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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2015, 31(8):94-101
收稿日期 ： 2014-12-15
基金项目 ：国家重点基础研究发展计划（“973”计划）（2015CB150604），国家自然科学基金项目（31270880）
作者简介 ：艾秋实，男，硕士研究生，研究方向 ：植物抗逆机理研究 ；E-mail ：yingyangtt@163.com
通讯作者 ：宋水山，男，博士，研究员，研究方向 ：细胞信号传导 ；E-mail ：shuishans@hotmail.com
拟南芥 GCR2 参与感应 N-丁酰基高丝氨酸内酯过程的
初步研究
艾秋实1，2  张哲2  屈凌波3  刘方2  赵芊2  宋水山2
（1. 河北农业大学生命科学学院，保定 071001 ；2. 河北省科学院生物研究所 河北省主要农作物病害微生物控制工程技术研究中心，石家庄
050081 ；3. 河南工业大学化学化工学院，郑州 450001）
摘 要 ： N-丁酰基高丝氨酸内酯（C4-HSL）是革兰氏阴性菌主要的群体感应信号，其能促进植物生长发育，激活细胞膜
表面的 Ca2+ 通道，从而参与调控植物的生理代谢。然而，植物感应 C4-HSL 的分子机制并不清楚。拟南芥 GCR2 作为 ABA 的受
体，对植物的生理代谢十分重要。旨在探寻 GCR2 是否参与拟南芥感应 C4-HSL 的过程。qRT-PCR 结果表明，C4-HSL 处理后 1 h，
GCR2 基因表达量出现明显上调并在 6 h 后达到最大值，说明 C4-HSL 可调节 GCR2。ELISA 结果显示，GCR2 蛋白表达量也在 6 h
达到最大值。对体外表达的 GCR2 进行纯化和浓缩，使其达到 0.6 mg/mL 后进行微量热泳动（MST）检测。MST 测得 C4-HSL 与
GCR2 的解离常数（Kd）为 166 nmol/L，显示出较强的结合能力。用 BSA 作为阴性对照，表明 C4-HSL 与 GCR2 的结合具有一定的
特异性。这些结果表明 GCR2 可能参与了拟南芥感应 C4-HSL 的过程。
关键词 ： 群体感应 ；N-酰基高丝氨酸内酯 ；拟南芥 ；微量热泳动
DOI ：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.08.014
Preliminarily Research on Involvement of Arabidopsis GCR2
Responsing to N-Butyryl-DL-homoserine Lactone
Ai Qiushi1，2 Zhang Zhe2 Qu Lingbo3 Liu Fang2 Zhao Qian2 Song Shuishan2
（1. College of Life Sciences，Agricultural University of Hebei，Baoding 071001 ；2. Biology Institute，Hebei Academy of Sciences，Hebei
Engineering and Technology Center of Microbiological Control on Main Crop Disease，Shijiazhuang 050081 ；3. School of Chemistry and
Chemical Engineering，Henan University of Technology，Zhengzhou 450001）
Abstract: N-Butyryl-DL-homoserine lactone（C4-HSL）is a main quorum sensing signal in gram-negative bacteria. It could significantly
promote root elongation and activate Ca2+ channel at cytomembrane. C4-HSL can regulate metabolization of plant. However, little is known about
the molecular mechanism of plants responding to C4-HSL. Arabidopsis thaliana GCR2 is receptor of abscisic acid（ABA）. It is important for
metabolization of plant. This research aimed to explore whether the GCR2 is involved in the process of Arabidopsis thaliana reacting to C4-HSL.
qRT-PCR showed that C4-HSL could regulate expression of GCR2. Expression of GCR2 was significantly upregulated after 1 h treated by C4-
HSL and maximaized at 6 h. ELISA also showed that expression of GCR2 maximaized at 6 h. GCR2 was purified and condensed to 0.6 mg/mL
for Microscale Thermophoresis（MST）measurement. MST indicated that dissociation constant（Kd）of GCR2 and C4-HSL was 166 nmol/L,
which meant that they had strong binding affinity. Taking BSA as negative control, this certified that binding of GCR2 and C4-HSL had special
character. These results showed that Arabidopsis GCR2 maybe involved in the pathway of plant responding to C4-HSL.
