 293T 细胞，用总 RNA
提取试剂盒提取各组细胞的总 RNA，再用 DNA 酶Ⅰ
去除 RNA 中可能残余的基因组 DNA，NanoDrop 核
酸蛋白测定仪 nd1000 检测浓度。用反转录试剂盒反
转录成 cDNA。GoldStar TaqMan Mixture 康为世纪试
剂盒用来实时定量 PCR 检测目的基因在各组细胞中
的表达。所用引物如下 ：LPAR1 基因检测引物，上
游引物：5-CGTCAGGGCCTCATTGACA-3，下游引物：
5-GTGCCTCTCGATTGCAATAGC-3，LPAR1 基 因 探
针序列 ：5-CCTGACGGCATCTGTGGCCAACTTA-3 ；
以 GAPDH 基因为内参，上游引物 ：5-CCAGGTGG-
TCTCCTCTGACTTC-3，下游引物 5-GTGGTCGTTG-
AGGGCAATG-3，GAPDH 基 因 探 针 序 列 ：5-AC-
AGCGACACCCACTCCTCCACCTT-3 ；反应体系 ：2×
GoldStar TaqMan Mixture 25 μL， 上 下 游 引 物（10
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第8期172
A ：普通光镜下观察转染 pIRES2-EGFP 载体的 293T 细胞照片 ；B ：荧光下
观察转染 pIRES2-EGFP 载体的 293T 细胞照片 ；C ：普通光镜下观察转染
pIRES2-EGFP-LPAR1 载体的 293T 细胞照片 ；D ：荧光下观察转染 pIRES2-
EGFP-LPAR1 载体的 293T 细胞照片
图 4 转染 24 h 后观察图（100×）
M ：DNA 分子量标准 ；1 ：双酶切 pIRES2-EGFP ；
2 ：双酶切 pIRES2-EGFP-LPAR1
图 3 pIRES2-EGFP-LPAR1 酶切鉴定电泳结果
M ：DNA 分子量标准 ；1 ：LPAR1 基因 PCR 产物
图 1 LPAR1 的 PCR 琼脂糖电泳结果
μmol/L）各 1 μL，探针（Probe）1 μL，DNA 模板 2
μL，RNase-Free Water 20 μL，共 50 μL。反应条件 ：
95℃预变性 10 min ；95℃变性 15 s，60℃（LPAR1）
和 60℃（GAPDH）退火 1 min，循环 39 次 ；每个反
应有 3 次重复。
1.2.5 ELISA 检 测 LPA 刺 激 下 的 cAMP 含 量 用
ELISA 试剂盒所给 cAMP 标准品制作标准曲线，LPA
和 ISP 刺 激 转 染 空 载 体（pIRES2-EGFP） 和 插 入
LPAR1 基因载体（pIRES2-EGFP-LPAR1）的细胞 4
min 然后用 1 mol/L HCl 终止反应 ；裂解细胞收集胞
内 cAMP。用 ELISA 试剂盒在荧光激发波长 540 nm
和发射波长 590 nm 处检测 LPA 和 ISP 刺激下胞内
cAMP 的积累量。
1.2.6 统计学分析 采用 GraphPad Prism 5 统计学
软件 one-way ANOVA 进行数据处理分析。
2 结果
2.1 LPAR1编码区片段的克隆与序列测定
用引物 P1、P2 以 cDNA 为模板扩增得到与预期
片段大小相符的特异性片段（图 1）。回收的 PCR 产
物与 pCR2.1 载体连接成的重组质粒 pCR2.1-LPAR1
经酶切鉴定正确（图 2）。序列测定结果表明，扩增
出的 cDNA 片段长 1 107 bp，与已知的 NCBI 基因库
中人 LPAR1（NM_001401）序列完全一致。
4000
bp
M 1
3000
2000
1200
800
500
200
M ：DNA 分子量标准 ；1 ：pCR2.1 双酶切 ；2 ：pCR2.1-LPAR1 双酶切
图 2 pCR2.1-LPAR1 酶切鉴定电泳结果
4000
bp
1 2M
3000
2000
1200
800
500
200
2.2 表达载体pIRES2-EGFP-LPAR1的构建
获得的重组质粒 pCR2.1-LPAR1 和表达载体质
粒 pIRES2-EGFP 经 XhoⅠ+BamHⅠ双酶切（图 3），
再将 LPAR1（1 107 bp）片段与 pIRES2-EGFP 酶切
产物连接，得到的表达载体 pIRES2-EGFP-LPAR1，
经 XhoⅠ+BamHⅠ 双 酶 切 pIRES2-EGFP 及 pIRES2-
EGFP-LPAR1 鉴定与预期序列大小相符。
7000
bp
1 2M
5000
3000
2000
1000
500
2.3 转LPAR1基因293T细胞检测
pIRES2-EGFP-LPAR1 转染 293T 细胞 24 h 后观
察荧光（图 4），统计阳性细胞，转染率约为 61%。
200 μm 200 μm
200 μm 200 μm
A B
C D
2013年第8期 173李铁威等 ：人溶血磷脂酸受体 1 基因的克隆、表达载体构建及瞬时转染 293T 细胞
2.4 实时定量PCR检测LPAR1基因在293T细胞中
的表达
LPAR1 基因的表达检测，分别提取未转染细胞、
转 染 空 载 体（pIRES2-EGFP） 的 细 胞 和 转 染 插 入
LPAR1 片段载体的细胞中总 RNA 并去除其中的基因
组 DNA，反转录成 cDNA 后，以实时定量 PCR 法检
