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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2014年第4期
红色原鸡属于原鸡属（Gallus gallus），被认为是
家鸡唯一的祖先［1］，主要分布于东南亚一带。红色
原鸡有 5 个亚种［2］，其中海南亚种（G. g. jabouillei）
和滇南亚种（G. g. spadiceus）分布于中国，前者主
收稿日期 ： 2013-12-20
基金项目 ：国家自然科学基金项目（31060130）
作者简介 ：孙亭亭，女，硕士研究生，研究方向 ：兽医微生物学与免疫学 ；E-mail ：sunting915@yeah.net
通讯作者 ：陈培富，男，博士，副教授，研究方向 ：兽医微生物学与免疫学 ；E-mail ：cltwins2003@163.com
红色原鸡外周血单个核细胞 IFN-γ 的诱导表达及其
荧光定量 PCR 检测
孙亭亭1  冀斌1  马志亮1  胡文丽1  鲁琼芬1  张雄伟2  陈培富1
（1. 云南农业大学动物科学技术学院，昆明 650201 ；2. 云南省红河州金平县畜牧局，金平 661500）
摘 要 ： 为建立检测红色原鸡外周血单个核细胞（PBMC）中干扰素 γ（IFN-γ）mRNA 表达水平的方法，通过优化刀豆蛋白
A（Con A）诱导 PBMC 表达 IFN-γ 的条件，采用 RT-PCR 方法以 3-磷酸甘油脱氢酶（GAPDH）基因为内参扩增 IFN-γ 基因，插入
克隆载体 pMD18-T 分别构建重组质粒 pMD-IFN-γ 和 pMD-GAPDH，以其作为标准品采用 SYBR Green I 染料法建立荧光定量 PCR 检
测方法，并将该方法应用于 34 只红色原鸡 PBMC IFN-γ 表达量的检测。结果发现，PBMC 在 20 μg/mL Con A 刺激培养 12 -25 h 时
IFN-γ 处于高表达水平 ；标准品质粒 pMD-IFN-γ 和 pMD-GAPDH 分别在拷贝数 6.72×102-6.72×109、3.94×102-3.94×109 范围内与
其对应的 Ct 值呈现良好的线性关系（R2 > 0.99），扩增产物的熔解曲线均只有特异的单峰，表明所用引物特异性强。在优化 Con A
诱导红色原鸡 PBMC 表达 IFN-γ 条件的基础上，建立了可用于定量检测红色原鸡 PBMC IFN-γ mRNA 表达水平的荧光定量 PCR 方法。
关键词 ： 红色原鸡 干扰素 γ Con A 诱导 荧光定量 PCR 外周血单个核细胞
Induced Expression and Real-time PCR Detection of IFN-γ from
PBMC in Red Jungle Fowl
Sun Tingting1 Ji Bin1 Ma Zhiliang1 Hu Wenli1 Lu Qiongfen1 Zhang Xiongwei2 Chen Peifu1
（1.College of Animal Science and Technology，Yunnan Agricultural University，Yunnan Kunming 650201 ；2. Bureau of Animal Production
and Health，Yunnan Jinping 661500）
Abstract:  In order to establish the method for detection of interferon-gamma（IFN-γ）mRNA expression in PBMC of red jungle fowl
（RJF）, the induction conditions of IFN-γ expression were optimized. IFN-γ gene and 3-phosphoric acid glycerol dehydrogenase（GAPDH）
gene as an internal control were respectively amplified from the total RNA by RT-PCR and cloned into a pMD18-T vector, to obtain the
recombinant plasmids（pMD-IFN-γ and pMD-GAPDH）which served as templates to map the standard curve of real-time PCR with SYBR
Green I staining. This method was then applied to 34 RJF. The results showed that IFN-γ was expressed at high levels when PMBC were
stimulated with 20 μg/mL of Con A for 12 - 25 h. A good linear correlation（R2>0.99）was observed as the templates ranged from 6.72×102-
6.72×109 copies for IFN-γ and 3.94×102-3.94×109 copies for GAPDH, and the melting curves presented single peaks, respectively. Based
on the optimized condition of Con A-induced IFN-γ expression in PBMC, real-time PCR method was successfully established for quantitative
analysis of RJF IFN-γ mRNA.