Key words: quorum sensing ；N-acyl-homoserine lactones ；Arabidopsis thaliana ；microscale thermophoresis
2015,31(8) 95艾秋实等：拟南芥 GCR2参与感应 N-丁酰基高丝氨酸内酯过程的初步研究
群体感应（quorum sensing，QS）信号是细菌自
身诱导物，它广泛存在于革兰氏阳性菌和阴性菌中。
群体感应信号通过调节特定基因表达进而调控细菌
群体行为，这种调控需依赖菌体数量［1］。N-酰基高
丝氨酸内酯（N-acyl-homoserine lactones，AHLs）是
革兰氏阴性菌分泌的一类自身诱导物，其具有一个
保守的高丝氨酸内酯环和一个长度在 4-18 个碳原子
的酰基侧链。侧链含 4-8 个碳原子的 AHLs 为短链
AHLs ；含 10-18 个碳原子的为长链 AHLs。酰基侧
链的长度、饱和度及 C3 位的取代基决定着 AHLs 在
菌群通讯中的特异性［2-6］。例如，铜绿色假单胞菌
（Pseudomonas aeruginosa）中存在两套完整的 QS 系
统，它可产生 N-丁酰基高丝氨酸内酯（C4-HSL）和
N-3-羰基十二酰基高丝氨酸内酯（3OC12-HSL）［7］。
AHLs 有两种构型，L 型 AHLs 具有较强的生物学活
性，D 型 AHLs 活性较低［8］。对大麦和西印度地薯
的研究发现 L 型 AHLs 被较多的利用［9］。
AHLs 能被真核生物识别，从而影响真核细胞
的基因表达、信号转导等［10］。植物可感知根际菌分
泌到土壤中的 AHLs 已经得到广泛研究。共生细菌
和腐生细菌产生的 AHLs 可引起蒺藜苜蓿体内 150
种蛋白改变，表明植物能感知 AHLs［11］。本实验室
证实 N-3-羰基辛酰基高丝氨酸内酯（3OC8-HSL）能
广泛引起拟南芥体内蛋白的变化，发现 53 个变化明
显的蛋白点，其中 2/3 上调。经质谱分析发现这些
蛋白参与多种生理过程，例如，糖代谢、能量代谢、
防卫反应、信号转导和细胞骨架重构等［12］。
不同的 AHLs 可引起植物不同的生理反应。本
实验室研究表明，中短链 AHLs 能显著促进拟南芥
（Col-0） 主 根 生 长， 如 C4-HSL、N-己 酰 基 高 丝 氨
酸内酯（C6-HSL）、N-3-羰基己酰基高丝氨酸内酯
（3OC6-HSL）和 3OC8-HSL，而长链 AHLs 对主根有
明显抑制作用，如 N-十二酰基高丝氨酸内酯（C12-
HSL）和 N-十四酰基高丝氨酸内酯（C14-HSL）［13］。
但 N-癸酰基高丝氨酸内酯（C10-HSL）、C12-HSL 能
促进根毛发育，低浓度 C10-HSL 促进根细胞的分裂
与分化，高浓度 C10-HSL 促进根毛和侧根形成，而
且 C10-HSL 对根系结构的调节作用与生长素相似，
但它对主根、侧根的调节作用并不依赖生长素信号
途径［14］。长链 AHLs 可增加植物在逆境胁迫中的抗
性，特别是抗病方面。N-3-羰基十四酰基高丝氨酸
内酯（3OC14-HSL）预处理拟南芥后，再用 flg22 侵
染拟南芥发现 60 min 后 MPK3 和 MPK6 依然处于活
化状态，植物防卫相关基因 WRKY22 和 WRKY29 以
及 PR1 表达明显增强［15］。但是，植物如何识别、
接受及转导 AHLs 的分子机制尚不清楚。
G 蛋白偶联受体（GPCRs）在细胞信号转导过
程中发挥重要作用。本实验室证实拟南芥中 GCR1
和 G 蛋白 α 亚基（GPA1）参与植物感应 3OC6-HSL
和 3OC8-HSL 的过程［13］。此外，Cand2（At3g05010）
和 Cand7（At5g18520）是拟南芥中待定的 GPCRs，
经酵母双杂交证实二者可与 GPA1 结合［16］。本实
验室证实二者也参与植物感应 3OC6-HSL 和 3OC8-
HSL 的过程，表明 GPCRs 可能在植物感应 AHLs 过
程 中 发 挥 重 要 作 用［17］。GCR2（At1g52920） 是 近
年来深入研究的 GPCRs。研究表明 GCR2 是拟南
芥细胞膜上脱落酸（ABA）的受体，当 GCR2 结合
ABA 后，GPA1 可解离。gcr2 种子不能进入休眠状
