全 文 ：基金项目:黑龙江省教育厅科学技术研究项目 (编号:
11511357)。
作者简介:金丽霞(1980—), 女 ,主治医师 , 医学博士 ,黑龙江
中医药大学附属第一医院(哈尔滨　 150040);宋立群 ,单位同第一
作者;马艳春 、宋业旭 ,黑龙江中医药大学。
通讯作者:宋立群 , E-mail:qunli@sina.com。
·实验研究 ·
虫草肾茶胶囊对人肾小球系膜细胞 TGF-β1 mRNA
及 PAI-1mRNA表达的影响
金丽霞　宋立群　马艳春　宋业旭
　　摘要:目的:研究虫草肾茶胶囊对培养在高糖条件下人肾小球系膜细胞(HMC)转化生长因子 -β1mRNA(TGF-
β
1
mRNA)和纤维蛋白溶解酶原激活物抑制剂 -1mRNA(PAI-1mRNA)表达的影响 ,探讨其在糖尿病肾病(DN)防治中的意
义。方法:制备虫草肾茶胶囊及福辛普利药物血清 , 用实时定量 PCR方法测定各组 HMCTGF-β1以及 PAI-1mRNA表达 ,
并以福辛普利为对照 。结果:虫草肾茶胶囊高 、中剂量组及福辛普利组 TGF-β 1mRNA和 PAI-1mRNA表达均低于高糖组 ,
且以虫草肾茶胶囊高剂量组表达最低(P<0.05)。结论:高糖可促进 HMCTGF-β 1mRNA和 PAI-1mRNA表达 , 虫草肾茶胶
囊可下调高糖刺激下 HMCTGF-β 1mRNA及 PAI-1mRNA的表达 , 从而预防肾小球硬化的发生 、发展 , 进而延缓 DN的进展。
　　关键词:虫草肾茶胶囊;人肾小球系膜细胞;转化生长因子 -β 1;纤维蛋白溶解酶原激活物抑制剂 -1;实验研究
　　中图分类号:R285　文献标识码:A　文章编号:1000-7156(2011)05-0044-03
ResearchofCapsuleofChong-caoShen-chaontheExpressionsofHMCTGF-β 1 mRNA
andPAI-1mRNA　JINLi-xia, SONGLi-qun, MAYan-chun, etal.(TheFirstHospitalAf-
filiatedtoHeilongjiangUniversityofChineseMedicine, Haerbin, 150040, China)
Abstract:Objective:TostudytheinfluenceofCapsuleofChong-caoShen-chaontheexpressionsofTGF
-β1mRNAandPAI-1mRNAinanthropo-mesangialcel(HMC)undertheconditionofhighglucose, andin-
vestigatethesignificanceondiabeticnephropathy.Method:AtfirstCapsuleofChong-caoShen-chaandfosino-
prilserumweremade.ThentheexpressionsofHMCTGF-β1 mRNAandPAI-1mRNAweredetectedineach
groupwiththemethodofreal-time-quantitation-PCR, andfosinoprilwasasthecontrol.Result:Theexpres-
sionsofTGF-β1mRNAandPAI-1mRNAwerelowerinhighandmediumdosegroupsofCapsuleofChong-cao
Shen-chaandfosinoprilgroupthaninhighglucosegroup.Andtheexpressionsoftheminhighdosegroupof
CapsuleofChong-caoShenchawerethelowest(P<0.05).Conclusion:Highglucosecanpromotetheexpres-
sionsofHMCTGF-β1mRNAandPAI-1mRNA, andCapsuleofChong-caoShen-chacandodownregulation
ontheexpressionsofthemstimulatedbyhighglucose.SoCapsuleofChong-caoShen-chacanpreventbefore-
handfromtheoccurenceandadvancementofglomerularsclerosis, andthendefertheprogresionofDN.
