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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2014年第11期
D-二聚体（D-dimer）是交联纤维蛋白发生纤溶
的特异性标志物，由纤维蛋白原逐步水解而成［1］。
纤维蛋白原是一种具有凝血功能的血浆球蛋白，主
要作为凝血因子 I 参与体内凝血过程［2］。经凝血酶、
Factor XIIIa 作用，纤维蛋白原被水解成交联纤维蛋
白；纤溶酶可使纤维蛋白（原）D-E 区互补结构裂解，
降解纤维蛋白原和纤维蛋白单体生成纤维蛋白原降
解产物，以及降解交联纤维蛋白生成纤维蛋白降解
产物，纤维蛋白降解产物中含有大量的 D-dimer［3， 4］。
D-dimer 分子量约为 180 kD［5］，在健康人体内含量
收稿日期 ：2014-05-12
基金项目 ：国家高技术研究发展计划（“863”计划）（2011AA02A103），广东省战略新兴产业核心技术攻关项目（2012A080800007）
作者简介 ：武建伟，男，硕士，研究方向 ：免疫诊断 ；E-mail ：Jarviswu@hotmail.com
通讯作者 ：唐时幸，男，博士，研究方向 ：免疫诊断 ；E-mail ：tang.shixing@wondfo.com.cn
人 D-二聚体的制备及其冻干性质的分析
武建伟  才蕾  王继华  唐时幸
（广州万孚生物技术股份有限公司 自检型快速诊断国家地方联合工程实验室，广州 510663）
摘 要 ： 以人源纤维蛋白原为原材料制备 D-二聚体，将其制成冻干品并分析其冻干性质。使用凝血酶、Factor XIIIa 酶解纤
维蛋白原，获得交联纤维蛋白。经纤溶酶降解交联纤维蛋白，生成纤维蛋白降解产物。超滤除去纤维蛋白降解产物中的小分子物质，
可获得较高纯度的 D-二聚体。通过筛选和优化冻干方案，将 D-二聚体制备成冻干品。经检测可知，D-二聚体冻干品可在 37℃稳定
保存 12 d ；复溶后在 25℃稳定保存 8 d ；复溶后在 4℃稳定保存 30 d ；复溶时，常用复溶溶剂对其复溶后的活性检测无明显影响。
关键词 ： 纤维蛋白 纤维蛋白原 D-二聚体 血栓 冻干品
Preparation and Analysis of Lyophilization Characterization of
Human D-dimer
Wu Jianwei Cai Lei Wang Jihua Tang Shixing
（National Engineering Laboratory of Rapid Diagnostic Test， Guangzhou Wondfo Biotech Co.，Ltd.，Guangzhou 510663）
Abstract: D-dimer is formed by sequential action of 3 enzymes from fibrinogen. After producing D-dimer, we did the research on its
lyophilization process. To produce cross-linked fibrin, fibrinogen was digested by thrombin and Factor XIIa. Then, fibrin degradation products
（FDP）was prepared from cross-linked fibrin being degraded by plasmin. D-dimer was purified from FDP through ultrafiltration and prepared
into lyophilized powder. By optimizing the lyophilization program, lyophilized D-dimer was stable for at least 12 days at 37℃, stable for at
least 8 days at 25℃ and 30 days at 4℃ after reconstitution, and not different when being dissolved by different solvent.The preparation system
established in this research is feasible and efficient. Depend on its stability, lyophilized D-dimer could be provided as biological raw materials for
further research.