态，并对 ABA 抑制种子萌发和幼苗生长的作用不敏
感，表明 GCR2 调控 ABA 介导的信号通路［18］。然
而，Johnston 等［19］认为 GCR2 不是跨膜蛋白，也不
是 GPCRs。Ca2+ 是信号转导过程中细胞内重要的第
二信使，本实验室证实 C4-HSL 和 3OC8-HSL 能升高
拟南芥根细胞质中 Ca2+ 离子浓度，而且增加的 Ca2+
来自胞外，表明这两种 AHLs 可能激活了细胞膜上
的钙离子通道［20，21］。依据之前的研究，本研究通过
qRT-PCR 和 ELISA 方 法 研 究 C4-HSL 对 GCR2 基 因
转录和蛋白表达的影响 ；并利用微量热泳动（MST）
技术［22-24］研究体外纯化的 GCR2 蛋白与 C4-HSL 的
结合特征，旨为 GCR2 参与植物感应细菌 QS 信号——
C4-HSL 提供证据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 拟南芥 野生型拟南芥（Col-0）由本实验室
保存。
1.1.2 菌株与质粒 大肠杆菌 DH5α 和 BL21 及含
pET28a 质粒的 BL21 由本实验室保存，其感受态由
本实验室制备。pMD18-T 载体试剂盒购自 TaKaRa
公司。
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.896
1.1.3 主要试剂和材料 Ex Taq 和 rTaq DNA 聚合
酶、dNTP、T4 DNA 连接酶、BamH Ⅰ和 Xho Ⅰ限制
性内切酶、RNAiso Plus、质粒提取、胶回收、反转
录试剂盒购自 TaKaRa 公司 ；NTA-Ni2+-琼脂糖购自
QIAGEN 公司 ；自装填料柱购自 Bio-Rad 公司 ；咪唑
购自 MP Biomedicals 公司 ；兔源 His-tag 一抗，偶联
辣根过氧化物酶（HRP）山羊抗兔二抗购自 Bioworld
公司 ；兔源 GCR2 一抗由河北省科学院生物研究所
细胞工程室制备 ；超滤离心管购自 Millipore 公司 ；
N-丁 酰 基 高 丝 氨 酸 内 酯（N-Butyryl-DL-homoserine
lactone）购自 Sigma 公司 ；Kit RED NHS 染料试剂盒
购自 Nano Temper 公司。引物由生工生物工程（上
海）股份有限公司合成。克隆的 GCR2 片段送 Life
Technologies 公司测序。
1.2 方法
1.2.1 qPCR 分析 C4-HSL 调控拟南芥 GCR2 基因表
达情况 选用 Hoagland 培养液培养 3 周龄的拟南芥
幼 苗，用 10 μmol/L C4-HSL 处 理并 取 0、1、3、6、
12 和 24 h 样 品。 使 用 RNAiso Plus 提 取 每 份 样 品
的总 RNA 并反转录成 cDNA。qPCR 反应体系为 20
μL，包括 5 μL 稀释的 cDNA、每条引物加 0.4 μL，
10 μL SYBR Premix Ex Taq。用 Applied Biosystems 公
司 7500 Real-Time PCR System 进行检测。所用引物
GCR2（F）5-TGTATGTGCTCTTGGT GCTGT-3，
GCR2（R）5-TATTCCCGAGTTGTCTTCCTG-3 ；
ACTIN（F）5-CCAGAAGGATGCA TATGTTGGTGA-3，
ACTIN（R）5-GAGGAGCCTCGGTAAGAAGA-3。两
对引物 Tm 值为 61℃。
1.2.2 C4-HSL 调控拟南芥 GCR2 表达情况 样品处
理与 1.2.1 相同。液氮研磨后每份样品加入 1 mL 含
有 pH7.5 40 mmol/L Tris/HCl、150 mmol/L NaCl、1
mmol/L EGTA、EDTA、PMSF 和 DTT、10 mmol/L
NaF 和 β-甘 油 磷 酸 盐、20 mmol/L Na3VO4、0.5%
NP-40 和 Triton-100、2 mg/mL Leupeptin、Pepstatin
和 Aprotitin 的蛋白提取液，以提取样品总蛋白。待