Keywords:CapsuleofChong-caoShen-cha, anthropo-mesangialcel, TGF-β1 , fibrinoclaseproen-
zymeactivatorinhibiter-1 (PAI-1mRNA), experimentalstudy
　　细胞外基质(ECM)积聚引起的肾小球硬化与间质纤
维化是 DN发展至终末期肾功能衰竭的主要病理表现。
ECM的过度堆积和(或)降解减少均视为病理性重塑 , 是肾
脏病变发生 、发展的主要原因。 TGF-β1作为体内 ECM的
调节器 , 控制着 ECM的合成和降解以及黏附分子受体的表
达 、整合素的表达 , 从而影响 ECM的重建。因此 ,对抗 TGF
-β 1的作用以阻止肾小球疾病的进展将具有重大意义。
在 ECM降解过程中主要有丝氨酸蛋白酶类 、基质金属蛋白
酶类和半胱氨酸蛋白酶类三种蛋白酶系统参与 , 纤溶酶
原 /纤溶酶系统为肾小球细胞外基质降解的主要丝氨酸蛋
白酶系统 ,纤溶酶原系统激活后不仅能直接降解细胞外基
质 ,还能激活金属蛋白酶间接降解基质 [ 1] , 处于各种调节
酶系的上游 ,发挥着更为重要的作用。 PAI-1是丝氨酸蛋
白酶抑制剂家族成员之一 , 是纤溶酶原激活剂的抑制剂。
PAI-1的基因表达和生物学活性变化将导致肾小球细胞
外基质降解障碍 ,参与细胞外基质积聚和肾小球硬化等病
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变过程 [ 2] 。 TGF-β
1
是 DN发生 、发展的重要中介 , PAI-1
是其引起 ECM积聚的环节之一。
该实验在细胞培养体系中加入高糖刺激 HMC, 观察虫
草肾茶胶囊药物血清对 HMCTGF-β 1mRNA和 PAI-
1mRNA表达的影响 , 探讨虫草肾茶胶囊抑制 “增恶因子 ”
的肾保护作用机制。
1　材料和方法
1.1　材料:人肾小球系膜细胞株由哈尔滨医科大学附属第
二医院肾内科焦军东教授惠赠;虫草肾茶胶囊由黑龙江中
医药大学药学院制备 , 每粒胶囊重 0.45 g, 相当于生药
2.41 g;发酵冬虫夏草菌粉由江西金水宝制药有限公司提
供 , 其余药材饮片购自黑龙江中医药大学附属第一医院。
福辛普利(蒙诺)规格:10 mg/片 , 由中美上海施贵宝制药
有限公司生产 , 批号:070511。雄性 Wistar大鼠 60只 , 体重
(220±20)g,由吉林大学基础医学院实验动物中心提供。
动物许可证号:SCXK-(吉)2007-0003。 Trizol购自美国
Invitrogen公司;SYBR· ExScript· RT-PCRKit(PerfectReal
Time)、RNAisoReagent、GAPDH引物合成 、TGF-β1引物合
成 、PAI-1引物合成(大连宝生物工程有限公司)。
1.2　方法
1.2.1　制备含药血清:选择健康雄性 Wistar大鼠 60只 ,适
应性喂养 1周后 , 随机分为 6组 ,即正常组 、高糖组 、福辛普
利组 、虫草肾茶低 、中 、高剂量组 , 低 、中 、高剂量组各按
0.243 g·kg-1· d-1 、0.486g· kg-1· d-1、0.972g· kg-1·d-1
灌胃给药 , 福辛普利组按 0.9 mg· kg-1· d-1灌胃给药 , 正
常组给予等体积生理盐水灌胃 , 每日 1次 , 连续给药 7天。
在末次灌胃 2 h后麻醉 , 在无菌条件下经腹主动脉采血 , 取
血清 , 56℃水浴 30min灭活补体 , 经 0.22 μm孔径的针头滤
器过滤除菌 , 分装 -20℃冻存备用。
1.2.2　实验分组及药物处理:实验分 6组 , 正常对照组予
正常大鼠血清的培养液培养干预 ,高糖组予正常大鼠血清
的高糖培养液培养干预 ,虫草肾茶低剂量组予虫草肾茶低
剂量含药血清的高糖培养液培养干预 , 虫草肾茶中剂量组
予虫草肾茶中剂量含药血清的高糖培养液培养干预 , 虫草
肾茶高剂量组予虫草肾茶高剂量含药血清的高糖培养液
培养干预 , 福辛普利组予福辛普利含药血清的高糖培养液
培养干预 , 各组培养液血清浓度均为 10%。
1.2.3　realtime-PCR检测 HMCTGF-β 1mRNA和 PAI-
1mRNA的表达:提取细胞总 RNA后 ,进行总 RNA浓度及纯
度测定及完整性鉴定。通过 htp://www.ncibi.nlm.nih.gov
网站进入 Genbank数据库 ,查找 HumanGAPDHmRNA、Hu-
manTGF-β 1mRNA和 HumanPAI-1mRNA和全基因序
列。根据 HumanGAPDHmRNA、HumanTGF-β
