全 文 :·综述与专论· 2015, 31(2):35-44
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN
枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)是一种重要的
原核表达宿主,具有很高的应用价值,其培养简单
快速,具有较强的分泌蛋白质的能力、非致病性及
良好的发酵基础和生产技术,是目前生产各种工业
用酶,如淀粉酶、蛋白酶和脂肪酶等的理想表达宿
主,是微生物研究领域中的一种重要模式菌株。但
是目前,枯草芽孢杆菌表达系统仍然存在不完善的
地方,大部分外源蛋白在其体内的表达仍旧不高,
收稿日期 :2014-07-10
基金项目 :国家“863 计划”项目(2014AA021303)
作者简介 :余小霞,硕士研究生,研究方向 :微生物分子生物学与基因工程 ;E-mail :yuxiaoxia198921@sina.com
通讯作者 :伍宁丰,研究员,研究方向 :微生物分子生物学与基因工程 ;E-mail :wuningfeng@caas.cn
枯草芽孢杆菌表达系统及其启动子研究进展
余小霞 田健 刘晓青 伍宁丰
(中国农业科学院生物技术研究所,北京 100081)
摘 要 : 枯草芽孢杆菌作为一种革兰氏阳性细菌,由于其具有非致病性、分泌蛋白能力强的特性和良好的发酵基础及生产
技术,是目前原核表达系统中表达和分泌外源蛋白的理想宿主,成为原核表达系统中的一种重要的模式菌株。而实现外源蛋白的
高效表达的关键因素之一是使用强并可控制的启动子。目前,枯草芽孢杆菌中常用的启动子为组成型、诱导物诱导型、时期特异
性及自诱导型。详细介绍枯草芽孢杆菌表达系统以及其常用启动子的优缺点,并对克隆新的启动子的方法做了总结,旨为完善枯
草表达系统和工业生产外源蛋白奠定基础。
关键词 : 枯草芽孢杆菌 ;表达系统 ;组成型启动子 ;诱导型启动子
DOI :10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.02.005
Research Progress of Bacillus subtilis Expression System and Its
Promoter Regulatory Elements
Yu Xiaoxia Tian Jian Liu Xiaoqing Wu Ningfeng
(Institute of Biotechnology, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081)
Abstract : As a Gram-positive bacteria, Bacillus subtilis is an attractive host for the production of heterologous secretory proteins for
several reasons :it is non-pathogenic and the capable of secreting functional extracellular proteins directly to the culture medium, a great deal
of vital information concerning large scale fermentation and production technology. One of the key factors for achieving high-level expression
of heterologous proteins is the use of a strong and control promoter. In present, the promoters of Bacillus subtilis can be classified into three
categories :constitutive promoters, inducer-specific promoters and autoinducible promoters. This paper described the advantages and
disadvantages of Bacillus subtilis expression system and the classification of promoters. At the same time, we summarized the methods of the
amplification of new promoters, which provided a foundation for improving Bacillus subtilis expression systems and the industrial production of
heterologous proteins .