提 取 液 融 化 后， 将 其 吸 入 1.5 mL EP 管 中。4℃，
14 000 r/min 离心，15 min 后取上清。上清经 SDS-
PAGE 检测，并用考马斯亮兰 G-250 法确定浓度。
每份样品用包被液稀释至 10 μg/mL。酶标板每孔加
入 100 μL 样品，4℃过夜。然后每孔加入 200 μL 封
闭液，37℃孵育 1 h。洗板 3 次，用洗液将 GCR2 抗
体稀释，每孔加入 100 μL，37℃孵育 45 min。洗板
3 次，每孔加入 100 μL HRP 标记二抗，37℃孵育 30
min。洗板 3 次，每孔加入 100 μL 显色液，37℃孵
育 10 min，最后每孔加入 50 μL 终止液。用 Thermo
Multiskan GO 全波长酶标仪在 450 nm 下检测。
1.2.3 GCR2 片 段 克 隆 与 原 核 表 达 载 体 构
建 从 拟 南 芥 中 克 隆 GCR2 片 段， 上 游 引 物 5-
CGCGGATCCATGGGAGAACGGTTTTTCCG-3（ 下 划
线为 BamH Ⅰ酶切位点），下游引物 5- CCGCTCG-
AGGAGTTCATAACCTGGAAACAGAGCT-3（ 下 划 线
为 Xho Ⅰ酶切位点）。Tm 值为 62℃，再将 PCR 产
物切胶回收。得到 GCR2 片段与 pMD18-T 载体连接，
转到 DH5α 大肠杆菌中并在含氨苄青霉素的 LB 固体
培养基中进行蓝白斑筛选，挑取阳性菌落进行菌落
PCR 验证，并送测序。提取序列正确的 DH5α 大肠
杆菌中 18-T 载体，用 BamH Ⅰ和 Xho Ⅰ将 18-T 载
体中的 GCR2 片段切下，再与切开的 pET28a 载体连
接。进行双酶切及测序鉴定，并将 pET28a-GCR2 转
入 BL21 大肠杆菌中。
1.2.4 His-GCR2 在 大 肠 杆 菌 BL21 中 的 诱 导 表
达 挑 GCR2 单菌落，至含有 1‰卡那霉素（100
mg/mL）的 LB 液体培养基，37℃摇床过夜。过夜
菌液按 2% 接种到新培养基中。放入 37℃摇床，当
OD600 至 0.6-0.7 之间时加入 IPTG，其终浓度为 0.5
mmol/L。随后放入 28℃摇床 5 h 后收集菌体。8 000
r/min 离心 20 min，弃上清。以未加入 IPTG 的菌体
为阴性对照，对诱导后的菌体进行 SDS-PAGE 检测。
1.2.5 His-GCR2 的纯化与浓缩 用 10 mmol/L 咪唑
缓冲液重悬菌体并用其平衡镍柱。超声破碎菌体。
超声后，4℃ 8 000 r/min，离心 20 min，取上清。将
上清加入镍柱中，4℃进行柱结合 2 h。用 80 mmol/L
咪唑缓冲液洗杂蛋白，共洗 3 次。用 250 mmol/L 咪
唑缓冲液洗下目的蛋白，共洗 5 次。最后分别用
250 mmol/L 和 10 mmol/L 咪唑缓冲液清洗镍柱。用
SDS-PAGE 和 Western blot 对 纯 化 出 的 His-GCR2 进
行检测。将第 3-5 次洗脱下来的 GCR2，加到预冷
的超滤离心管里。用 3 500×g，4℃离心约 40 min，
用考马斯 G-250 法确定 GCR2 浓度达到 0.6 mg/mL 左
2015,31(8) 97艾秋实等：拟南芥 GCR2参与感应 N-丁酰基高丝氨酸内酯过程的初步研究
右，将其吸出。用 SDS-PAGE 对浓缩后的 GCR2 进
行检测。
1.2.6 体外结合试验 用 Monolith.NT115 微量热泳
动生物分子互作分析仪对 GCR2 和 C4-HSL 的相互作
用进行分析。反应体系为 0.01 mol/L pH7.0 PBS。用
Kit RED 标记 GCR2，在不同毛细管中其浓度一致。
而 C4-HSL 经倍比稀释后与 GCR2 混合并用毛细管吸
取反应体系。MST 分析仪通过检测 GCR2 与不同浓
度 C4-HSL 互作时荧光分子的热泳动变化来分析二
者互作情况，并计算出解离常数（Kd）。以 BSA 作
为阴性对照。
2 结果
2.1 C4-HSL调控拟南芥GCR2的表达情况
为研究 GCR2 是否参与拟南芥感应 C4-HSL 过
程，先通过 qRT-PCR 检测 GCR2 响应 C4-HSL 表达