Key words: Fibrin Fibrinogen D-dimer Thrombus Lyophilized power
极 少， 一 般 认 定 0.5 mg/L（FEU） 为 cut-off 值［6］。
另有研究表明，D-dimer 的 cut-off 值与年龄呈正相关，
年龄愈大，cut-off 值愈高［7］。
机体内凝血和继发性纤溶系统的激活，均可使
D-dimer 水平升高［8］。临床诊断中，D-dimer 检测常
用 于 ：静 脉 血 栓 栓 塞（Venous thrombus embolism，
VTE）、 深 静 脉 血 栓（Deep vein thrombosis，DVT）
和 肺 血 栓（Pulmonary embolism，PE） 的 排 除， 以
及 弥 漫 性 血 管 内 凝 血（Disseminated intravascular
coagulation，DIC）的诊断、溶栓治疗的监测［9-12］；
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第11期220
急 性 心 肌 梗 塞（Acute myocardial infarction，AMI）、
冠状动脉缺血（Coronary ischemia）、脑梗塞（Cerebral
infarction）［12-14］的诊断和预后判断 ；恶性肿瘤，如
肺癌（Lung cancer）、卵巢癌、结肠直肠癌（Colorectal
cancer）、乳腺癌（Breast cancer）［15-18］，以及肝脏疾
病［19］、糖尿病［20］、妊娠高血压综合征高凝状态［21］
等的诊断和预后判断。
真空冷冻干燥（Vacuum Freeze-drying），简称“冻
干”，是在适宜的真空度下将物质中的水分析出的技
术，已广泛应用于生物制品、医药、食品、花卉产业、
标本制作和古书籍保护等领域［22］。生物制品通过真
空冷冻干燥制成冻干品后，具有稳定、易复溶等优
势，便于保存和运输。商品化的人源 D-dimer 蛋白
多以液体形式保存于血清中，对保存和运输条件要
求苛刻。以健康新生牛血清作为冻干基质对 D-dimer
蛋白进行冻干，制备的 D-dimer 冻干品具有良好的
稳定性和实用性。
近年来，D-dimer 研究多集中于生理意义的剖析
和医学价值的探讨，本研究着重介绍人源 D-dimer 的
制备及其冻干性质的分析。通过逐步酶解和真空冷
冻干燥获得稳定高效的 D-dimer 冻干品，旨在为人
源蛋白的制备和保存提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料
人源纤维蛋白原、人源凝血酶、人源纤溶酶、
抑 肽 酶、Tris-base 购 自 Sigma 公 司 ；人 源 Factor
XIIIa 购 自 AssayPro 公 司 ；0.22 μm 滤 器、Amicon
Ultra-15（MWCO ：100KDa） 购 自 Millipore 公 司 ；
健 康 新 生 牛 血 清、PageRuler Unstained High Range
Protein Ladder 购 自 Thermo Scientific 公 司 ；D-二 聚
体（D-dimer）定量检测试剂盒（免疫层析法）为广
州万孚生物技术股份有限公司（Wondfo）自主研发；
其它试剂均为国产分析纯。
蛋 白 电 泳 仪、Bio-Rad Gel Doc XR+ 凝 胶 成 像
系统购自 Bio-Rad 公司 ；医用冷藏箱购自中科美菱
公 司 ；AutoRep E 连 续 分 配 器 购 自 RAININ 公 司 ；
CHRIST ALPHA 1-2/ LD PLUS 冻 干 机 购 自 Martin
Christ 公司 ；-86℃立式医用低温保存箱购自 SANYO
公司。
1.2 方法
1.2.1 D-dimer 的制备
1.2.1.1 纤维蛋白原的酶解 称取适量纤维蛋白原
至 离 心 管 中， 溶 入 TBS（20 mmol/L Tris-HCl，0.15
