全 文 ：头花蓼对淋巴细胞分泌干扰素 γ和白介素 4的影响*
＊
冯海潮1＊＊，孙朝琴1，何 芸1，吴 琼1，张 然2，莫 非1，罗昭逊1＊＊＊
(1．贵州医科大学，贵州 贵阳 550004;2．山东聊城人民医院，山东 聊城 252000)
［摘 要］目的:研究苗药头花蓼对淋巴细胞分泌干扰素 γ(IFN-γ)及白介素 4(IL-4)的影响。方法:制备
C57BL /6 小鼠脾淋巴细胞悬液，同刀豆蛋白 A(ConA)及不同浓度的头花蓼(终浓度分别为:1、2、4、8、16、32、64、
128、256、512 mg /L)于 37 ℃、5% CO2 培养箱共培养 72 h，细胞活性检测试剂盒(CCK-8)检测头花蓼对体外 T淋
巴细胞增殖的影响，酶联免疫吸附实验(ELISA)测定细胞上清中的 IFN-γ 和 IL-4 含量，分析不同浓度的头花蓼
对 ConA活化的脾淋巴细胞增殖和分泌 IFN-γ、IL-4 的影响。结果:头花蓼浓度 ＞ 128 mg /L时，明显抑制 T淋巴
细胞的增殖，抑制其分泌 IFN-γ的水平，与空白组比较差异有统计学意义(P ＜ 0. 05);头花蓼浓度为 8 ～ 128 mg /
L 时，ConA活化的脾淋巴细胞分泌 IFN-γ和 IL-4 的水平明显高于空白对照，而 T 淋巴细胞的增殖无明显变化;
头花蓼的浓度低于 32 mg /L时，ConA活化的淋巴细胞的 IFN-γ分泌水平随头花蓼浓度升高而增加。结论:一定
浓度的头花蓼刺激小鼠脾淋巴细胞增殖、IFN-γ和 IL-4 分泌，参与机体细胞免疫过程。
［关键词］植物药;淋巴细胞;头花蓼;干扰素 γ;白介素 4
［中图分类号］Ｒ931 ［文献标识码］A ［文章编号］1000-2707(2016)06-0645-04
DOI:10． 19367 / j． cnki． 1000-2707． 2016． 06． 006
Influence of Polygonum capitatum on IFN-γand IL-4
Secretion in Spleen Lymphocytes
FENG Haichao1，SUN Chaoqin1，HE Yun1，WU Qiong2，ZHANG Ｒan2，MO Fei1，LUO Zhaoxun1
(1． Guizhou Medical University，Guiyang 550004，Guizhou，China;2． Liaocheng People＇s Hospital，
Liaocheng 252000，Shangdong，China)
［Abstract］Objective:To investigate the effect of Polygonum capitatum on the secretion of IFN-γ and
IL-4 in mice spleen lymphocytes． Methods:A series of concentrations of Polygonum capitatum (final
concentrations were 1，2，4，8，16，32，64，128，256，512 mg /L)in splenic lymphocytes of C57BL /6
mice that were activated by ConA for 72 h at the condition of 37 ℃ and 5%CO2。Following Counting
Kit-8 was used to detected lymphocytes proliferation and double antibody sandiwich ELISA was used to
detect changes，the effect of Polygonum capitatum with different concentration on proliferation and se-
cretion of IFN-γ and IL-4 was analyzed． Ｒesults:The T-cell proliferation and IFN-γ secretion was re-
strained when the concentration of Polygonum capitatum was higher than 128 mg /L． The level of IFN-
γ and IL-4 secreted by mice spleen lymphocytes after ConA activation was higher obviously with Polyg-
onum capitatum at the concentration between 8 to128 mg /L，compared with the blank control group (P