情 况（ 图 1）。C4-HSL 处 理 1 h 后 GCR2 出 现 明 显
上调，并在 6 h 达到最大值，随后在 24 h 降至与未
处理时相近的水平，表明 C4-HSL 能增强 GCR2 的
表达。
2.3 拟南芥GCR2的克隆及 pET28a-GCR2重组质粒
的构建
利用 GCR2 特异引物从野生型拟南芥中扩增其
片段，并对目的片段进行胶回收。胶回收产物经 1%
琼脂糖凝胶电泳检测，在预期位置（1 233 bp）有
明显条带（图 3-A）。将 GCR2 片段连到 pMD18-T 载
体并转入 DH5α。用 BamH Ⅰ和 Xho Ⅰ从 pMD18-T
载体上切下 GCR2，再用 T4 连接酶与 pET28a 连接。
对 DH5α 中提取的 pET28a-GCR2 质粒进行双酶切及
测序验证，出现与目的片段大小一致且序列一致的
条带（图 3-B），表明 GCR2 片段已插入 pET28a 载体，
然后将该质粒转入 BL21。
7
6
5
4
3
G
C
R
2⴨ሩ㺘䗮≤ᒣ ᰦ䰤/h210 0 1 3 6 12 24
图 1 C4-HSL 调控 GCR2 表达情况
2.2 C4-HSL调控拟南芥GCR2表达情况
为进一步确定 GCR2 是否紧密参与拟南芥感应
C4-HSL 过程，利用 GCR2 抗体检测其在拟南芥中
的表达情况。经 ELISA 检测（图 2）发现 GCR2 的
表达情况与 GCR2 的表达情况近似。C4-HSL 处理后
GCR2 的表达量从 0-6 h 逐渐增加，6 h 后 GCR2 的
表达量是未处理时的 3 倍，且此时表达量最大。证
明 GCR2 受 C4-HSL 调控。
1.4
1.6
1.2
1.0
0.8
0.6
O
D
٬ ᰦ䰤/h0.40.20 0 1 3 6 12 24
图 2 C4-HSL 调控 GCR2 表达情况
2000
bp
1233
bpM 1
1000
750
500
250
100
2000
bp
A B
1233
bpM 2
1000
750
500
250
100
M ：DNA Marker ；1 ：GCR2 胶回收片段 ；2 ：pET28a-GCR2 双酶切产物
图 3 GCR2 的 PCR 产物胶回收琼脂糖凝胶电泳结果（A）
和双酶切验证重组质粒 pET28a-GCR2（B）
2.4 His-GCR2融合蛋白的诱导及其可溶性检测
GCR2 相对分子量为 46.45 kD。His-GCR2 融合
蛋白经 ExPASy 分析其相对分子量为 51.06 kD。28℃
下 0.5 mmol/L IPTG 诱 导 后， 经 SDS-PAGE 验 证 发
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.898
现，在 40-55 kD 之间出现明显蛋白条带（图 4 第 1、
2 泳道），证明融合蛋白 His-GCR2 在大肠杆菌中表
达。超声破碎菌体后，分别取上清和沉淀进行 SDS-
PAGE 检测。发现沉淀中 His-GCR2 多于上清（图 4
第 3、4 泳道）。但沉淀中的包涵体失去蛋白自身的
活性结构，所以取上清进行纯化。
B）。通过两组实验对比，表明 C4-HSL 与 GCR2 的
结合能力较强，且具有一定的特异性。
3 讨论
植物是生物界中的重要成员，它可将地上和地
下部分的生物群体联系起来。植物需要调节、分配
自身的各种资源以完成生长发育和抵抗外部不利因
素。然而土壤中非致病的根瘤菌、根际真菌和细菌
有助于植物的生长发育［25］。大量研究表明 AHLs 能
促进植物的生长发育，还可提高植物的抗病能力［26］。
但是植物如何识别、接受 AHLs 信号是目前研究的
重点。2013 年，Thomanek［27］合成了生物素标记的
His-GCR2
170
kD M 1 2 3 4
130
100
70
55
40
35
25
15
M ：Protein Ladder ；1 ：诱导前 ；2 ：诱导后 ；3 ：超声菌液上清 ；
4 ：超声后沉淀
图 4 融合蛋白 His-GCR2 诱导表达及可溶性分析 SDS-
PAGE 检测
2.5 His-GCR2融合蛋白的纯化和浓缩
将超声后菌液上清（上清）、结合镍柱后流出