mol/L NaCl，2 mmol/L KCl，pH7.4） 至 终 浓 度 为
5 mg/mL， 加 入 凝 血 酶（ 终 浓 度 1 U/mL）、Factor
XIIIa（终浓度 5 μg/mL），37℃水浴 4-6 h，即得到
白色胶状交联纤维蛋白。
1.2.1.2 交联纤维蛋白的洗涤 取出交联纤维蛋白
至 50 mL 离心管中，使用 TBS 颠倒洗涤数次，放于
37℃恒温摇床中振荡洗涤约 2-3 h。
1.2.1.3 交联纤维蛋白的酶解 取出洗涤完毕的交
联纤维蛋白至干净的离心管，加入 TBS（交联纤维
蛋 白 湿 重 终 浓 度 200 mg/mL）、 纤 溶 酶（ 终 浓 度 5
mU/mL），37℃水浴至溶液中不再有絮状交联纤维蛋
白。向反应体系中加入抑肽酶（终浓度 1 μg/mL），
充分混匀。
1.2.1.4 D-dimer 的 超 滤 使 用 0.22 μm 无 菌 滤 器
将 新 制 的 D-dimer 溶 液 过 滤 至 超 滤 管（MWCO ：
100KDa）中，超滤浓缩（2 000×g，20 min，4℃）。
向 浓 缩 液 中 加 入 适 量 TBS， 再 次 进 行 超 滤 浓 缩
（2 000×g，20 min，4℃），分装制得的 D-dimer 浓缩
液，保存于 -80℃冰箱中。
1.2.2 D-dimer 冻干性质的分析
1.2.2.1 D-dimer 的活性检测与冻干方案的筛选 使
用 D-二聚体（D-dimer）定量检测试剂盒（免疫层析
法，线性范围 ：0.1-10 mg/L）检测制备的 D-dimer
活性。为提高 D-dimer 稳定性，将其制成 D-dimer 冻
干品。以 3 mL 棕色玻璃瓶为容器，每瓶加入 500 μL D-
dimer 冻干工作液。通过调节真空冷冻干燥时的真
空度及冻干时间、冻干稀释液组份及 pH，对冻干方
案进行筛选及优化。根据 D-dimer 冻干品的精密度
和系列稳定性，选定最佳冻干方案。
1.2.2.2 D-dimer 冻 干 品 的 稳 定 性 分 析 为 验 证
D-dimer 冻 干 品 的 稳 定 性， 使 用 Wondfo D-二 聚 体
（D-dimer）定量检测试剂盒监测 D-dimer 冻干品在
37℃稳定性、复溶后 4℃/25℃稳定性、不同溶剂复
溶冻干品对其活性检测的影响等。
2014年第11期 221武建伟等：人 D-二聚体的制备及其冻干性质的分析
2 结果
2.1 D-dimer的制备和超滤
将纤维蛋白原酶解体系置于 37℃水浴中，白色
交联纤维蛋白迅速生成，反应体系完全呈胶状。酶
解体系中的交联纤维蛋白在 37℃水浴中逐渐萎缩，
直至完全消失。新制的 D-dimer 溶液活性远超出 D-
二聚体（D-dimer）定量检测试剂盒的检测范围，需
适度稀释后用于定量检测。经 SDS-PAGE 凝胶电泳
和 Bio-Rad Gel Doc XR+ 凝胶成像系统分析，交联纤
维蛋白的降解产物中，D-dimer 纯度约为 60% ；超
滤后，小分子蛋白被大量除去，D-dimer 纯度升高至
90%（图 1）。使用 A280nm 紫外吸收法检测 D-dimer 溶
液浓度，发现 D-dimer 蛋白总量约为纤维蛋白原的
一半，即制备得率约为 50%。
Drying）/0.012 mbar（Final Drying），冻干时间由冻
干样品的总装液量而定。冻干后，从每个浓度的冻
干品中随机取出 10 支进行检测。稀释后的 D-dimer
冻干品活性值均位于检测试剂的检测范围内，3 个
浓度冻干品的批内精密度（C.V）均小于 15%（表 1）。
表 1 Wondfo 试剂检测 D-dimer 冻干品均值与精密度
浓度 H 浓度 M 浓度 L
x-（mg/L） 5.11 1.81 0.41
s（mg/L） 0.38 0.10 0.05
C.V 7.44% 5.52% 10.02%

2.3 D-dimer冻干性质的分析
随机选取 D-dimer 冻干品用于各项检测，参考