Key words : Bacillus subtilis ;expression system ;constitutive promoters ;inducible promoters
这主要是因为 :(1)枯草芽孢杆菌在其对数生长末
期表达和分泌大量的蛋白酶,影响外源蛋白的稳定
性和产量 ;(2)质粒的分化和结构不稳定性,有时
外源蛋白的组成型表达会影响质粒的稳定性 ;(3)
毒性蛋白在其体内不易表达 ;(4)有些外源蛋白的
表达分泌到培养基中会影响宿主菌的生长 ;(5)分
子遗传操作与大肠杆菌相比较困难。这些因素限制
了枯草杆菌表达系统的发展。枯草芽孢杆菌 168 菌
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.236
株的基因组全序列测序工作已于 1997 年完成[1],但
到目前为止,其基因组中尚有近 50%[2]的基因的功
能仍未阐明。因此目前针对枯草芽孢杆菌中基因及
相关元件功能,以及其对内部及外界环境响应的研
究仍是针对该菌基础研究的重点。
外源蛋白在枯草芽孢杆菌中的高效表达是实现
其在工业应用上的重要途径,而使用强并可控制的
启动子是外源蛋白高效表达的关键因素之一,决定
着工业生产酶的大规模生产。
本文简单介绍了枯草芽孢杆菌表达系统的特点
和表达目的蛋白时使用的载体系统,重点介绍枯了
枯草芽孢杆菌表达系统中的重要组成部分——启动
子,并对启动子的分类和克隆进行了详细的叙述,
最后总结了枯草芽孢杆菌表达系统的现状及展望。
1 枯草芽孢杆菌表达系统的概述
早在 100 多年前,人们就开始对枯草芽孢杆菌
进行研究,但早期的工作主要针对其分离鉴定、形
态观察及功能鉴定等进行研究。1958 年,Spizizen[3]
发现枯草芽孢杆菌可以在自然条件下形成感受态,
摄入外源 DNA,从而建立了枯草芽孢杆菌化学感受
态制备方法。此后,随着 DNA 重组技术的发明,枯
草芽孢杆菌表达系统成为研究热点。
枯草芽孢杆菌是一种存在着发育过程的原核生
物,该菌在细胞的培养过程中具有典型的生长规律,
如生长延滞期、对数期、稳定期、衰亡期及芽孢发
育期。芽孢杆菌通常是采用更换不同的 σ 因子的方
式来实现细胞中不同基因的特异性表达。枯草芽孢
杆菌中的 σ 因子有多种[4],其中 σA、σB、σC、σD、
σH、σI、σX、σW 与枯草芽孢杆菌营养生长相关,且
枯草芽孢杆菌中的 σA 相当于大肠杆菌 σ70,是营养
生长最主要的 σ 因子,占 σ 因子总量的 90%-95%,
负责转录持家基因和孢子形成早期基因 ;而 σE、σF、
σG、σK 与孢子形成有关。枯草芽孢杆菌表达系统的
另一特点是其分泌系统,由于枯草芽孢杆菌是革兰
氏阳性细菌,仅有一层细胞膜。因此,蛋白质的分
泌无需转位至周质空间(革兰氏阴性细菌,如大肠
杆菌需经过此步骤)而直接通过细胞质转移到胞外。
通过生物信息学的预测,枯草芽孢杆菌中共有 294
种蛋白质被预测为分泌型蛋白质[5]。根据分泌型蛋
白有无典型的信号肽,可以将其分泌系统分为依赖
信号肽的分泌途径和不依赖信号肽的分泌途径。由
于对不依赖信号肽的分泌途径的研究很少,且与依
赖信号肽的分泌途径不同,因此又将其称为非典型
分泌途径[6]。
枯草芽孢杆菌中至少存在 4 种依赖信号肽的分
泌途径[7]:Sec 分泌途径(Sec-SRP cooperation path-
way)、Tat 分泌途径(Twin-arginine translocation path-
way)、ABC 转运子途径(ATP-binding cassette trans-
porters)、假菌丝蛋白输出途径(Pseudopilin export
pathway)。Sec 分泌途径是枯草芽孢杆菌中的主要分
泌途径,经此系统分泌的蛋白质含有 Sec 型信号肽[8];
Tat 分泌途径一般只分泌已形成正确构象的胞内蛋白