Key words:  Red Jungle Fowl Interferon-γ Con A induction Real-time PCR PBMC
要分布于海南、广西及云南东南部，后者多分布于
云南西部、西南部和南部，尤以西双版纳最为集中。
版纳红色原鸡在当地俗称茶花鸡，具有野性足、抗
病力强、耐粗放饲养、适应性广、繁殖力强、能与
2014年第4期 103孙亭亭等 ：红色原鸡外周血单个核细胞 IFN-γ 的诱导表达及其荧光定量 PCR 检测
家鸡杂交产生有繁殖力的后代等特点［3］。红色原鸡
作为一个重要的禽类品种资源，应用潜力很大，随
着人们对动物资源保护意识的提高和育种技术的发
展，针对红色原鸡的研究也越来越受到重视。
干 扰 素 γ（Interferon-gamma，IFN-γ） 是 Ⅱ 型
干扰素，能够激活巨噬细胞分泌抗炎症因子、刺激
MHC Ⅱ类分子的表达，促进 B 细胞分化、产生抗体
及转换免疫球蛋白类别，比Ⅰ型干扰素具有更强的
免疫调节功能［4］。IFN-γ 作为抗原提呈细胞和淋巴
细胞增殖、分化的调节剂参与细胞炎症反应和抗病
毒免疫，其高表达量对病毒的清除有重要的作用［5］。
IFN-γ 主要由大颗粒淋巴细胞和活化的 T 细胞分泌，
未经刺激时表达量极低［6-8］，但当动物机体受到病毒、
有丝分裂原、RNA、特异性抗原等刺激时，T 细胞
被活化，暂时性高表达 IFN-γ。因此，IFN-γ 常作为
细胞免疫系统活化的指标，通过检测 IFN-γ的表达量，
了解免疫系统的活化水平，为评价机体的免疫状态
提供依据［9，10］。实时荧光定量 PCR 检测技术具有
准确、快速、高效、高度敏感和特异等优点，能够
从 mRNA 水平检测细胞因子的表达，成为当今备受
关注的研究手段。本研究优化 Con A 诱导红色原鸡
PBMC 表达 IFN-γ 的最佳条件，建立荧光定量 PCR
检测 IFN-γ mRNA 相对表达量的方法，并初步应用
于 34 只红色原鸡的临床检测。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 试验动物 云南省德宏、普洱、红河地区共
收集成年红色原鸡 34 只。
1.1.2 主要试剂和仪器 鸡外周血淋巴细胞分离液
（天津灏洋生物制品科技有限公司）；Con A（北京华
迈科生物技术有限责任公司）；改良型 RPMI-1640 细
胞培养液（HyClone）；胎牛血清（BioInd）；青链霉
素（BioInd）；RT-PCR 相关试剂、pMD-18T 克隆载体、
感受态细胞 DH5α 及工具酶（TaKaRa）；质粒提取试
剂盒、胶回收试剂盒（天根生化科技有限公司）。主
要仪器有 Bio-Rad iQ5 荧光定量 PCR 仪、紫外分光
光度计、低温离心机及凝胶成像系统等。
1.2 方法
1.2.1 引物设计与合成 根据 GenBanK 提供的鸡
IFN-γ 基因序列（NM_205149.1）及 GAPDH 基因序
列（NM_204305）分别设计标准品引物和荧光定量
引物（表 1），由宝生物（大连）生物工程有限公司
合成。
表 1 标准品引物和荧光定量 PCR 引物的核苷酸序列
引物名称 引物序列（5-3） 扩增片段大小（bp）
标准品引物 IFNG-F1 GCCATCACCAAGA-
AGATGACTT
560
IFNG-R1 GTGCATTGTAAAAT-
TTAAAATAGTTGAGC

GAPDH-F1 GTGTTATCATCTC-
AGCTCCCTCAG
547
GAPDH-R1 AAAGGTGGAAGA-
ATGGCTGTCACC

定量引物 IFNG-F2 GAGCCAGATTGT-
TTCGATGTACTTG
113
IFNG-R2 CATCAGGAAGGT-
TGTTTTTCAGAG

GAPDH-F2 CATCACAGCCAC-
ACAGAAGACG
117
GAPDH-R2 TTTCCCCACAGC-
CTTAGCAG


1.2.2 PBMC 分离培养及 Con A 诱导 IFN-γ 表达条件
的优化 鸡翅下静脉采集抗凝血 3 mL，3 000 g/min
离心 10 min 后弃上层血浆，按 1∶1（体积比）灭