＜ 0． 05)． T-cell proliferation had no obvious change． When the concentration of Polygonum capitatum
was lower than 32 mg /L，secretion amount of IFN-γ increased as the concentration of Polygonum capi-
tatum become higher． Conclusion:Polygonum capitatum at a certain concentration could participate
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第 41 卷 第 6 期
2016 年 6 月
贵 州 医 科 大 学 学 报
JOUＲNAL OF GUIZHOU MEDICAL UNIVEＲSITY
Vol． 41 No． 6
2016． 6
* *［基金项目］贵州省科学技术基金［黔科合(2014)2027 号］;贵州省科技合作计划基金［黔科合 LH(2015)7417 号］;贵州省卫生计生委科学技术基金
(gzwikj2015 － 1 － 003) ;贵阳市科技局计划项目［筑科合同(2014001)］
＊＊贵州医科大学 2013 级研究生 E-mail:461698511@ qq． com
＊＊＊通信作者 E-mail:418611578@ qq． com
网络出版时间:2016 － 06 － 17 网络出版地址:http:/ /www． cnki． net /kcms /detail /52． 5012． Ｒ． 20160617． 1035． 002． html
in cellular immunity that stimulate the mice spleen lymphocytes proliferation，and secretion IFN-γ and
IL-4 in vitro ．
［Key words］Polygonum capitatum;spleen lymphocytes;interferon-γ;interleukin-4
头花蓼(polygonum capitatum)为蓼科蓼属植物
头花蓼的全草，为贵州精选苗药。有“清热利湿，
活血解毒之功效”［1］，全草入药，民间常用于治疗
泌尿系统疾病［2］。目前关于头花蓼的研究多局限
于种植技术及成分分析，其药理活性研究报道少
见。已有研究报道，头花蓼对淋病奈瑟菌、幽门螺
杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌等具有抗菌活
性［3 － 4］，其有效成分黄酮和没食子酸具有确切的免
疫调节作用。T细胞参与免疫调节的重要环节，辅
助性 T淋巴细胞(T helper cell，Th)占 T 细胞总数
的 65%，具有识别抗原，分泌多种细胞因子的效
应，从多方面引起和增强免疫能力。Th 细胞分为
Th1 细胞和 Th2 细胞两个细胞亚群，Th1 细胞主要
分泌干扰素 γ(interferon-γ，IFN-γ)、TNF-α 等细胞
因子，主要介导宿主细胞免疫应答;Th2 细胞主要
分泌白细胞介素(interleukin-4，IL-4)、IL-10 等细胞
因子，介导宿主体液免疫应答。正常状态下，Th1
和 Th2 细胞因子相互制约、相互调节，处于动态平
衡，维持机体正常的细胞和体液免疫功能［5］。本
研究应用头花蓼与脾淋巴细胞在体外进行共培养，
观察不同浓度的头花蓼作用于脾淋巴细胞后，Th1
(IFN-γ)和 Th2(IL-4)细胞因子的表达水平，评价
头花蓼的免疫调节功能。
1 材料和方法
1． 1 材料
头花蓼浸膏由浙江众益公司提供，清洁级
C57BL /6 雄性小鼠体质量(20 ± 5)g［批号 SYXK
(渝)2007 － 0001］，胎牛血清购自杭州四季青生物
工程材料有限公司，改良 ＲPMI-1640 培养基
(hclone及批号 NAF1417)，IFN-γ和 IL-4 ELISA试
剂盒购自 Ausrtian Bender MedsystemsMT公司，刀豆
蛋白 A(ConA)购自 Sigma公司及批号 NO． C8110，
CCK-8 细胞活性检测试剂盒购自日本同仁，CO2 培
养箱(Thermo)及酶标仪(BIO-xMAark)。
1． 2 方法
1． 2． 1 头花蓼工作液 用无菌双蒸水配制头花蓼
母液，浓度为 25. 6 g /L，进行一系列倍比稀释，得到
头花蓼工作液浓度分别为 12. 8、6. 4、3. 2、1. 6、
0. 8、0. 4、0. 2、0. 1、0. 05、0. 025 g /L，4 ℃放置备用。
1. 2. 2 脾淋巴细胞悬液 颈椎脱臼处死小鼠，无
菌取小鼠脾脏。剪碎，置于 2 张无菌载玻片毛玻璃
面之间，研磨，200 目无菌筛网过滤，4 ℃ 离心