质,经此系统分泌的蛋白质含有 Tat 型信号肽[8];
ABC 转运子途径主要用于细菌素等小分子的运输[9];
假菌丝蛋白输出途径与枯草芽孢杆菌细胞感受态的
形成有关[10]。虽然枯草芽孢杆菌有强的胞外蛋白
分泌能力,但较遗憾的是外源蛋白在其体内的表达
量不高,主要原因有以下两种 :(1)枯草芽孢杆菌
表达系统不成熟 ;(2)枯草芽孢杆菌野生型菌株本
身会产生大量的胞外蛋白酶,容易造成目的蛋白的
降解。
枯草芽孢杆菌应用的最为广泛的宿主菌是枯草
168 菌株,目前已经知道该菌株可产生 8 种胞外蛋
白酶(其中不包括一些未发现的蛋白酶),利用基因
突变的方法失活枯草 168 菌株基因组上中性蛋白酶、
碱性蛋白酶、金属蛋白酶、胞内蛋白酶、芽孢杆菌
肽酶 F 以及中性蛋白酶 B 六种蛋白酶基因后,将该
菌株命名为 WB600,其蛋白酶活性仍保留野生型菌
株的 0.32%[11]。WB700 是在 WB600 的基础上将丝
蛋白酶基因 vpr 在内的 7 个蛋白酶基因全失活的突
变株,其蛋白酶活力是野生菌株的 0.1%。随后,来
自加拿大卡加利大学的 Wong 等[12]在 WB700 的基
础上,继续将枯草杆菌的胞壁蛋白酶基因 cwp 失活,
发展了在野生菌株的基础上缺失了 8 个蛋白酶基因
的胞外蛋白酶活性更低的 WB800 菌株。因此,现在
用于外源表达目的蛋白常用的枯草杆菌菌株大部分
使用的是枯草 168 系列的突变株。
2015,31(2) 37余小霞等:枯草芽孢杆菌表达系统及其启动子研究进展
2 枯草芽孢杆菌表达载体系统
克隆载体和表达载体是基因重组技术的重要工
具,在分子遗传操作的所有领域中处于十分重要的
地位。根据类型的不同可将其分为 3 类[13]:独立自
主复制的质粒载体、整合型载体及噬菌体载体。下
面主要介绍在枯草芽孢杆菌中常用的独立自主复制
质粒载体和整合型载体。
2.1 独立自主复制的质粒载体
枯草芽孢杆菌 168 系列菌株目前已全部完成测
序,成为研究枯草芽孢杆菌的标准菌株,大部分的
枯草芽孢杆菌不含有内源性质粒,如今常用的质粒
大部分来自于葡萄球菌和链球菌[14,15]。这些质粒载
体可在枯草芽孢杆菌中自主复制,根据其复制方式
可分为滚环复制型载体(Rolling circle-type replication
vectors)和 θ 复制型载体,大部分来自于革兰氏阳
性细菌的小的质粒载体(<12 kb)是通过滚环复制
机制复制的,而一些大的质粒载体是通过 θ 复制机
制复制的。如最开始鉴定的来自于金黄色葡萄球菌
的 4 个 质 粒 pUB110,pC194,pE194 和 pT181 都 是
通过滚环机制复制的。pUB110 带有卡那霉素的抗性
基因,拷贝数较低,每个细胞中有 30-50 个拷贝[16];
pC194 带有氯霉素的抗性基因,拷贝数约为 15[17];
pE194 较特殊,是个温度敏感性的质粒载体,32℃正
常复制,随着温度增加,拷贝数降低,45℃时停止
复制,这为人们纯化含有此类质粒的细胞提供了一
个思路。另一方面,pE194 可以在细菌基因组上多个
位点发生特异性整合,整合子可以通过抗性(红霉素)
和培养温度(50℃)进行筛选[18,19]。pT181 带有四
环素的抗性基因,每个细胞中约有 20 个拷贝[18]。
这些质粒一般可以在枯草芽孢杆菌中自主复
制,表达其抗性基因,但在传代培养中仍存在许多
问题,其中最大的问题是质粒的分离不稳定性和结
构不稳定性[20]。质粒分离不稳定性表现在细胞在
无筛选压力条件质粒易丢失 ;结构不稳定包括质粒
DNA 的重排、筛减和增加。质粒载体的不稳定性严
重影响了其在枯草芽孢杆菌的研究应用,如许多基
因不能直接构建在枯草芽孢杆菌质粒载体,转入宿
主菌进行表达。然而,大肠杆菌分子遗传操作成熟,
不会产生质粒不稳定性现象,所以构建大肠杆菌 -
枯草芽孢杆菌的穿梭质粒载体是十分必要的,这样
