全 文 ：·研究报告·
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2012年第2期
收稿日期 : 2011-10-22
基金项目 : 国家自然科学基金项目（30770106）, 国家自然科学基金重大研究计划面上项目（90608024）, 广东省自然科学基金项目（06025162）,
暨南大学科研培育与创新基金青年基金项目（11611711）
作者简介 : 胡嘉淼 , 男 , 博士研究生 , 研究方向 : 病毒蛋白分子功能 ;E-mail:hjm841203@tom.com
通讯作者 : 李弘剑 , 女 , 教授 , 博士生导师 , 研究方向 : 病毒蛋白分子功能 ;E-mail:tlihj@jnu.edu.cn
基于 Red 重组系统构建含 Flag 标签标记 UL23
基因的重组人巨细胞病毒
胡嘉淼 肖静 刘明亮 曾宝娟 李婧惠 李继东 周天鸿 冉艳红 李弘剑
（暨南大学生命科学技术学院 生物工程学系 , 广州 510632）
摘 要 : 利用来源于 λ 噬菌体的 Red 系统，将 Flag 标签及两侧带有 FRT 位点的卡那霉素抗性基因片段插入原 HCMV Towne
BAC 中 UL23 基因 3 末端区域，通过卡那抗性筛选带有抗性标记的重组菌株，并通过表达重组酶 FLP 的质粒 pCP20 去除卡那霉素
抗性基因，得到带有 Flag 标签标记 UL23 基因和单一 FRT 位点的突变 BAC。重组后的 BAC 分子同质粒 pcDNA3.1（+）-pUL82 共
转染 HFF 细胞后重建重组 HCMV。Western blotting 检测证实所构建重组病毒能够表达含 Flag 标签标记的 pUL23 蛋白。此含有 Flag
标签标记 UL23 基因的重组 HCMV 的成功构建为了进一步研究人巨细胞病毒 UL23 基因及其产物的功能提供依据。
关键词 : UL23 人巨细胞病毒 Red 同源重组 pKD46 pCP20
Construction of Recombinant HCMV with Flag Tagged UL23
Gene via Red-mediated Recombination System
Hu Jiaomiao Xiao Jing Liu Mingliang Zeng Baojuan Li Jinghui Li Jidong
Zhou Tianhong Ran Yanhong Li Hongjian
（College of Life Science and Technology, Jinan University, Guangzhou 510632）
Abstract: The DNA fragment of Flag tag and kanamycin-resistant gene flanked with FRT sites was inserted into 3 end of UL23 gene
of HCMV Towne BAC via Red-mediated recombinant system. The positive clones were identified by kanamycin-selection in the first round of
recombination and the kanamycin-resistant gene was deleted with the plasmid pCP20 which can express the FLP in the second round. This
recombinant BAC was co-transfected with plasmid pcDNA3.1（+）-pUL82 into HFF cell to produce recombinant HCMV. The pUL23 fusion
protein was expressed correctly and confirmed by Western blotting, indicating that the recombinant HCMV expressing Flag-tagged-pUL23 has
been established, which may provide a powerful tool for the functional research of UL23 gene.