区间由检测精密度时的均值而定，即 ：x
-
±25%。检
测发现，D-dimer 冻干品可在 37℃稳定保存 12 d（表
2），复溶后在 4℃稳定保存 30 d（表 3），复溶后在
25℃稳定保存 8 d（表 4）。
表 2 D-dimer 冻干品 37℃稳定性
浓度（mg/L）
保存时间
参考区间
1 d 6 d 8 d 10 d 12 d 14 d
H 4.6 4.7 4.9 4.8 4.5 4.3 6.5-3.9
M 1.7 1.6 2.1 2.2 1.7 1.4 2.3-1.4
L 0.4 0.4 0.5 0.4 0.3 0.2 0.5-0.3
检测不同溶剂复溶冻干品对其活性检测的影响
时，选用去离子水、三蒸水、生理盐水、瓶装矿泉水
（农夫山泉）和自来水复溶冻干品。经检测，选用的
5 种溶剂复溶冻干品时对其活性检测均无明显影响
（表 5）。
3 讨论
继 Ruckley 等［23］于 1970 年发现血清 FDP 对肺
栓塞具有重要的诊断价值之后，Gaffney 在 FDP 中
分离得到将近 200 kD 大小的“γ-γ dimers”，将其命
名为 D-dimer，并预言“D-dimer 检测可能会成为有
用的诊断依据”［24-26］。经过多年的研究和临床验
证，研究人员发现 D-dimer 分子量约为 180 kD，等
电点（pI）为 4.9-5.3，在健康人体内的半衰期约为
8 h［27］，是交联纤维蛋白降解的特异性产物，对多
项疾病的诊断具有重要的检测意义。由于 D-dimer
不 存 在 疾 病 特 异 性， 在 临 床 诊 断 中，D-dimer 以
M ：High Range Protein Ladder ；1 ：交联纤维蛋白降解产物 ；
2 ：超滤后制得的 D-dimer 蛋白溶液
图 1 D-dimer 的 SDS-PAGE 凝胶电泳纯度分析
250
kD kD
M 1 2
200 190
150
120
100
85
70
60
2.2 D-dimer的活性检测与冻干方案的筛选
经 过 多 次 摸 索 和 验 证， 按 照 一 定 的 比 例 将
D-dimer 蛋白溶液稀释成位于 D-二聚体（D-dimer）
定量检测试剂盒检测范围内的 3 个不同的浓度（高
浓度 H、中浓度 M、低浓度 L）。鉴于临床检测的
D-dimer 样品多以全血或血浆为基质，本研究拟以健
康新生牛血清作为 D-dimer 蛋白的冻干保护剂。冻
干 前， 使 用 冻 干 稀 释 液（50 mmol/L Tris-HCl，0.1
mol/L NaCl，0.5 mmol/L EDTA，pH8.0）调节新生牛
血清比例（冻干稀释液组份及 pH 经多次正交试验
筛选和优化而得，详细步骤略）。根据冻干品的系
列稳定性检测结果，将冻干保护剂定为 12% 新生
牛血清，真空冷冻干燥真空度 ：0.025 mbar（Main
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第11期222
其高度的敏感性和阴性预示能力时常用于筛查项
目 和 辅 助 诊 断。 据 世 界 卫 生 组 织（World Health
Organization，WHO）发布的《Global status report on
noncommunicable diseases（2010）》报告称，心脑血
管疾病已成为全球头号死因，每年死于心脑血管疾
病的人数约占全球死亡人数的 30%［28］。鉴于 D-dimer
可作为血栓形成性疾病诊断和溶栓药物疗效监测的
特异性标志物，D-dimer 检测对血栓导致的心脑血管
疾病的及早诊断和治疗，便显得尤为重要。
目前，国内多采用进口 D-dimer 抗原进行相关
研究或制备单克隆抗体。进口抗原纯度虽高，但价
格昂贵，且多以液体形式保存，严重制约了 D-dimer
的研究及其运输和保存。本研究采用逐步酶解法和
超滤即获得高纯度高活性的 D-dimer 蛋白，并通过
真空冷冻干燥将其制成稳定的 D-dimer 冻干品。选