就可以将外源基因在大肠杆菌中构建完成后再转化
到枯草芽孢杆菌中表达。目前常用的穿梭质粒载体
有 pEB10[21]、pEB20[22]、pEB60[22]、pUB18[23]、
pUB19[24]和 pWB980[24]等,详细信息,见表 1。
表 1 常用的大肠杆菌 - 枯草芽孢杆菌穿梭质粒载体
质粒 复制起点 大小 /kb 抗性标记 载体类型 参考文献
pEB10 oripUB110 oripBR322 8900 Amp,Kana 克隆载体 [21]
pEB20 orip194ripBR322 5771 Cm,Amp 克隆载体 [22]
pEB60 oripUB110 oripBR322 7430 Kana,Amp 克隆载体 [22]
pUB18 oripUB110 oripUC18 3600 Kana,Amp 克隆载体 [23]
pUB19 oripUB110 oripUC18 3300 Kana,Amp 克隆载体 [24]
pWB980 oripUB110 ori pUC18 3772 Kana,Amp 分泌载体 [24]
2.2 整合型质粒载体
芽孢杆菌中高效表达外源蛋白的最大障碍是构
建的重组表达质粒在宿主菌中通常不稳定,解决这
一问题的有效途径是使用整合型载体。枯草整合型
质粒载体一般含有大肠杆菌质粒的复制起点(通常
为 pBR322 或其衍生质粒)、抗性筛选标记基因(常
用于枯草的标记基因有卡那霉素、氯霉素、红霉素等)
及一段或两段整合基因(即与宿主细胞染色体序列
同源的基因)。它的特点是限制性复制,即整合型质
粒只在大肠杆菌中有复制功能,转入革兰氏阳性细
菌如枯草芽孢杆菌中则无此功能,因此只有整合进
宿主基因组中才能正常的表达目的基因。整合型质
粒载体根据其整合方式不同可分为单交换整合和双
交换整合。
2.2.1 单交换整合 通过一段位于外源基因某侧的
同源序列(与枯草芽孢杆菌基因组同源的序列),与
枯草芽孢杆菌基因组的目标序列发生同源重组,从
而将外源基因整合到染色体上,单交换需要的同
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.238
源臂较短,整合效率高且稳定,不易发生逆整合
(图 1)。
体还可通过 thrC 位点进行整合,插入的外源基因破
坏 thrC 基因,从而导致苏氨酸营养缺陷型[29],以
此来筛选重组子(图 2)。常见的整合型载体,见
表 2。
表 2 常见的芽孢杆菌整合型载体
载体 整合位点 抗性标记 整合类型 参考文献
pMutin4 cloned locus Em single crossover [30]
pMutin-GFP+ cloned locus Em single crossover [31]
pSG1151 cloned locus Cm single crossover [32]
pSG1156 cloned locus Cm single crossover [33]
pDG1661 B.sub amyE Cm double crossover [29]
pDG1662 B.sub amyE Cm double crossover [29]
pDL B.sub amyE Cm double crossover [34]
pDK B.sub amyE Kana double crossover [34]
pDG1663 B.sub thrC Em double crossover [29]
pDG1664 B.sub thrC Em double crossover [29]
3 枯草表达系统的启动子
启动子是位于结构基因 5 端上游的 DNA 序列,
能活化 RNA 聚合酶,使之与模板 DNA 准确的结合
并具有转录起始的特异性。启动子是实现外源基因
高效表达的关键。
3.1 启动子的分类
依照控制转录水平的高低,启动子可以分为强
启动子和弱启动子 ;从启动子诱导机制上分类,启