1
mRNA和
HumanPAI-1mRNA全基因序列 , 应用 Premier5.0软件进
行引物设计 , 设计的引物序列如下:
TGF-β
1
:F5′-AGCGACTCGCCAGAGTGGTTA-
3′, R5′-GCAGTGTGTTATCCCTGCTGTCA-3′;PAI-
1:F5′-GACAGGCAGCTCGGATTCAAC-3′, R5′-CCT
GGGCTCAAGCAATCCTC-3′。 GAPDH:F5′-GCA
CCGTCAAGGCTGAGAAC-3′, R5′-TGGTGAAGA
CGCCAGTGGA-3′。
以上引物通过同源性(htp://www.ncibi.nlm.nih.gov/
blast)比较 ,均为特异引物。
cDNA合成按 SYBR· ExScript· RT-PCRKit(Perfect
RealTime)试剂盒反转录反应操作方法进行。
PCR反应采用 SYBRPremixExTaq(PerfectRealTime)
kit试剂 ,在 ABI7300荧光定量 PCR仪上进行 PCR反应。
实验数据用 SPSS13.0统计软件进行统计分析 , 实验结
果以均数 ±标准差(X±s)表示 , 多组间数据比较用单因素
方差分析 (one-wayANOVA), 组间两两比较采用 SNK
(Student-Newman-Keuls)检验 , 以 P<0.05为差异有统
计学意义。
2　结果
2.1　虫草肾茶胶囊对 HMCTGF-β 1mRNA表达的影响:
分别扩增 GAPDH和 TGF-β
1
, 每样本作 2复孔 , 得到两组
Ct平均值。通过 2-■■Ct计算 TGF-β 1相对 mRNA表达水
平。 ■Ct=Ct目的基因 -Ct管家基因 , ■■Ct=■Ct给药
组基因 -■Ct对照组基因。 TGF-β 1mRNA表达差别倍数
以 2-■■Ct表示。 结果显示高糖组 TGF-β 1mRNA和
2-■■Ct值显著高于正常对照组 , 表明高糖组 TGF-
β1mRNA表达上调;与高糖组比较 , 福辛普利组 、虫草肾茶
中剂量组 、虫草肾茶高剂量组 2-ΔΔCt均有所降低 , 表明 TGF
-β 1mRNA表达下调。且以虫草肾茶高剂量组 2-ΔΔCt值减
少最明显。结果见表 1。
2.2　虫草肾茶胶囊对 HMCPAI-1mRNA表达的影响:分
别扩增 GAPDH和 PAI-1, 每样本作 2复孔 , 得到两组 Ct
平均值。通过 2 -■■Ct计算 PAI-1相对 mRNA表达水平。
结果显示高糖组 PAI-1mRNA2-■■Ct值显著高于正常对照
组 ,表明高糖组 PAI-1mRNA表达上调;与高糖组比较 , 虫
草肾茶中剂量组 、虫草肾茶高剂量组 、福辛普利组 2-ΔΔCt均
有所降低 ,表明 PAI-1mRNA表达下调。且以虫草肾茶高
剂量组 2-ΔΔCt值减少最明显。结果见表 2。
3　讨论
TGF-β 是一种多功能的细胞因子 , 在肾脏中以 TGF
-β
1
的含量最为丰富。在 DN患者和实验模型中均发现
肾组织中 TGF-β 1和 TGF-β 1mRNA表达的增高。体外
实验表明:高糖可刺激系膜细胞(MC)分泌 TGF-β 1 [ 3] 。
笔者的研究结果再次证实了在高糖条件下 , TGF-β1表达
增加 ,与既往文献报道相同。 TGF-β
1
可直接刺激 MC合
成 、分泌基质成分 , 增加细胞表面整合素受体的表达 , 促进
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细胞之间及 ECM的黏附;还可通过促进酶抑制物的生成来
减少 ECM的降解。因此 , TGF-β 1的高表达可促进肾脏疾
病的发生发展 ,导致肾小球硬化 , 故采取相应措施抑制 TGF
-β1表达 ,可减缓疾病的发展。
表 1　各组 HMCTGF-β
1
mRNA表达相对值比较(X±s)
组别 n 　CtTGF-β 1 CtGAPDH ΔCt 2-ΔΔCt
正常对照组 3 23.53±0.40 14.71±0.07 8.83±0.33 /
高糖组 3 21.03±0.331) 13.98±0.212) 7.05±0.161) 3.44±0.46
福辛普利组 3 22.43±0.113) 14.35±0.16 8.08±0.203) 1.69±0.216)
虫草肾茶低剂量组 3 21.39±0.22 14.12±0.02 7.27±0.22 2.96±0.24
虫草肾茶中剂量组 3 21.78±0.305) 14.02±0.05 7.76±0.325) 2.10±0.024)