用健康新生牛血清为冻干基质，冻干品复溶后几乎
可作为天然 D-dimer 抗原使用。制备的 D-dimer 蛋
白浓度约为 5.6 mg/mL，使用 Wondfo D-二聚体（D-
dimer）定量检测试剂盒检测 1 000 倍稀释后的蛋白
溶液冻干前的活性约为 5.0 mg/L，冻干后的活性约
为 4.5-5.0 mg/L，检测时的活性收率和冻干时的活性
收率均超过 90%。
笔 者 曾 在 D-dimer 超 滤 浓 缩 前， 使 用 HiPrep
16/60 Sephacryl S-300 HR（GE） 对 其 进 行 多 次 纯
化， 纯 化 效 率 均 不 理 想。D-dimer 经 HiPrep 16/60
Sephacryl S-300 HR 纯化后，蛋白纯度未能明显提
高，蛋白浓度却因被稀释而明显降低。鉴于超滤后
的 D-dimer 纯度约为 90%，可满足 D-dimer 常规研究
使用，如用作室内质控品/物、阳性对照、免疫或初
筛单克隆抗体。
Shackell［29］于 1909 年使用真空干燥技术将补体、
抗毒素、狂犬病毒及其它生物制品进行冻干，制成
可以稳定保存的冻干品。随着冻干原理的深入研究
和冻干设备的改良，真空冷冻干燥技术现已发展成
为集多门学科于一体的综合技术工艺。在冻干过程
中，预冻过的物料置于真空条件下进行升华干燥，
除去冰晶（约占全部水分的 90%），升华干燥完成后
进入解析干燥，除去未冻结水，至物料中水分含量
<3%［30］。制成的 D-dimer 冻干品呈多孔饼状，对温
度、浓度或蛋白酶都具备较高的耐受程度，且易复
溶和恢复活性。为使制备的 D-dimer 冻干品更接近
于 D-dimer 天然抗原，以符合临床检测标准，本研
究使用新生牛血清作为冻干基质对 D-dimer 进行冻
干。D-dimer 冻干品在 37℃稳定保存 12 d ；复溶后
表 3 D-dimer 冻干品复溶后 4℃稳定性
浓度（mg/L）
保存时间
参考区间
0 h 24 h 5 d 10 d 15 d 20 d 25 d 30 d 35 d
H 4.5 4.4 4.8 5.2 4.7 5.3 4.6 4.4 4.4 6.5-3.9
M 1.8 1.6 1.6 1.7 1.7 1.9 1.6 1.7 1.3 2.3-1.4
L 0.3 0.4 0.4 0.4 0.3 0.5 0.3 0.5 0.3 0.5-0.3
表 4 D-dimer 冻干品复溶后 25℃稳定性
浓度（mg/L）
保存时间
参考区间
0 h 4 h 8 h 24 h 2 d 4 d 6 d 8 d 10 d
H 5.0 4.8 4.8 4.9 4.8 4.6 4.4 4.7 4.6 6.5-3.9
M 1.9 1.8 1.7 1.6 1.6 1.6 1.5 1.5 1.4 2.3-1.4
L 0.5 0.5 0.5 0.4 0.4 0.3 0.4 0.3 0.2 0.5-0.3
表 5 不同溶剂复溶 D-dimer 冻干品对其活性检测的影响
浓度（mg/L） 去离子水 三蒸水 生理盐水 瓶装矿泉水（农夫山泉） 自来水 参考区间
H 4.9 4.7 4.8 4.7 4.7 6.5-3.9
M 1.7 1.6 1.8 1.5 1.8 2.3-1.4
L 0.3 0.3 0.4 0.4 0.4 0.5-0.3
2014年第11期 223武建伟等：人 D-二聚体的制备及其冻干性质的分析
在 4℃稳定保存 30 d ；复溶后在 25℃稳定保存 8 d ；
使用常规溶剂复溶对活性检测无明显影响。
4 结论
本研究阐述了一项简捷高效的人源 D-dimer 制
备方案，以人源纤维蛋白原为原材料，先后经过凝
血酶、Factor XIIIa、纤溶酶等酶解和超滤即制得高
纯度的人源 D-dimer 蛋白，适于临床研究的 D-dimer
冻干品具备较好的稳定性。
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（责任编辑 马鑫）