菌生理盐水重悬细胞，将其平铺于等体积的 PBMC
分 离 液 的 上 层。3 000 g/min 离 心 15 min 后， 小 心
吸出中间层的 PBMC 置于灭菌离心管中。灭菌生
理盐水洗涤 2-3 次，离心弃上清，细胞重悬于改良
型 RPMI-1640 培养液。显微镜下计数，调整细胞培
养板上每孔的细胞数量为 1×107 个。为了优化 Con
A 诱导 IFN-γ 表达的条件，设计 Con A 终浓度为 5、
10、20、50 μg/mL 共 4 个 梯 度， 培 养 时 间 6 、12、
21、25 、29、32、43、50、57、64、72 h 共 11 个梯度，
在每个时间点收集细胞并提取 RNA，反转录后用引
物 IFN-F1/R1、GAPDH-F1/R1 扩 增 IFN-γ 和 GAPDH
基因，确定 Con A 诱导 IFN-γ 表达的最佳条件。
1.2.3 荧光定量 PCR 方法的建立
1.2.3.1 标准品的构建 将获得的 IFN-γ 和 GAPDH
基因连接到克隆载体 pMD18-T 上，构建重组质粒
pMD-IFNγ 和 pMD-GAPDH， 转 化 大 肠 杆 菌 DH5α，
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第4期104
经 PCR 鉴定筛选出阳性重组质粒作为标准品。紫外
分光光度计测定标准品质粒的浓度和纯度，按公式
计算单位体积中质粒的拷贝数［copies=6.02×1023 ×
（浓度 / 平均分子量）］，-80℃保存。
1.2.3.2 标准曲线的绘制 将标准品质粒以 10 倍
梯 度 稀 释， 取 2 μL 为 模 板 用 引 物 IFNG-F2/R2、
GAPDH-F2/R2 采 用 SYBR Green I 染 料 法 进 行 荧 光
定量 PCR 检测，反应条件为 95℃预变性 30 s ；变性
95℃ 5 s、延伸 60℃ 30 s 共 40 个循环，每个循环结
束时采集荧光信号。40 个循环结束后将扩增产物进
行熔解，程序为 75℃至 95℃，每 0.2℃采集一次荧
光信号，程序结束后绘制标准曲线与熔解曲线。
1.2.3.3 重复性和稳定性试验 选 3 个不同浓度的
标准品各设 4 个重复进行荧光定量 PCR 检测，计算
组内变异系数评价其重复性。将样品保存于 -20℃，
1 周后再次进行荧光定量 PCR 检测，计算组间变异
系数评价其稳定性。
1.2.4 方法的应用 采集 34 只红色原鸡的外周血 3
mL/ 只，分离培养 PBMC，以 Con A 诱导培养后刮取
细胞提取总 RNA 并反转录，取 2 μL cDNA 为模板用
引物 IFN-F2/R2、GAPDH-F2/R2 进行荧光定量检测，
同时将标准品 pMD-IFN-γ 和 pMD-GAPDH 以 10 倍倍
比稀释后进行定量 PCR 扩增，检测结果采用“双标
准曲线法”计算每只鸡 IFN-γ 的相对表达量。
2 结果
2.1 Con A诱导PBMC表达IFN-γ的最佳条件
PBMC 经 Con A 诱导刺激后，在不同时间点收
集细胞，RT-PCR 扩增 IFN-γ 基因结果见图 1。结果
显示，Con A 浓度为 20 μg/mL 刺激淋巴细胞培养 6 h
时已有 IFN-γ 表达，12 h 时达到最高峰，29 h 后开
始下降，至 64 h 时普通 RT-PCR 已检测不出，即 20
μg/mL Con A 刺激 PBMC 12 -25 h 为 IFN-γ 诱导表达
的最佳条件。
2.2 重组质粒鉴定结果
将重组质粒 pMD-IFN-γ 和 pMD-GAPDH 通过引
物 IFNG-F2/R2、GAPDH-F2/R2 扩 增 分 别 得 到 113
bp 与 117 bp 大小的条带，与预期大小相符且条带
单一，可以作为荧光定量 PCR 的标准品（图 2）。
使用紫外分光光度计检测标准品质粒浓度和纯度，
pMD-IFN-γ 和 pMD-GAPDH 质粒浓度分别为 12 ng/μL
和 7 ng/μL，根据公式计算可得质粒拷贝数分别为
3.36×109 copies/μL 和 1.97×109 copies/μL，A260/280 分