测 LPAR1 基因的表达，检测到 LPAR1 基因表达水平
显著提高，与未转染的细胞比较 mRNA 表达提高 71
倍（图 5）。
号通路抑制 cAMP 的产生［4，7，16］。为了详细研究人
溶血磷脂酸受体 LPAR1 的功能以及其介导的细胞
内信号转导通路，本试验克隆了人的 LPAR1 基因以
及构建真核表达载体质粒 pIRES2-EGFP-LPAR1，用
脂质体介导瞬时转染 293T 细胞，发现 293T 细胞具
有极低量的 LPAR1 基础表达。转染 pIRES2-EGFP-
LPAR1 后，293T 细胞的 LPAR1 mRNA 表达提高 71
倍（与未转染的细胞比较）。通过检测 LPA 刺激转
染 pIRES2-EGFP-LPAR1 的 细 胞 cAMP 的 含 量， 发
现 转 染 pIRES2-EGFP-LPAR1 的 细 胞 cAMP 的 含 量
低于转染空载体（pIRES2-EGFP）的细胞，证实了
该转基因细胞成功表达了活性的 LPAR1 蛋白，能
够满足于进一步的试验需要。又通过在 1 μmol/L ISP
（Isoproterenol）和浓度梯度的 LPA 共刺激 LPAR1 转
基因细胞发现 LPA 可以剂量依赖性的抑制 cAMP 的
形成，且存在着线性关系。
*** ：P<0.001
图 7 LPAR1 转基因细胞中不同浓度 LPA 刺激后 cAMP
含量检测
pIRES2-EGFP ：转染空载体的细胞 ；pIRES2-EGFP-LPAR1 ：转染 LPAR1
表达载体细胞
图 6 LPA 刺激转染 pIRES2-EGFP-LPAR1 后的 293T 细
胞中 cAMP 表达量检测
0.015
***
***
0.010
0.005
0.000
pIRES2-EGFPnone pIRES2-EGFP-LPAR1
m
R
N
A
ሩG
A
PD
H
สഐ
Ⲵ
ሩ㺘
䗮䟿
None ：未 转 染 细 胞 ；pIRES2-EGFP ：转 染 空 载 体 的 细 胞 ；pIRES2-EGFP-
LPAR1 ：转染 LPAR1 表达载体的细胞 ；*** ：P<0.001
图 5 pIRES2-EGFP-LPAR1 转染后的 293T 细胞中 LPAR1
基因相对表达量检测
2.5 ELISA检测转基因细胞的cAMP含量
cAMP 的 检 测 用 10 μmol/L LPA 分 别 刺 激 转 染
空载体（pIRES2-EGFP）的细胞和转染插入 LPAR1
基因片段载体后的细胞并用 1 mol/L HCl 终止反应，
裂 解 细 胞 收 集 细 胞 裂 解 液， 用 ELISA 试 剂 盒 检
测 cAMP 的含量，检测到转染 LPAR1 基因的细胞
cAMP 降低（与转染空载体的细胞比较）（图 6）。
ISP（Isoproterenol，异丙肾上腺素）能够刺激促进
cAMP 的产生，在 1 μmol/L ISP 的存在下混以不同浓
度的 LPA 刺激转染 LPAR1 基因的细胞，检测到胞内
cAMP 的积累量随着 LPA 浓度的升高而降低（图 7）。
3 讨论
LPA 是在血浆、血清、组织液及脑组织等体液
与组织中广泛存在的生理活性磷脂小分子［14］，在
体内有着广泛的生物学作用，如，细胞增殖、细胞
运动等 ；同时，LPA 通过 LPAR1 与结肠癌、乳腺
癌、胰腺癌、动脉粥样硬化、神经性疼痛等疾病密
切相关［13，15-19］。LPA 通过 LPAR1 偶联 Gi 蛋白的信
2.0
1.5
1.0
0.5
0.0
pIRES2-EGFP㜎
cA
M
P㺘
䗮䟿
Ⲵ⎃
ᓖ μ
m
ol
/L
pIRES2-EGFP-LPAR1
20
15
10
5
0
10 5 1 0.5 0.1 0
㜎
cA
M
P㺘
䗮䟿
Ⲵ⎃
ᓖ μ
m
ol
/L
***
***
***
***
***
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第8期174
本研究采用瞬时转染 LPAR1 基因，获得约为
61% 的转染细胞，此时细胞基因表达相比未转染的
细胞便高出 71 倍，说明本试验成功构建得到 LPAR1
基因的真核表达质粒 ；此外当细胞群中有 61% 的细
胞高表达 LPAR1 时细胞应答所造成的差异便具有很
高的显著性，而实际当所有细胞均高表达 LPAR1 时
所造成的差异应该比此更加明显。Gerrard 等［20］研
究发现，在激活血小板的过程中检测到多种分子形
态的 LPA 分子，酰基烃链的 C 原子数和脂肪酸的饱
和度不同使 LPA 具有不同的分子结构。随后研究发
现不同分子形态的 LPA 活化 LPAR1 受体的能力不
同且在一定程度上存在着拮抗效应，其共同作用发
挥其所介导的下游信号通路功能［21］，因此通过普通
的方法检测活化 LPAR1 受体的 LPA 浓度存在一定
的难度，需要进一步的深入研究。
4 结论
克隆 LPAR1 基因并构建 LPAR1 基因的真核表
达质粒 pIRES2-EGFP-LPAR1，瞬时转染 293T 细胞
获得 LPAR1 转基因细胞模型，LPAR1 基因得以高表
达。此外 LPAR1 被激活后能强烈抑制由 ISP 诱导的
cAMP 积累，其作用具有 LPA 剂量依赖性。
参 考 文 献
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（责任编辑 马鑫）