动子可以分为组成型启动子、诱导型启动子、时期
特异性启动子及自诱导启动子,下面着重介绍枯草
芽孢杆菌中已发表的组成型启动子和诱导型启动
子[2],并对时期特异性启动子和自诱导启动子做简
单的介绍。
3.1.1 组成型启动子 组成型启动子就是不需要任
何诱导物,可以持续性表达目的蛋白的启动子。这
类启动子启动强度通常要求较强,且成本低,一些
组成型启动子常通过构建胞内或分泌表达载体表达
目的蛋白。常用的枯草杆菌组成型启动子有 P43 启
动子和噬菌体启动子,其中 P43 启动子是枯草杆芽
孢菌胞苷脱氨酶(cdd)基因的启动子,广泛用于研
究,该启动子属于重叠启动子,分别由 σA 和 σB 识别,
前者负责转录持家基因和孢子形成早期基因,后者
一般负责与胁迫相关的基因[35]。研究发现 P43 启动
子为强启动子,启动强度强于诱导型启动子 PsacB 和
ori
bla abr
orfA˃
orfA˃ abr bla ori orfAorfA অӔᦒ
ᮤਸර䍘㋂
ᮤਸ ⴞⲴสഐ
图 1 单交换整合型载体
5˃ 3˃blaori
orfA
targe 5˃ targe 3˃orfA abr
abr ৼӔᦒᮤਸර䍘㋂ᮤਸ ⴞⲴสഐ
图 2 双交换整合型载体
2.2.2 双交换整合 通过位于外源基因两侧的同源
序列,与枯草芽孢杆菌基因组的目标序列发生同源
重组。为了提高双交换的整合效率,其需要的同源
臂长度至少要 400-500 bp [25],才能发生有效的重
组 ;其次还需要考虑发生重组的线性双链 DNA 的稳
定性。因为线性双链 DNA 导入枯草芽孢杆菌体内容
易被 AddAB 解旋酶降解,但若在线性双链 DNA 末
端加上 Chi 位点(χBs,5-AGCGG-3)可以解决此问
题[26, 27],因此在构建重组质粒载体时可以在克隆
同源臂时引入 Chi 位点以提高重组效率。目前常用
的双交换整合型载体是通过 amyE 基因位点进行整
合[28],插入的外源基因破坏了 amyE 基因,宿主菌
不能表达淀粉酶,从而可以通过功能平板和酶活测
定来鉴定阳性重组子。另外,一些其他的整合型载
2015,31(2) 39余小霞等:枯草芽孢杆菌表达系统及其启动子研究进展
PamyE,普遍作为表达载体的调控元件
[36]。Yang 等[37]
通过启动子诱捕系统(Promoter trap system)从地衣
芽孢杆菌基因组中筛选到一个强启动子 Pshuttle-09,其
强度是 P43 的 8 倍,在分析 Pshuttle-09 序列的基础上,
Yang 等又构建了一个人工双启动子 Plaps,此启动子
的强度是 P43 的 13 倍,是目前应用在枯草芽孢杆菌
中表达的最强的组成型启动子。不过组成型启动子
也存在一些问题,如组成型表达载体不稳定,表达
量不易控制,不适合表达对宿主菌有害的或有毒性
蛋白,另外重复使用同一种启动子表达多个外源基
因可能会引起基因沉默或共抑制现象等。
3.1.2 诱导型启动子 与组成型启动子相比,诱导
型启动子可根据需要在特定的诱导条件,快速诱导
基因转录的“开”与“关”。诱导型启动子可以分为
两类 :一类与环境应答有关,如渗透压、pH 值、氧
气匮乏、低温、热休克等,在这些环境下,启动子
启动相应基因转录,以适应环境变化 ;另一类是化
学诱导启动子,即受化学诱导物诱导而提高相应基
因的表达量。下面主要介绍枯草芽孢杆菌中常用的
几个化学物诱导启动子。
枯草芽孢杆菌中最常见的是受 IPTG 诱导的启
动子,IPTG 能够与大肠杆菌的转录阻遏蛋白 LacI 结
合,使得 LacI 从操纵位点上脱离,从而诱导下游基
因的表达。最早应用的是启动子 Pspac,由枯草芽孢
杆菌噬菌体 SPO1 和大肠杆菌 lac 操纵子融合而成[38]。
随后 Phan 等[39]将热激蛋白 GroES 和 GroEL 编码序
列的强启动子与 lac 操纵子融合,构成受 IPTG 诱导