Key words: UL23 HCMV Red-mediated recombination pKD46 pCP20
人巨细胞病毒（human cytomegalovirus，HCMV）
属于 β 疱疹病毒亚科［1］，基因组大小约为 235 kb，
是已知的疱疹病毒科中基因组最大的病毒。通过对
HCMV 基因组序列分析，目前已发现 HCMV 至少具
有 252 个 开 放 阅 读 框（open reading frame，ORF），
其中 105 个 ORF 是编码框，但大多数产物的功能
都还不是很清楚［2］。HCMV 在人群中广泛感染，在
发展中国家感染率几乎达到 100%［3］。该感染通常
呈现潜伏感染，对于健康个体并无临床症状，但对
免疫力低下个体，如器官移植患者，AIDS 患者及
新生儿，HCMV 可以导致严重的疾病［4,5］。因此阐
明 HCMV 的分子生物学机制对于了解 HCMV 感染致
病及其与宿主之间的关系具有重要的意义。为研究
病毒基因功能，对特定基因进行修饰或标记构建突
变病毒株是一种重要的手段，但是由于 HCMV 基因
组巨大的特点，传统的基于限制性内切酶的传统分
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第2期98
子克隆技术很难对其进行改造。近年来，随着含有
HCMV 基因组的细菌人工染色体（bacterial artificial
chromosome，BAC） 的 成 功 构 建［6］ 和 基 于 λ 噬 菌
体 Red 操纵子的同源重组技术的广泛应用［7］，对
HCMV 单个基因进行表达分析已成为了解其体内功
能的重要手段之一并发展到了一个新的阶段。
HCMV UL23 基因属于 HCMV US22 基因家族，
该家族成员含有至少一个四个氨基酸序列的保守
motif，但目前对 US22 基因家族成员了解的并不多。
已知 HCMV UL23 基因能够编码一个大小为 33 kD
的病毒皮层蛋白 pUL23，并且缺失 UL23 基因的人
巨细胞病毒 Towne 株在人包皮成纤维细胞（human
foreskin fibroblast cells，HFF cells）中繁殖速度加快
约 10 倍［8］。这种病毒自身蛋白抑制病毒生长的现象
提示人们 UL23 基因及其产物可能在 HCMV 的生活
周期中发挥了重要的调节作用。本试验通过 Red 重
组技术，成功构建含有 Flag 标签标记 UL23 基因的
HCMV Towne 病毒株，为进一步研究 UL23 基因及其
产物调控病毒生长的机理提供线索和依据。
1 材料与方法
1.1 材料
含 HCMV Towne 株全基因组序列的 Towne-BAC
质粒由美国加州大学 Berkeley 分校 Liu 惠赠 , 其中
含有氯霉素抗性基因（Cmr） 和绿色荧光蛋白基因
（GFP）, 质粒 pKD46（表达受阿拉伯糖启动子调控
的 exo、bet 和 gam 基 因 , Ampr）、 质 粒 pCP20（ 编
码能够识别 FRT 位点的 FLP 重组酶 , Ampr）均由
美 国 耶 鲁 大 学 Coli Genetic Stock Center 惠 赠、 质
粒 pcDNA3.1（+）-UL82 由本实验室构建［9］、质粒
pGBKT7 购自 Clontch 公司。
Primestar HS Polyerase, dNTPs, 限 制 性 内 切 酶
Bgl II、Pst I、Nco I、Xho I 购自大连宝生物有限公司，
Flag-tag 鼠单克隆抗体购自 Proteintech 公司，HCMV
gB 鼠单克隆抗体购自 Santa Cruz Biotechnology，MN
NucleoBond® BAC 100 试剂盒购自 MACHEREYNAG-
EL 公司，HFF 细胞为本实验室保存。本研究所用引
物位置如图 1 所示 , 序列见表 1。
图 1 Red 同源重组及结果鉴定所用引物示意图
引物 序列（5-3）