液（流）、杂蛋白洗脱液（W1、W3）及目的蛋白洗
脱液（E1-E5）分别进行 SDS-PAGE（图 5-A）。并
对上清液、流出液及目的蛋白洗脱液（E1-E5）进
行 Western blot 检测，其中 Western blot 分别用 His-
tag 一抗和 GCR2 一抗进行检测（图 5-B，C）。检测
发现 E3-E5 蛋白洗脱液纯度高，利用超虑离心管浓
缩洗脱下的 His-GCR2，浓缩后经考马斯亮兰 G-250
检 测 浓 度 为 0.635 mg/mL， 并 进 行 SDS-PAGE 检 测
（图 5-D）。结果表明，GCR2 没有在浓缩过程中降解，
可用于 MST 检测。
2.6 利用MST技术分析GCR2与C4-HSL体外结合
特征
通 过 MST 技 术 检 测 GCR2 与 C4-HSL， 以 及
BSA 与 C4-HSL 结合情况。测得 GCR2 与 C4-HSL 的
Kd 值为 166 nmol/L，显示出较强的结合能力。BSA
与 100 μmol/L C4-HSL 反应时仍不能达到饱和状态，
根据这条可能的结合曲线估算其 Kd 值约为 18 600
nmol/L，远远大于 GCR2 与 C4-HSL 的 Kd 值（图 6-A，
170
kD
M к␵ ⍱ W1 W3 E1 E2 E3 E4 E5
130
100
70
55
40
35
25
15
A
70
130
kD M 1
170
100
55
40
35
25
15
D
B
C
M к␵ ⍱ E1 E2 E3 E4 E5
55
40
55
40
kD
170
kD
M к␵ ⍱ W1 W3 E1 E2 E3 E4 E5
130
100
70
55
40
35
25
15
A
70
130
kD M 1
1
100
5
40
35
2
15
D
B
C
M к␵ ⍱ E1 E2 E3 E4 E5
55
40
55
40
kD
1
kD
M к␵ ⍱ W1 W3 E1 E2 E3 E4 E5
130
100
70
55
40
35
25
15
A
70
130
kD M 1
1
100
55
40
35
2
15
D
B
C
M к␵ ⍱ E1 E2 E3 E4 E5
55
40
55
40
kD
M ：Protein Ladder ；1 ：浓缩后的 HiS-GCK2
图 5 融合蛋白 His-GCR2 纯化的 SDS-PAGE 和 Western
blot 检测及浓缩后的 SDS-PAGE 检测
M ：Protein Ladder ；上清 ：超声离心后上清菌液 ；流 ：结合镍柱后流出菌液 ；
W1，W3 ：第 1 次和第 3 次洗下的杂蛋白 ；E1-E5 ：5 次洗脱的目的蛋白
M：Protein Ladder；上清：超声后离心上清菌液；流：结合镍柱后流出菌液；
E1-E5 ：5 次洗脱的目的蛋白
2015,31(8) 99艾秋实等：拟南芥 GCR2参与感应 N-丁酰基高丝氨酸内酯过程的初步研究
3OC14-HSL（biotin-3OC14-HSL），其能被在大肠杆
菌中表达的 AHLs 受体识别。使用 biotin-3OC14-HSL
与包被有链霉亲和素的磁珠进行 pull-down 实验，证
实其能够与包被有链霉亲和素的磁珠结合，这为寻
找拟南芥中与 3OC14-HSL 相互作用的蛋白，乃至寻
找 3OC14-HSL 的受体都至关重要［27］。
AHLs 对哺乳动物细胞生理生化的调控机制已
有较为深入的研究。LuxR 蛋白家族中大部分成员是
革兰氏阴性细菌中与 AHLs 相互作用的转录因子［28］。
AHLs 与 LuxR 结合后使其构象发生改变，从而使
LuxR 中 的 HTH（ 螺 旋 - 转 角 - 螺 旋 ） 结 构 域 与
DNA 上游的启动子结合。LasR 和 RhlR 是 LuxR 家
族成员，C4-HSL 和 3OC12-HSL 能够进入猴子肾脏
细胞，并激活在猴子肾脏 COS-1 细胞系中表达的
LasR 和 RhIR 转录因子［29］。3OC12-HSL 在较高浓度
下可显著降低骨髓源巨噬细胞的活性，C4-HSL 不能
抑制其活性。通过细胞核断裂及染色质凝聚情况的
形态学分析，认为 3OC12-HSL 引起骨髓源巨噬细胞
活性降低是由于其引起了细胞凋亡［30］。Rumbaugh