(1 000 r /min，10 min)。弃上清，加入红细胞裂解
液作用 3 min，4 ℃离心(1 000 r /min，5 min)，弃上
清，Hank’s液洗涤 2 次。Hank’s 液重悬细胞，小
心重叠于等体积的淋巴细胞分离液上，4 ℃离心
(2 000 r /min，20 min)，吸出淋巴细胞层，加入预冷的
ＲPMI-1640培养液，4 ℃离心(1 000 r /min，10 min)。
弃上清，10%的小牛血清 ＲPMI-1640 培养液重悬
细胞。台盼蓝染色确定细胞存活率大于 95%，
37 ℃、5% CO2 培养 2 h时，去除贴壁细胞，调整细
胞浓度约 2 × 109 /L。
1. 2. 3 头花蓼对脾淋巴细胞的毒性试验 将制备
好的脾细胞悬液加入 96 孔细胞培养板，86 μL /孔，
然后添加 10 μL ConA(终浓度为 5 mg /L)。头花
蓼干扰组再加入上述梯度浓度的头花蓼工作液
4 μL(使头花蓼的终浓度分别为 512、256、128、64、
32、16、8、4、2、1 mg /L)，空白对照组加入 4 μL 含
10%胎牛血清的 ＲPMI-1640 培养基。培养板置
37 ℃、5% CO2 细胞培养箱中，培养 72 h。培养结
束前 4 h，加入 CCK-8 液 10 μL，继续培养 4 h，用酶
标仪测定在 450 nm 波长下吸光度值(OD)。每孔
100 μL，设 3 个复孔，试验重复 3 次，取均值。
1. 2. 4 IL-4 和 IFN-γ的水平 将脾淋巴细胞悬液
加入 96 孔培养板，加入 ConA，每孔终浓度为 5 mg /
L，再加入不同浓度的头花蓼工作液，终浓度分别
为(512、256、128、64、32、16、8、4、2、1 mg /L)，空白
组加入等体积的 ＲPMI-1640 培养基，每个药物浓
度及对照平行做 3 孔，每孔 100 μL。培养板置
37 ℃，5% CO2 温箱中培养 72 h。收集上清液，4℃
离心(2 000 r /min，10 min)，上清液于 － 20 ℃保
存，待测。严格按照酶联免疫吸附测定(enzyme-
linked immuno rbent assay，ELISA)试剂盒操作说
明，通过绘制标准曲线求出 IL-4 和 IFN-γ 的浓度。
实验重复 3 次。
1. 3 统计学方法
计量资料数据均由均数 ±标准差(x ± s)表示，
采用 SPSS 11. 5 软件进行统计学分析，多组间比较
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贵 州 医 科 大 学 学 报 41 卷
采用 ANOVA分析，方差齐采用 LSD 检验，方差不
齐采用 Dunnett-t 进行方差分析，P ＜ 0. 05 差异有
统计学意义。
2 结果
2. 1 头花蓼对 T淋巴增殖水平的影响
培养 72 h时，头花蓼 ＜ 128 mg /L时，对小鼠脾
脏体外淋巴细胞增殖没有明显的影响;≥128 mg /L
浓度时，淋巴细胞数量明显降低，与空白对照组比
较，差异有统计学意义(P ＜ 0. 05)。提示头花蓼浓
度低于 128 mg /L时，对淋巴细胞没有毒性，不影响
其增殖，见表 1。
表 1 不同浓度头花蓼对小鼠脾淋巴
细胞增值的影响(x ± s)
Tab． 1 The effect of Polygonum capitatum on
proliferation of splenic lymphocyte in mice
组别 淋巴细胞 OD450nm
空白对照组 0. 67 ± 0. 02
头花蓼实验组(mg /L)
1 0. 66 ± 0. 01
2 0. 71 ± 0. 01
4 0. 69 ± 0. 02
8 0. 60 ± 0. 01
16 0. 65 ± 0. 02
32 0. 66 ± 0. 02
64 0. 54 ± 0. 04
128 0. 50 ± 0. 03(1)
256 0. 32 ± 0. 02(1)
512 0. 20 ± 0. 02(1)
(1)与空白对照组比较，P ＜ 0. 05
2. 2 头花蓼对 IFN-γ和 IL-4 的影响
头花蓼浓度 4 ～ 128 mg /L 时，IFN-γ 的分泌水
平明显增高，与空白组比较，差异有统计学意义(P
＜ 0. 05)，在 32 mg /L 时，IFN-γ 的分泌量达到顶
峰。头花蓼浓度≥256 mg /L 时，淋巴细胞分泌
IFN-γ的水平明显降低，与空白组比较，差异有统
计学意义，(P ＜ 0. 05) ;头花蓼的浓度在 4 ～ 128
mg /L时，IL-4 分泌量明显增高，与空白对照组比较
具有统计学差异;浓度大于 512 mg /L时，淋巴细胞
分泌 IL-4 的水平低于空白对照组，差异无统计学
意义，见表 2。提示适宜浓度的头花蓼对体外培养
的小鼠分泌 Th1、Th2 细胞因子具有一定的刺激作
用，对 Th1 细胞因子的分泌水平呈现出一定的浓度
相关性。