BglII-Kana-F GAAGATCTCAGGGTGGGCGAAGAACTCC
PstI-Kana-R AACTGCAGTCAGGTGGCACTTTTCGGG
NcoI-HM1-FRT-BglII-F CATGGTCCGTGGGAGACGCGGGTGAAGTTCCTATTCTCTAGAAAGTATAGGAACTTCA
NcoI-HM1-FRT-BglII-R GATCTGAAGTTCCTATACTTTCTAGAGAATAGGAACTTCACCCGCGTCTCCCACGGAC
PstI-FRT-Flag-XhoI-F GAAGTTCCTATTCTCTAGAAAGTATAGGAACTTCTCACTTGTCATCGTCATCCTTGTAATC
PstI-FRT-Flag-XhoI-R TCGAGATTACAAGGATGACGATGACAAGTGAGAAGTTCCTATACTTTCTAGAGAATAGGAACTTCTGCA
HM1-F TTTACAGGAACGGGGAAAAAAAAGGCACACGGTCCGTGGGAGACGCGGG
HM2-Flag-R ATAAGCCTACCTGTCCTTACGGAGTGGACCACCAACTTTTTGACGACGCGGATTACAAGGATGACGATGACAAGTGA
UL23-Out-F TCCCAAGGGTTAAAGACCATGTTGAC
UL23-Out-R GCCCGTCGACCTTATCCCCATC
表 1 PCR 所用引物序列
1.2 方法
1.2.1 Red 重组所用线性化 DNA 片段的制备 首先
使用引物 Bgl II-Kana-F 及 Pst I-Kana-R 扩增 pGBKT7
上卡那霉素抗性基因片段，PCR 产物经 Bgl II 和 Pst
I 双酶切处理后，同使用引物 Nco I-HM1-FRT-Bgl
II-F 及 Nco I-HM1-FRT-Bgl II-R 退火形成的 DNA 片
2012年第2期 99胡嘉淼等 ：基于 Red 重组系统构建含 Flag 标签标记 UL23 基因的重组人巨细胞病毒
段 及 使 用 引 物 Pst I-FRT-Flag-Xho I-F 及 Pst I-FRT-
Flag-Xho I-R 退 火 形 成 的 DNA 片 段 一 同 插 入 载 体
pGBKT7 的 Nco I/Sal I 位点，获得打靶载体 pGBKT7-
FRT-Kana-FRT-Flag。再次使用引物 HM1 及 HM2-Flag
扩增此重组质粒，获得 Red 重组用线性片段，该
DNA 片段经琼脂糖凝胶电泳分离回收并使用 Dpn I
消化后，可用于后续转化试验。
1.2.2 Red 重组系统的诱导和电击转化感受态细胞
的制备 首先将质粒 pKD46 使用 CaCl2 法导入含有
Towne-BAC 的 DH10b 菌株中，鉴定正确后，挑取单
菌落，30℃培养至 OD600 为 0.1-0.2，加入 L-阿拉伯
糖至终浓度 0.1%（W/V），继续 30℃条件下培养 1 h
后，将菌液 4℃，12 000 r/min 离心收集菌体后，用
预冷的 10% 的甘油洗 3 次，最后将菌体重悬于 1/100
（V/V）的预冷的 10% 甘油中，制得用于电击转化的
感受态细胞。
1.2.3 电 击 转 化 取 纯 化 的 PCR 片 段 0.2 μg 同
20 μL 的 电 击 转 化 感 受 态 细 胞 混 匀， 转 至 预 冷 的
0.1 cm 电击杯中，在条件电压 1.25 kV、电阻 200 Ω、
电容 25 μF 下电击 5 ms。电击后加入 1 mL SOB 培养
基，37℃培养 1 h 后，涂布于含氯霉素及卡那霉素
的 LB 固体平板上。37℃培养 30-48 h，获得阳性转
化子后进行菌落 PCR 检测，获得正确的重组菌株，
命名为 HCMV-Towne-UL23-Flag-Kana-BAC。
1.2.4 卡那霉素抗性基因的去除 将编码重组蛋白
FLP 的温敏质粒 pCP20 使用 CaCl2 法导入鉴定正确