别为 1.91 和 1.87，表明质粒纯度高。
2000
bp
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
560
bp
1000
750
500
250
100
M ：DL2000 Marker ；1-11 ：Con A 诱导 PBMC 6、12、21、25、29、32、43、
50、57、64、72 h RT-PCR 扩增结果
图 1 Con A 刺激 PBMC 各时间点 IFN-γ 基因 RT-PCR
鉴定结果
2000
bp bp
M 1 2
117
1000
750
500
250
100
M ：DL2000 Marker ；1 ：IFN-γ 扩增结果 ；2 ：GAPDH 扩增结果
图 2 荧光定量 PCR 引物扩增结果
2.3 标准曲线的绘制
以 10 倍 梯 度 稀 释 的 标 准 品 质 粒 为 模 板， 进
行 IFN-γ 和 GAPDH 基因荧光定量 PCR 扩增，并绘
制标准曲线和熔解曲线（图 3）。IFN-γ 和 GAPDH
的 Ct 值 与 其 质 粒 拷 贝 数 在 6.72×102-6.72×109 和
3.94×102-3.94×109 范围内呈现良好的线性关系，
相关系数分别为 R2=0.998 和 R2=0.999（图 3-A，3-B），
熔解曲线分别只出现一个单峰（图 3-C），表明所用
引物特异性高。
2.4 重复性与稳定性分析
IFN-γ 和 GAPDH 标准品 3 个稀释度的组内变
异系数分别为 0.409%-0.977%、0.433%-0.999%（表
2），均小于 1%，表明同一样品重复性好。组间变异
系数分别为 0.5%-1.28% 和 0.395%-1.093%，表明标
准品稳定性高。
2014年第4期 105孙亭亭等 ：红色原鸡外周血单个核细胞 IFN-γ 的诱导表达及其荧光定量 PCR 检测
1200
1000
800
600
400
PC
R
B
as
e
L
in
e
Su
bt
ra
ct
ed
C
ur
ve
F
it
R
FU
200
0
0 10
204.63
Amplfication Chart
Amplfication Chart
20
Cycle
30 40
0
500
400
300
200
-d
(R
FU
)/
dt
100
-100
1.00
55.00
IFN-γ
Met Peat Chart Met Peat Chart
65 75 85
Temperature, Cetstus Temperature, Cetstus
95908070
0
350
300
200
250
150
-d
(R
FU
)/
dt
100
50
-100
-50
1.00
GAPDH
55.00
65 75 85 95908070
0
10 20
224.87
Cycle
30 40
10
20
30
35
Standard
T
hr
od
rd
C
rc
le
Unknown
25
15
5
2 4 6
Log Starting Quantity, copy number
8 10
1400
1600
1800
1200
1000
800
600
400
PC
R
B
as
e
L
in
e
Su
bt
ra
ct
ed
C
ur
ve
F
it
R
FU
200
0
1400
E=88.6% R2=0.998 slope=-3.628 y-int=44SYBR1
10
20
30
35
40
Standard
T
hr
od
rd
C
rc
le
Unknown
25
15
5
2 4 6
Log Starting Quantity, copy number
8 10
E=85.0% R2=0.999 slope=-3.742 y-int=45SYBR1
C
B
A
A ：IFN-γ 基因扩增曲线 ；B ：GAPDH 基因扩增曲线 ；C ：IFN-γ 和 GAPDH 熔解曲线
图 3 IFN-γ 和 GAPDH 标准曲线和熔解曲线的绘制
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第4期106