的启动子 Pgrac。Phan 等
[40]进一步通过优化启动子
Pgrac 的调控元件,构建另一个更强的启动子 Pgrac100。
虽然受 IPTG 诱导的启动子强并且可控,但它存在以
下 3 个缺点 :(1)IPTG 价格昂贵,且有毒性,不适
宜进行大规模的外源蛋白的发酵生产 ;(2)Pspac 启
动强度仍然不够,外源蛋白的表达量不是很高 ;(3)
Pspac 不属于严紧的可控启动子,从而导致在未加入
诱导物 IPTG 的情况下,仍然有少量的重组蛋白表达。
因而这些由 IPTG 诱导的启动子不适用于工业上大规
模蛋白酶的生产。
枯草芽孢杆菌中第 2 个启动子系统是以木糖为
诱导物的启动子 Pxyl。Pxyl 由 xylR 编码的阻遏蛋白严
格控制表达,通过添加 0.1%-2% 的木糖,能够诱导
该启动子的表达,木糖启动子系统对代谢中的大部
分代谢产物不敏感,不过却受到葡萄糖的抑制[41]。
枯草芽孢杆菌中第 3 个启动子系统是以蔗糖为
诱导物的 sacB 启动子,sacB 基因是枯草芽孢杆菌基
因组上受蔗糖诱导调控的基因,编码外分泌的蔗糖
果聚糖酶(Levansucrase)。其启动子 sacR 转录起始
是持续性的,不受蔗糖诱导的控制,但在无蔗糖的
情况下,其表达强度比有蔗糖诱导时低 100 倍[42]。
这 3 个启动子诱导系统在枯草芽孢杆菌中应用
广泛,尤其是前两个系统,常被用做外源蛋白高效
表达的元件,但它们共同存在一个缺点就是所用的
诱导物 IPTG 和木糖价钱昂贵,在工业生产中易增加
成本,因此限制了在工业生产中的应用。而蔗糖诱
导启动子的启动强度相对较弱,无法在工业生产中
高效表达目标蛋白。
除了上述介绍的 3 种诱导启动子外,枯草芽孢
杆菌中还有受淀粉诱导的持续性表达的淀粉酶基因
启动子 Pamy
[36],以及受磷酸[43]、柠檬酸盐[44]、四
环素[45]、枯草菌素[46]、细胞壁抗生素[47]和甘氨酸[48]
等诱导的启动子。此外,为了降低诱导物的成本以
更利于工业化应用,Heravi 等[49]开发了以甘露醇为
诱导物的表达系统。Yang 等[14,50]利用麦芽糖为诱
导物的启动子 Pglv 构建了表达系统。Reza 等
[51]通
过施加环境压力和葡萄糖匮乏构建了 PohrB 表达系统。
3.1.3 时期特异性启动子 转录组学分析显示基因
表达是有时期依赖性的[52]。一些基因特异性的在对
数生长期表达,而另外一些基因却在菌体进入稳定
期后才被激活表达。应用这些时期特异性表达基因
的调控元件来表达外源基因,可以避免添加外源的
诱导物。目前有两个此类启动子被用于外源基因的
表达。一个是启动子 PrpsF,特异性在对数期表达,
利用此启动子已成功地将来源于 C. perfringens 的 β-
类毒素的基因进行了高效表达[53]。另一个使用的启
动子是在对数末期表达的 PaprE。PaprE 是 σA 依赖型的
启动子,且它的活性被高度控制。使用 lacZ 作为报
告基因,将其与启动子共同构建在枯草杆菌整合型
载体上,整合进枯草杆菌基因组进行外源蛋白的表
达,结果发现 β-半乳糖苷酶的表达量约占总蛋白量
的 10%[54]。
3.1.4 自诱导启动子 自诱导启动子在工业生产中
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.240
具有优势。Lee 等[55]运用苏云金芽胞杆菌伴孢晶体
蛋白基因 cry3Aa 的启动子 Pcry3Aa 构建了枯草芽孢杆
菌稳定期自诱导表达系统,并且通过对此启动子进
行优化,优化后外源蛋白 lacZ 的表达量较优化前提
高了 5 倍。优化后的 Pcry3Aa 启动子可能会成为枯草
芽孢杆菌表达系统的一个强的备选启动子。另外,
Wenzel 等[56]利用启动子 PmanP 构建了适合高细胞密
度发酵的自诱导系统。这种新型的枯草芽孢杆菌自