的 重 组 菌 株 HCMV-Towne-UL23-Flag-Kana-BAC 中，
涂布于含氨苄青霉素的 LB 固体平板上。30℃培养
30-48 h，获得阳性转化子后挑取至含氯霉素抗性的
LB 液体培养基中，42℃培养 16 h 以消除 pCP20 质粒，
鉴定所获菌株氨苄青霉素抗性及卡那霉素抗性，将
只含有氯霉素抗性、无氨苄青霉素抗性及卡那霉素
抗性的菌株进行菌落 PCR 检测，获得去除卡那霉素
抗性的重组菌株，命名为 HCMV-Towne-UL23-Flag-
BAC。
1.2.5 重组病毒的重建 根据 MN NucleoBond® BAC
100 说明书提供方法提取构建成功的重组 BAC 质
粒。将所得 0.5 μg 重组 BAC 质粒同 1 μg pcDNA3.1
（+）-UL82 按照朱峰所述方法［9］共电转 HFF 细胞 ,
电转条件 ：电压 260 V、电阻 75 Ω、电容 975 μF、
电转时间 25-30 ms。电转后立即补加预冷 DMEM 培
养基，并将电转细胞重悬于培养基中，于 37℃、5%
CO2 培养，直至细胞病变，收集重组病毒 HCMV-
Towne-UL23-Flag。
1.2.6 Western blotting 鉴定 Flag 标签标记的 pUL23
蛋白的表达 将重建成功的 HCMV-Towne-UL23-Flag
病毒感染 HFF 细胞（MOI=3），24 h 后收集 HFF 细
胞并用 RIPA 裂解后裂解物加入 1/2 体积 2×SDS 上
样缓冲液，沸水加热 5 min，进行 12% SDS-PAGE 凝
胶电泳。并使用 Anti-Flag 及 Anti-gB 鼠单克隆抗体
进行 Western blotting 检测。
2 结果
2.1 带有同源臂的FRT-Kana-FRT-Flag片段的扩增
结果
两侧含有 FRT 序列的卡那霉素基因同 Flag 标
签在 pGBKT7 载体上连接后，使用引物对 HM1 及
HM2-Flag-R 进行 PCR，扩增目的片段，PCR 产物经
琼脂糖凝胶电泳分析，确定符合理论目标大小 1.3 kb
（图 2），证明打靶载体构建成功。该片段纯化后可
用于后续试验。
1.DL5000 DNA Marker ；2.pGBKT7 作为模板 ；3.pGBKT7-FRT-
Kana-FRT-Flag 作为模板
图 2 用于同源重组的线形 DNA 片段的 PCR 鉴定
2.2 线性DNA片段转化及Red重组
Red 重组完成后，从含有氯霉素及卡那霉素
的 LB 固体平板上，随机挑取阳性克隆使用引物对
23-Out-F 及 23-Out-R 进行菌落 PCR 鉴定，结果（图 3）
显示，与 Towne-BAC 对照组相比，原先 1.6 kb DNA
条带被一条加入 Flag 标签及卡那霉素抗性基因基因
的 2.9 kb DNA 条带所取代，与理论值相符。表明经
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第2期100
过 Red 重组，原 UL23 基因 3 端插入了一个可供识
别的 Flag 标签，同时引入了两端含有 FRT 位点，能
被 pCP20 质粒所表达 FLP 酶所特异性识别并切除的
卡那霉素抗性基因。
2.3 利用FRT/FLP重组系统切除引入的筛选标记卡
那霉素抗性基因
转 入 pCP20 质 粒 后， 用 引 物 对 23-Out-F 及
23-Out-R 进行菌落 PCR 扩增验证，可见其两端含
有 FRT 位点的卡那霉素抗性基因已丢失，PCR 产
物大小由原先的 2.9 kb 变回约 1.6 kb（图 4），进一
步测序证实，原氯霉素抗性基因已被切除，仅剩
34 bp“疤痕”序列。
2.4 重组病毒的重建
重组 BAC 与 pcDNA3.1（+）-UL82 共转染 HFF
细 胞 10 d 后， 可 见 部 分 细 胞 出 现 明 显 病 变 现 象
（CPE）。同时表达其整合的绿色荧光蛋白基因（图 5），
证明重组病毒构建成功。