表 2 头花蓼对体外培养的小鼠脾淋巴细胞
分泌 IFN-γ及 IL-4 的影响(ng /L)
Tab． 2 Effects of polygonum capitatum on IFN-γ and
IL-4 secretion in mice spleen lymphocytes in vitro
组别 TFN-γ(ng /L) IL-4(ng /L)
空白对照组 94. 07 ± 6. 34 17. 78 ± 2. 27
头花蓼实验组(mg/L)
1 92. 35 ± 4. 03 15. 93 ± 1. 67
2 98. 64 ± 6. 23 21. 32 ± 1. 49
4 137. 30 ± 8. 72(1) 28. 68 ± 2. 61(1)
8 161. 72 ± 8. 78(1) 30. 34 ± 3. 29(1)
16 189. 29 ± 9. 82(1) 22. 98 ± 4. 75(1)
32 250. 82 ± 16. 63(1) 24. 96 ± 2. 63(1)
64 193. 45 ± 11. 17(1) 22. 98 ± 3. 24(1)
128 129. 07 ± 15. 24(1) 25. 56 ± 3. 24(1)
256 84. 74 ± 7. 07(1) 20. 55 ± 5. 06
512 87. 53 ± 5. 33(1) 13. 90 ± 5. 47
(1)与空白对照组比较，P ＜ 0. 05
3 讨论
细胞因子是由活化的免疫细胞和某些基质细
胞分泌的具有高活性、多功能的小分子物质，它们
涉及免疫和炎症的每个环节，可以调节和决定免疫
应答的性质［5 － 8］。依据 Th分泌产生细胞因子及功
能特征的不同，把 Th 淋巴细胞分为 Th1 细胞和
Th2 细胞两个细胞亚群［9］。Th1 细胞主要分泌产
生 IFN-γ、TNF-α等细胞因子，IFN-γ作为 Th1 型代
表细胞因子，它在初级免疫应答中可提高 MHCⅡ
类分子的表达和细胞抗原递呈能力，导致记忆型 T
细胞水平增高［10］，主要促进细胞免疫;Th2 细胞主
要分泌产生 IL-4、IL-10 等细胞因子，对 B 细胞、T
细胞、单核细胞、树突状细胞、内皮细胞、纤维细胞
等非特异细胞具有多种调节功能，是体液免疫应答
的重要调节因子［11］。在正常状态下，体内 Th1 和
Th2 细胞因子相互制约、相互调节，处于动态平衡，
维持机体正常的细胞和体液免疫功能［12-13］，而
IFN-γ、IL-4 作为 Th1 /Th2 型免疫相关因子，在一定
程度上可反映出机体细胞免疫和体液免疫的基本
状况［14］。
有研究报道幽门螺杆菌感染后可介导异常的
细胞免疫导致胃黏膜屏障受损，进一步促进溃疡形
成［15］。本实验通过观察不同浓度的头花蓼对体外
脾淋巴分泌 Th1 /Th2 型典型细胞因子的诱生效
果，初步了解头花蓼免疫调节作用，为后续关于头
746
6 期 冯海潮等 头花蓼对淋巴细胞分泌干扰素 γ和白介素 4 的影响
花蓼治疗幽门螺杆菌相关性胃炎、消化性溃疡的免
疫调节机制奠定基础。结果显示 4 ～ 128 mg /L 的
头花蓼对 ConA活化的淋巴细胞分泌 IFN-γ和 IL-4
均具有明显的促进作用，这可能与其中的多糖、黄
酮、槲皮素等有效成分有关。已有报道多种中药的
多糖成分通过诱生 IFN-γ 和 IL-4 增强机体的抗病
力［16］，维持机体的细胞免疫和体液免疫;Farhadi
L［17］报道类黄酮可促进淋巴细胞增殖，刺激 IFN-γ
分泌，降低 IL-4 含量，发挥其免疫调节效应。但高
剂量的头花蓼对 ConA 活化淋巴细胞分泌 IFN-γ
和 IL-4 有不同程度的抑制分泌作用，可能通过抑
制淋巴细胞的增殖，进而抑制 Th1 细胞、Th2 细胞
分泌相应的细胞因子。此外中药的成分比较复杂，
高剂量时，其中的某些活性成分与中药的蛋白质和
鞣质等成分结合，致使药液中的一些有效成分凝固
变性，一定程度上影响了药效。所以，采用中药进
行免疫调节时，需选择合适的剂量。
本研究结果显示头花蓼可刺激 IFN-γ 和 IL-4
的分泌作用，但两者浓度需在一定的范围内，才能
使 Th1 /Th2 免疫调节处于平衡状态，以维持机体
正常的细胞免疫和体液免疫功能。观察系列浓度
的头花蓼刺激脾淋巴细胞分泌 IFN-γ、IL-4 效果，
不仅显示了该药对两者的分泌的促进作用，还显示
了两者不同分泌水平下头花蓼的浓度趋势，为头花
蓼关于免疫调节方面的深入研究提供相关浓度依
据。而关于头花蓼在机体内是否能够刺激 IFN-γ
和 IL-4 的分泌，调节 Th1 /Th2 免疫平衡及其有效
的调节途径还需通过体内实验进行观察验证，进一
步探索其调节途径及作用机理。
4 参考文献
［1］南京中医药大学．中药大辞典(上册)［M］． 2 板．上海:
上海科技出版社，2006:850．
［2］贾敏如，李星炜．中国民族药志要［M］．北京:中国医药
科技出版社，2005:479．