虫草肾茶高剂量组 3 22.67±0.423) 14.36±0.19 8.31±0.283) 1.43±0.104)
　　　　 注:与正常对照组比较 , 1)t=-8.350 4、 -8.406 6, P<0.01;2)t′=-5.712 0, P<0.05;与高糖组比较 , 3)t=6.971 0、 6.965 4、
5.318 1、 6.767 3, P<0.01;4)t′=-5.040 8、 -7.395 6, P<0.05;5)t=2.912 8、3.437 3, P<0.05;6)t=-5.994 2, P<0.01。
表 2　各组 HMCPAI-1mRNA表达相对值比较(X±s)
组别 n CtPAI-1mRNA CtGAPDH ΔCt 2-ΔΔCt
正常对照组 3 22.16±0.26 14.47±0.10 7.68±0.34 /
高糖组 3 20.38±0.281) 14.24±0.092) 6.14±0.361) 2.92±0.11
福辛普利组 3 21.23±0.284) 14.40±0.10 6.84±0.204) 1.81±0.183)
虫草肾茶低剂量组 3 20.38±0.07 14.05±0.07 6.33±0.04 2.59±0.54
虫草肾茶中剂量组 3 20.78±0.45 14.14±0.135) 6.64±0.33 2.06±0.046)
虫草肾茶高剂量组 3 21.21±0.204) 14.31±0.05 6.89±0.244) 1.74±0.233)
　　　　 注:与正常对照组比较 , 1)t=-8.068 7、 -5.386 7, P<0.01;2)t=-2.961 1, P<0.05;与高糖组比较 , 3)t=-9.113 9、 -8.016 5,
P<0.01;4)t=4.111 6、2.944 1、 4.177 9、 3.002 4, P<0.05;5)t=-2.886 3, P<0.05;6)t′=-12.726 2, P<0.01。
　　PAI-1属于丝氨酸蛋白酶抑制剂 , 是一种单链糖蛋
白 , 分子量约 50 kD。体外研究证实 , 肾小球的 3种固有细
胞均能产生 ECM, 其中以 MC最强 ,在高糖状态下 , MCPAI
-1mRNA表达及合成增高 ,减少 ECM分解 ,促进 ECM积
聚 , 导致肾小球硬化的发生。因此 , PA/PAI-1的平衡对维
持 ECM合成与降解十分重要 ,局部凝血 /纤溶平衡障碍参
与 DN的形成和进展。
虫草肾茶胶囊由发酵虫草菌粉 、黄芪 、制大黄 、猫须草
(别名肾茶)、水蛭 、草豆蔻组成。以往的临床研究结果显
示:虫草肾茶胶囊治疗 DN疗效较好 , 能改善患者的一般状
况和相关生化指标 , 保护肾脏功能 ,延缓 DN的进程 [ 4] 。且
对高糖刺激下的系膜细胞增殖有明显的抑制作用 , 并能抑
制高糖刺激下 Col-IV的分泌 [ 5] 。
该研究结果显示 , 正常情况下 HMC可以表达一定水
平的 TGF-β 1mRNA, 这说明在正常条件下 TGF-β 1是细
胞进行生理活动所必需的细胞因子;在高糖条件下 , TGF-
β 1mRNA的表达增加 ,明显高于正常对照组。 虫草肾茶胶
囊及福辛普利药物血清干预后 , 虫草肾茶胶囊高 、中剂量
组及福辛普利组 TGF-β 1mRNA和 PAI-1mRNA表达均
低于高糖组 , 可以显著抑制 HMCTGF-β
1
mRNA的基因表
达 , 且以虫草肾茶胶囊高剂量组表达最低 , 提示虫草肾茶
胶囊可能通过 TGF-β 途径 , 减少 ECM的分泌与合成。
也有研究证实 , 在高糖状态下 , MCPAI-1mRNA表达
及合成增高 [ 6] 。 DN时 TGF-β 表达上调 , 不仅能直接使
ECM分泌增加 , 而且能诱导 PAI-l的产生 ,从而抑制 ECM
的降解 ,导致肾小球硬化的发生。笔者研究也表明:高糖
可以使 TGF-β 1mRNA及 PAI-1mRNA表达明显上调 , 两
者具有相同的趋势。由于 PAI-1mRNA的表达与 PAI-1
蛋白合成的水平是平行的 ,所以 PAI-1mRNA水平的变化
也代表 PAI-1蛋白的合成分泌水平 , 从而增加 ECM积聚 ,
加重肾小球硬化。虫草肾茶胶囊可以下调 PAI-1mRNA
的表达 ,因此虫草肾茶胶囊可能还通过干预 PA/PAI-1纤
溶酶系统参与 ECM的降解 ,延缓 DN的进展。
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(收稿日期:2011-03-04)
本文编辑:王存明
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