诱导系统在工业生产上将不仅可以提高外源蛋白的
产量,还可以降低生产成本。
综上所述,枯草芽孢杆菌表达系统常用的启动
子,见表 3。
表 3 枯草芽孢杆菌表达系统常用的启动子
启动子名称 启动子类型 性质 参考文献
P43 组成型 是枯草杆菌 cdd 基因的启动子,属于重叠启动子,分别由 σ
A 和 σB 识别,能够持续性高效表达
其调控的基因产物
[35,36]
Pshuttle-09 组成型 来源于地衣芽孢杆菌,启动强度是 P43 的 8 倍 [37]
Plaps 组成型 人工构建的双启动子,启动强度是 P43 的 13 倍 [37]
Pspac 诱导型 IPTG 诱导,带有来自大肠杆菌 lac 由枯草芽孢杆菌噬菌体 SPO1 和大 肠杆菌 lac 操纵子 [38-40]
Pgrac 融合而成
Pgrac100 [41]
Pxyl 诱导型 通过添加 0.1%-2% 的木糖,能够诱导该启动子的表达,且受葡萄糖抑制 [42]
PsacB 诱导型 受蔗糖诱导
Pamy 诱导型 受淀粉诱导 [36]
Plial 诱导型 受细胞壁抗生素诱导 [47]
PmtlA 诱导型 受甘露醇诱导 [49]
Pglv 诱导型 受麦芽糖诱导 [14,50]
PohrB 诱导型 受环境压力和葡萄糖匮乏诱导 [51]
PrpsF 时期特异性型 特异性在对数期表达 [53]
PaprE 时期特异性型 特异性在对数末期表达 [54]
Pcry3Aa 自诱导型 稳定期自诱导表达 [55]
PmanP 自诱导型 适合于高密度发酵使用 [56]
3.2 启动子克隆的方法
启动子的研究一方面是为了得到有利于实际应
用的高强度启动子 ;另一方面也有助于进一步了解
基因组和遗传特性。目前克隆启动子的方法多种多
样,大致可分为两种 :一是用启动子诱捕系统(即
用到启动子探针质粒载体)筛选启动子 ;另一种根
据基因组信息结合计算机软件预测直接用 PCR 扩增
已知的基因启动子,然后再进行后期生物实验验证,
这种方法精确性较差。因此,对于筛选到的启动子
还需要进行进一步的优化。
3.2.1 利用启动子诱捕系统筛选启动子 利用启动
子诱捕系统筛选启动子是一种简单有效且更加准确
的方法[37,57]。启动子诱捕系统中最为核心的部分是
构建启动子探针质粒载体,这种载体通常由不含启
动子成分的报告基因和一个筛选标记基因组成,只
有当内源基因编码区插入到载体上,序列中产生融
合转录本时报告基因才可能表达。在探针载体构建
时,报告基因的选择至关重要。作为报告基因,它
的全序列必须是已知的、已克隆研究过,另外报告
基因的表达产物在宿主菌中不存在背景干扰,并且
其表达产物的检测应简单、快捷、灵敏度高、重复
性好。目前常用的报告基因有以下几种 :(1)β- 半
乳糖苷酶基因 :细菌 β- 半乳糖苷酶基因,尤其是来
自于嗜热芽孢杆菌的耐热性的 β- 半乳糖苷酶基因被
广泛应用,它能水解底物 X-gal,利用蓝白斑筛选可
鉴定插入启动子的阳性克隆。Yang 等[37]利用来自
于嗜热芽孢杆菌的 bgaB 基因为报告基因构建启动子
捕获载体 pShuttleF,从地衣芽孢杆菌的基因组中筛
选出比 P43 表达强度强 8 倍的 PShuttle-09 启动子 ;(2)
氯霉素转乙酰酶报告基因(CAT) :细菌 CAT 酶可以
2015,31(2) 41余小霞等:枯草芽孢杆菌表达系统及其启动子研究进展
将乙酰基从乙酰辅酶 A 转移到氯霉素的 3- 羟基位上,
而使宿主菌失去抗性,再通过检测放射性标记的底
物实现量化。以 CAT 为报告基因检测简单,重现性
好且灵敏度高。Harwood 等[58]以氯霉素抗性基因为
报告基因构建启动子捕获载体,在枯草芽孢杆菌中
克隆了一些启动子片段。(3)绿色荧光蛋白报告基
因(gfp) :绿色荧光蛋白基因最初是从维多利亚发
光水母(Aequorea victoria)中分离得到,在 508 nm