［3］刘瑜新，宋晓勇，康文艺，等．头花蓼对多重耐药金黄色
葡萄球菌抗菌作用研究［J］．中成药，2014(9):1817 －
1821．
［4］张姝，罗昭逊，莫非，等．头花蓼对幽门螺杆菌抗菌作用
分析［J］．中国医院药学杂志，2015(2):113 － 118．
［5］Haghshenas MＲ，Khademi B，Ashraf A，et al． Helper
and cytotoxic T cell subsets (Th1，Th2，Tc1 and Tc2)in
benigh and malignant salivary gland tumors ［J］． Oral
Dis，2016:12496．
［6］罗娜，郭晟，杨承英，等． 人 BClGL 基因 siＲNA 逆转录
病毒的制备及其对 T 淋巴细胞增殖的影响［J］． 贵阳
医学院学报，2009(3):250 － 254．
［7］Jiong Ｒ，Zhi Q，Yang TJ． Immunomodulatory activity in
vitro and in vivo of polysaccharide from Potentilla anserina
［J］． Fitoterapia，2010(81) :1117 － 1124．
［8］朱伟，付本懂，王鲁，等． 硫酸化 20(S)-人参皂苷 Ｒh2
对小鼠脾淋巴细胞分泌 IL-4 和 IFN-γ 的影响［J］． 实
验研究，2011(17):17 － 19．
［9］Li LL，Zhang B，Zhu NH，et al． Effects of polysaccha-
rides on immunologie function in early-weaned piglets
［J］． Ｒesearch of Agriculture Modernization，2009(4) :
495 － 497．
［10］Zhou H，Buitenhuis AJ，Weigen S，et al． Candiate gene
promoter polymorphisms and antibody respense kinetics in
chickens:interferon-γ，interleukin-2，and immunoglobu-
lin light chain［J］． Poultry Science，2001(80) :1679 －
1689．
［11］Wang N，Shen GS，Bai HG． Ｒesearch progress of inter-
leukin-4 gene［J］． Chinese Journal of Animal Husbandry
and Veterinary Medicine，2005(1) :23 － 25．
［12］陈全英，陈万般． 活动期溃疡性结肠炎患者 Th1 /Th2
平衡的特点与药物调节［J］． 海南医学院学报，2010
(4):429 － 434．
［13］Mat sumura K，Nakase H，Yamamoto S，et al． Modula-
tion of the Th1 /Th2 balance by infliximab improve hyper-
thyroidism associated with a flare up of ulcerative colitis
［J］． Inflamm Bowel Dis，2009(7) :967 － 968．
［14］Mosmann TＲ，Subash S． The expanding universe of T-
cell subsets:Th1，Th2 and more［J］． Immunol Today，
1996(1) :136 － 139．
［15］吴德明，吴治德，刘怡菲．幽门螺杆菌相关的消化性溃
疡患者 Th17 /Treg细胞及其细胞因子的表达水平及意
义［J］．临床荟萃，2014(7):536．
［16］商云霞，朱晓庆，谷新利，等．中药复方多糖对鸡 IFN-
γ、IL-4 和 IL-12 质量浓度的影响［J］． 西北农业学报，
2015(5):24 － 28．
［17］Farhadi L，Mohammadi-Motlagh HＲ，Seyfi P，et al． Low
concentration of flavonoid-rich fraction of shallot extract
induce delayed-type hypersensitivity and Th1 cytokine
IFN-γ expression in BALB /c Mice［J］． Int J Mol Cell
Med，2014(1) :16 － 25．
(2016－03－03 收稿，2016－05－24 修回)
中文编辑:刘 平;英文编辑:赵 毅
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