2.5 样品检测结果
用建立的荧光定量 PCR 方法检测的 34 只红色
原鸡 PBMC IFN-γ 和 GAPDH 基因（图 4）。测定结果
以 GAPDH 内参进行校正，采用“双标准曲线”法
计算 IFN-γ 基因的相对表达量。以样品 1 号作为基
准将计算结果以柱状图显示（图 5），其中表达量差
异最大的为 9 号和 11 号鸡，其 IFN-γ 表达量分别为
1 号鸡的 5.221 倍和 0.243 倍，表明不同个体间受到
相同刺激的情况下 IFN-γ 的表达量差异显著。
PBMC 表达 IFN-γ 水平，对判定牛结核的准确率可达
93.6%，被澳大利亚农业常务委员会认定为牛肺结
核官方诊断方法［11］。通过有丝分裂原体外诱导淋巴
细胞能够模拟动物机体受到抗原刺激时免疫应答的
水平，目前常用 Con A、植物血凝素（PHA）或佛
波醇乙酯（PMA）诱导刺激鸡胚、脾淋巴细胞表达
IFN-γ［12-14］。这些方法得到的 IFN-γ mRNA 丰度高，
易于扩增，但是耗时长、过程繁琐，易污染。本研
究对 Con A 诱导 PBMC 表达 IFN-γ的条件进行了优化，
发现 20 μg/mL Con A 刺激 12 -25 h 为 IFN-γ 表达高
峰期，试验周期较短，且外周血的采集比脾脏淋巴
细胞的获取简单易行，有利于减少污染。
基因表达水平可在蛋白或基因两种水平上进行
表 2 IFN-γ 和 GAPDH 标准品组内变异系数和组间变异系数
样品名称 质粒浓度（copies/μL） Ct 平均值 标准方差（s） 组内变异系数（CV/%）
组内变异系数 IFN-γ-1 6.72×109 09.31 0.091 0.977
IFN-γ-2 6.72×106 19.09 0.078 0.409
IFN-γ-3 6.72×103 30.22 0.161 0.533
GAPDH-1 3.94×109 09.71 0.097 0.999
GAPDH-2 3.94×106 19.87 0.086 0.433
GAPDH-3 3.94×103 31.27 0.147 0.470
组间变异系数 IFN-γ-1 6.72×109 09.45 0.121 1.280
IFN-γ-2 6.72×106 19.18 0.098 0.511
IFN-γ-3 6.72×103 30.09 0.198 0.658
GAPDH-1 3.94×109 09.79 0.107 1.093
GAPDH-2 3.94×106 19.51 0.077 0.395
GAPDH-3 3.94×103 31.37 0.158 0.504
224BJ200
400
600
800
1000
1200
1400
1600
1800
2000
2200
0
0 5 10 20 30 40352515
Cycle
GAPDH
IFN-γ
PC
R
b
as
e
L
in
e
Su
bi
ra
ct
ed
C
ur
ve
F
it
R
FU
图 4 34 只红色原鸡 IFN-γ 和 GAPDH 基因荧光定量
PCR 扩增曲线
0
红色原鸡编号
1 2 3 4 5 6 7 8 9 101112131415161718192021222324 25262728293031323334
1 1.00
0.243
2
3
均
值
相
对
表
达
量
5
4
5.221
6
图 5 34 只红色原鸡 IFN-γ 基因相对表达量
3 讨论
IFN-γ 是机体内在病毒防御和免疫调节中发挥
重要作用的细胞因子，通过检测 IFN-γ 的含量能够
为评价机体的细胞免疫状态提供依据。在临床试
验中，通过检测 IFN-γ 的含量能够诊断某些疾病，
如通过检测野生结核杆菌菌株特异性抗原诱导牛
2014年第4期 107孙亭亭等 ：红色原鸡外周血单个核细胞 IFN-γ 的诱导表达及其荧光定量 PCR 检测
评价，在蛋白水平的检测有 ELISA、细胞内细胞因
子染色等，在基因水平上有 Northern 杂交、RNA 酶
保护试验等，这些方法的试验周期相对较长，且
敏感性相对较低［15］。荧光定量 PCR 技术提高检测