处自行发射绿色荧光,无需辅助因子和底物。GFP
相对分子质量小、对活细胞无毒害、荧光稳定且检
测方法简单直观(通过荧光显微镜或流式细胞仪检
测),加热、变性剂及一般的蛋白酶均不能使 GFP
失活。GFP 上述的优点使其成为报告基因的后起之
秀。目前已经有多种 GFP 突变体,如蓝色荧光蛋白
(CFP)、黄色荧光蛋白(YFP)及加强型的荧光蛋白
(EGFP)等。Gat 等[57]以 gfp 和 egfp 基因为报告基
因,通过启动子诱捕载体从炭疽芽孢杆菌(Bacillus
anthracis)中筛选出用于重组蛋白 rPA 表达的启动子。
此外,还有 β-葡萄糖苷酸酶(β-glucuronidase)基因、
酸性磷酸脂酶基因及荧光素酶基因等,在启动子筛
选中也应用广泛。
3.2.2 结合生物信息学和 PCR 技术克隆启动子 应
用启动子诱捕载体克隆启动子无需知道基因的具体
序列,可随机筛选启动子,这样不用设计引物,可
得到大量的启动子片段。但这种方法需要构建启动
子文库,筛选工作量大。随着生物信息学和 PCR 技
术的发展,利用计算机软件预测加上 PCR 扩增和后
期的实验验证,从基因组中分离已知序列的启动子
逐渐成为热门。
Wang 等[59]在苏云金芽胞杆菌的 RNA 测序结
果的基础上,运用生物信息学预测未知基因的转录
起始位点,并将转录起始位点上游 500 bp 的核苷酸
进行分析,寻找与之匹配的 σ 因子和转录因子的识
别位点,从而判断是否存在潜在的可开发的启动子。
使用 PCR 技术将选定的启动子克隆并构建到表达载
体上,后期进一步通过实验验证这些选定的启动子
强度。在此基础上,他们筛选出 20 个不同时期表达
的启动子,为苏云金芽胞杆菌的分子生物学的基础
研究及应用研究奠定了基石。
除了上述的普通 PCR 扩增启动子外,还有常用
反向 PCR、衔接头 PCR 及 TAIL-PCR 等方法扩增启
动子序列。
4 展望
目前,已有许多的原核基因和真核基因在枯
草芽孢杆菌中表达。已克隆的原核基因很多,如属
于分子遗传学范畴的一些与质粒构建有关的抗性基
因 ;与 DNA 结构有关的 DNA 重组、诱变、修复等
相关基因 ;与基因表达及其调控有关的 Sigma 因子、
Trna、正负调控基因等 ;与芽孢形成萌发的 spoOA、
spoIIG 基因等 ;以及与苏云金芽胞杆菌伴胞晶体蛋
白相关的 cry、cyt 基因等 ;甚至有些与感受态、蛋
白分泌有关的 Com、SecDF 基因等。此外,还有一
些工业生产用酶也成功在枯草芽孢杆菌中表达,如
碱性蛋白酶、中性蛋白酶 A 和 B、α-淀粉酶、β-淀粉
酶、支链淀粉酶、木聚糖酶、脂肪酶、β-半乳糖苷
酶和真枯草多肽酶 F 等。
真核基因在原核生物中表达总是不理想,其主
要原因一是原核生物中缺乏蛋白翻译后修饰如糖基
化等问题 ;二是枯草杆菌的胞外蛋白酶易降解真核
基因产物。因此,其缺失蛋白酶基因的枯草芽孢杆
菌成为高表达外源蛋白的理想菌株。
基因表达体系是一个复杂的过程,与大肠杆菌
表达系统比较,枯草表达系统还不是很成熟。近年来,
科研工作者在枯草芽孢杆菌分泌表达外源蛋白方面
取得很大的进展,已建立一个有效的外源蛋白枯草
表达系统。相比于传统的大肠杆菌系统,枯草表达
系统要远远落后于它,但在蛋白表达纯化和分泌活
性蛋白方面则要明显优于大肠杆菌。实践证明,枯
草表达系统可以表达多种可溶性的并具有生物活性
的蛋白质。在进一步发展和完善枯草表达系统过程
中,势必要不断完善和扩大枯草芽孢杆菌载体系统
和宿主系统,而在载体系统的改造过程中,启动子
调控元件起着重中之重的作用。因此,从启动子出发,
筛选新的强启动子元件,构建成熟高效的枯草表达
系统,无论是在理论研究还是实际生产中都有十分
重要的意义。
参 考 文 献
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(责任编辑 狄艳红)