1.DL5000 DNA Marker ；2. 以 HCMV-Towne-BAC 为模板 ；
3. 以 HCMV-Towne-UL23-Flag-Kana-Bac 为模板
图 3 重组 BAC HCMV-Towne-UL23-Flag-Kan 的
PCR 鉴定
1.DL5000 DNA Marker ；2. 以 HCMV-Towne-Ul23-Flag-BAC 为模板 ；
3. 以 HCMV-Towne-BAC 为模板
图 4 重组 BAC 切除卡那霉素抗性基因的
PCR 鉴定
A,B. 正常的 HFF 细胞 ； C,D. 感染 HCMV-Towne-UL23-Flag 的 HFF 细胞
图 5 重组 HCMV 感染 HFF 细胞及引起的细胞病变
2.5 Western blotting检测重组病毒中pUL23在HFF
细胞中的表达
使 用 重 组 病 毒 HCMV-Towne-UL23-Flag 感 染
HFF 后（MOI=3），24 h 后 收 集 细 胞 总 蛋 白， 使 用
Anti-Flag 抗体检测，可见 35 kD 处出现目的条带，
对照未感染 HCMV 病毒及感染未重组的 Towne 株病
毒 HFF 细胞组，说明重组病毒构建成功，并能正常
表达含有 Flag 标签标记的 pUL23 蛋白（图 6）。
1. 未感染 HCMV 病毒的 HFF 细胞组裂解液 ；2. 感染未重组的 Towne 株病毒
HFF 细胞裂解液 ；3. 重组病毒 Towne-UL23-Flag 感染 HFF 细胞裂解液
图 6 Western blotting 检测重组病毒 pUL23-Flag
蛋白的表达
2012年第2期 101胡嘉淼等 ：基于 Red 重组系统构建含 Flag 标签标记 UL23 基因的重组人巨细胞病毒
3 讨论
FLP/FRT 位点特异性重组系统可切除两个同向
FRT 位点中序列从而有效地去除插入用于筛选的抗
性基因，减少外源序列对原 BAC 分子的影响。前
人的工作中，通常采用 PCR 法从 pKD13 等质粒上
获得两端含有 FRT 位点的抗性基因标签［10］，但由
于 FRT 位点具有反向互补的特性，引物需设计在
FRT 位点两侧，因此实际引入的外源序列通常达
到 60-80 bp。本试验通过合成的寡聚核苷酸退火
形成抗性基因两侧的 FRT 位点，可以做到无缝连
接目标片段。除所需的 Flag 标签外，对原 HCMV
基因组只引入 34 bp 外源序列，有效地减少了外
源序列对于病毒基因调控方面的影响。目前对于
UL23 基因功能的了解尚不十分清楚，2001 年 Liu 实
验室报道其具有抑制病毒在 HFF 中的生长后，曾涛
等［11］通过酵母双杂交等试验，确定与 pUL23 发生
相互作用的若干宿主蛋白及病毒自身编码蛋白，如
ATP 酶抑制因子 1（ATIF1），真核翻译起始因子 3
（eIF3e）［12］，热休克蛋白 40 同源物（DNAJB6）［13］，
HCMV 皮层蛋白 pUL24［14］等。提示 pUL23 可能在
病毒生长过程中的诸多环节均发挥了重要的调节作
用，并可能参与了病毒衣壳及皮层蛋白的装配。
本试验通过 Red 重组技术成功构建含有 Flag
标签标记 UL23 基因的重组人巨细胞病毒 , 为进一
步研究 pUL23 的功能提供了一个有力的工具。一
方 面， 可 以 通 过 Western blotting 和 间 接 免 疫 荧 光
等手段，探究 UL23 基因的表达时相及 pUL23 蛋白
的细胞定位，从而对于理解 pUL23 可能发挥的生
物学功能提供有益的线索。同时，可以方便地通
过 Anti-Flag 抗体在病毒生长过程的各个阶段，Co-
immunoprecipitation 等试验，验证上述蛋白质相互作
用或寻找新的与 pUL23 发生相互作用的蛋白，为揭
示 pUL23 所发挥的功能提供更加有力的证据。
参 考 文 献
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（责任编辑 李楠）