对 3OC12-HSL 和 C4-HSL 处理后的小鼠成纤维细胞
进行转录组表达芯片分析，发现其分别引起 10% 和
8% mRNAs 的改变。3OC12-HSL 可增加小鼠成纤维
细胞中胞质 Ca2+ 水平［31］，这与本实验室用 C4-HSL
和 3OC8-HSL 处理拟南芥根细胞的结果一致［20，21］。
Shiner［31］证实 3OC12-HSL 使胞内钙库内质网中的
Ca2+ 释放到胞质中。认为 3OC12-HSL 激活了磷脂酶
C（PLC），随后 IP3 与内质网上 IP3 的受体结合，从
而促进内质网中的 Ca2+ 释放出来。
GPCRs 可结合多种激素及药物，并通过 PLC 调
节 下 游 的 信 号 通 路。Rumbaugh［32］ 推 测 GPCRs 很
可能作为哺乳动物细胞膜上 AHLs 的受体。本研
究 qRT-PCR 结 果 显 示 拟 南 芥 GCR2 对 C4-HSL 应
答迅速，6 h 后上调至最大值，这与 GCR1、Cand2
和 Cand7 响 应 3OC6-HSL 及 3OC8-HSL 的 情 况 相
似［13，17］。ELISA 结果显示 C4-HSL 处理后 GCR2 蛋
白的表达情况与转录水平近似，也在 6 h 后达到最
大值，证实拟南芥 GCR2 能够响应 C4-HSL。利用超
滤离心管浓缩纯化的 GCR2 用于 MST 检测。经 MST
检测发现 GCR2 与 C4-HSL 具有较强的结合能力。
根据目前已有的报道，宋水山［10］提出了 AHLs 在
真核细胞中信号转导模型，即 AHLs 与细胞膜上的
GPCRs 结合，激活细胞膜表面的 Ca2+ 通道，使胞外
Ca2+ 进入细胞质中。或激活细胞膜上的 PLC，使内
质网中的 Ca2+ 释放到细胞质中。通过 Ca2+ 信号的变
化影响下游代谢途径。另外，MST 检测 BSA 与 C4-
HSL 是否结合时，出现了一条可能的结合曲线。这
是因为 BSA 作为具有亲水和疏水集团的运输蛋白，
可与非离子表面活性剂［33］、黄酮类［34］、酯类［35］等
小分子结合。C4-HSL 作为一种酯类小分子物质，极
有可能与 BSA 发生某种非特异的结合，且经检测发
现这种可能的结合极其微弱。由此表明 GCR2 与 C4-
HSL 的结合具有特异性。由于 GCR2 作为 ABA 通
路的上游基因［18］，GCR2 与 C4-HSL 具有明显的结
合特征，表明 C4-HSL 可能具有增强植物抗性作用。
然而，拟南芥 GCR2 是否作为 C4-HSL 的受体还需
使用多种受体动力学研究方法进一步研究。
100 1000 10000
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A
B
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or
m
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/1
00
0]
Fn
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m
[1
/1
00
0]
图 6 GCR2 与 C4-HSL 结合特征分析（A）和 BSA 与 C4-
HSL 结合特征分析（B）
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.8100
4 结论
本 研 究 通 过 qRT-PCR 分 析 C4-HSL 对 拟 南 芥
GCR2 表达水平的调节情况，发现 GCR2 受 C4-HSL
调控，且 C4-HSL 处理后 GCR2 响应迅速，且上调时
间较长。利用 ELISA 检测 C4-HSL 处理后拟南芥中
GCR2 的含量，进一步证实 GCR2 受 C4-HSL 调控。
浓缩体外表达的 GCR2 进行 MST 检测，发现 GCR2
与 C4-HSL 具有较强的结合能力，并且具有一定的
特异性。由此证明，拟南芥 GCR2 可能介导了拟南
芥响应 C4-HSL 的信号转导过程。
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（责任编辑 李楠）