的敏感性和特异性，最低可检测 10 个拷贝。SYBR
Green I 方法通用性好且价格低于探针法，但由于
SYBR Green 的结合特性，容易产生非特异性信号，
所以对引物设计的要求比较高。本试验建立的荧
光定量 PCR 方法所用标准品质粒在 1×102-1×109
copies/μL 范围内相关系数高（R2>0.99）；通过熔解
曲线分析及重复性试验证明该方法特异性强且重复
性和稳定性高。荧光定量 PCR 结果采用“双标准曲
线法”对目的基因进行相对定量，通过内参对目的
基因的定量结果进行校正，消除采集样品和 RNA 反
转录操作过程中的误差。“双标准曲线法”具有试验
优化相对简单、数据分析准确等优点［16］，但在每次
试验时都必需扩增标准品建立标准曲线，基于本研
究建立的 IFN-γ 和 GAPDH 的标准曲线其扩增效率和
相关性比较一致，在应用于大量样品检测时，可转
换为采用 2- △△ CT 法计算相对表达量，使检测方法更
为简便。
应用本研究建立的荧光定量 PCR 方法检测了
34 只红色原鸡 PBMC 受到相同刺激后 IFN-γ 基因的
表达水平，发现最高表达量与最低表量之间相差 25
倍，说明不同个体间受到相同刺激后的免疫应答水
平差异大，表明不同个体抗病毒病能力存在强弱差
异。基因表达量的高低与基因多态性相关，已有大
量研究证明人的 IFN-γ 基因存在多个能够影响其表
达量的多态性位点［17］，而且这些位点的多态性与某
些疾病的易感存在相关性［18-20］。中国科学院北京基
因组研究所将肉鸡、蛋鸡、乌骨鸡与原鸡的基因组
框架图进行比较，发现家鸡和原鸡之间有 280 多万
个 SNPs，而且这些差异大部分产生于鸡被人类驯化
之前［21］，这表明原鸡可能拥有比家鸡丰富得多的基
因多态性。国内还有学者对红色原鸡的 mtDNA 遗传
多样性及部分基因座位的遗传多样性进行研究［22］，
但未见对红色原鸡 IFN-γ 基因多态性及其与疾病易
感性关系的研究报道。因此，将红色原鸡作为优势
种质资源，找到影响 IFN-γ 表达差异的多态性位点，
以期揭示其多态性影响表达量的分子机制，可为筛
选抗病力强的 IFN-γ 基因型、培育出抗病品系提供
科学依据。
4 结论
以 20 μg/mL 的 Con A 刺激培养红色原鸡外周血
单个核细胞（PBMC）12-25 h 为 IFN-γ 表达的最佳
条件。建立的检测 IFN-γ 表达水平的荧光定量 PCR
方法，其标准品质粒拷贝数在 102-109 范围内与对应
的 Ct 值之间呈现良好的线性关系（R2 > 0.99），重复
性与特异性强。将其应用于 34 只红色原鸡 IFN-γ 的
检测，发现不同个体受到相同刺激时 IFN-γ 表达水
平存在较大差异。
参 考 文 献
［1］ Fumihito A, Miyake T, Sumi SI, et al. One subspecies of the red jun-
glefowl（Gallus gallus gallus）suffices as the matriarchic ancestor
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［2］ Fumihito A, Miyake T, Takada M, et al. Monophyletic origin and
unique dispersal patterns of domestic fowls［J］. Proceedings of the
National Academy of Sciences, 1996, 93（13）：6792-6795.
［3］ 胡日查 , 赵建国 , 王学梅 , 等 . 红色原鸡及其研究进展［J］. 中
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［4］ Shtrichman R, Samuel CE. The role of gamma interferon in antimic-
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（责任编辑 李楠）