全 文 ：研究报告
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2010年第 11期
大肠杆菌 ptsHIcrr基因的敲除及其
对苯丙氨酸生产的影响
张怀 于立涛
(北京科技大学应用科学学院生物科学与技术系,北京 100083 )
摘 要: L苯丙氨酸 ( Lpheny la lanine)是重要的食品和医药中间体。利用大肠杆菌发酵葡萄糖生产苯丙氨酸时, 对葡萄
糖转运起重要作用的磷酸烯醇丙酮酸糖磷酸转移酶系统 ( PTS)对苯丙氨酸产量有很大影响。由 ptsH Icrr操纵子编码的磷酸
组氨酸载体蛋白 (H Pr), 酶 I( E I)和酶 IIAG lc是 PTS的必要组分,通过敲除 ptsH Ic rr得到 PTS缺陷菌株, 可以使葡萄糖代谢更
多地流向苯丙氨酸生物合成。采用 Red同源重组技术将大肠杆菌染色体上的 p tsH Ic rr基因替换为四环素抗性基因,得到 PTS
缺陷菌株。该菌株在以葡萄糖为惟一碳源的培养基中摇瓶培养, 菌密度为对照菌株的 27倍, 苯丙氨酸产量为对照菌株的
6 3倍。
关键词: ptsH Icrr基因 基因敲除 磷酸烯醇丙酮酸糖磷酸转移酶系统 L苯丙氨酸 Red同源重组
Knockout of ptsG Gene ofEscherichia coli w3110 and
Its Impact on Production of Phenylalanine
ZhangH ua i Yu L itao
(D epartm ent of Biological Science and T echnology, School of App lied Science,
University of Science and T echno logy Beijing, Beijing 100083)
Abstrac:t Lpheny la lan ine is an importan t in term ed ia te in food and pharm aceu tica l industry. The ferm entivem ethod is often used
in Lpheny la lanine production. In E scherichia coli, phosphoeno lpyruvate suga r pho spho transferase system ( PTS) wh ich is important in
g lucose uptake has a g reat negative impact on pheny lalan ine production. In PTS, the enzym e I, enzyme IIAGlc and pho sphoh istid ine ca r
rier prote in( HP r) we re essen tia l components. They we re a ll encoded by genes ptsH Icrr. In the PTS defec tive stra in wh ich can be ob
ta ined by knock ing ou t genes ptsH Icrr, the flow of g luco sem etabo lism is changed to synthesis mo re va luab lem etabo lism products such
as pheny la lan ine. The Red hom o logous recom bina tion techno logy w as used to produce PTS de fective stra in. W ith th ism e thod, genes pt
sH Icrr in E. coliw3110 chromosom ew as replaced by tetracycline res istance gene. W hen g luco sew as used as the sole carbon source in
the culturem edium, the b iom ass of PTS de fective stra in w as 27 tim es of parent stra in. W hen the sta in w as used to produce Lphenyla la
n ine, the output of Lpheny la lanine is 6 3 tim es of parent stra in.
Key words: ptsH Icrr genes Gene knockout Phosphoeno lpyruvate sugar phosphotransferase system Lpheny lalanine Red
hom o logous recomb ination
收稿日期: 20100428
作者简介:张怀,男,讲师,工学博士,主要从事生物化工方面研究; Em ai:l huai_ zhang@ s ina. com
L苯丙氨酸 ( Lpheny la lan ine )作为人体必需的
8种氨基酸之一, 是氨基酸输液和氨基酸饮膳所必
须的成分,同时也是一种重要的食品和医药中间体,
目前合成甜味剂阿斯巴甜是其主要用途 [ 1]。以基
因工程大肠杆菌直接发酵葡萄糖生成苯丙氨酸为苯
丙氨酸的主要生产方法之一 [ 2]。
大肠杆菌中, 葡萄糖可以通过一系列反应生成
苯丙氨酸,而磷酸烯醇丙酮酸 ( PEP)是苯丙氨酸生
物合成的必要前体之一,但 PEP极易经磷酸烯醇丙
酮酸糖磷酸转移酶系统 ( PTS)生成丙酮酸, 直接影
响苯丙氨酸等芳香族氨基酸合成的代谢流量 [ 3]。
因此,抑制 PTS对 PEP的消耗成为增加苯丙氨酸产
生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 11期
量的方法之一。
PTS是大肠杆菌最重要的葡萄糖转运系统, 由
ptsH Icrr操纵子编码的磷酸组氨酸载体蛋白
(HPr), 酶 I( E I)和酶 IIAG lc是 PTS的必需组成部
分 [ 4]。PEP释放磷酸基团生成丙酮酸 ( PYR ) , 磷酸
基团经酶 I( E I)、HPr和酶 IIAG lc传递至酶 IICBG lc,酶
IICB
G lc将胞外的葡萄糖转运至细胞质中, 同时将葡
萄糖磷酸化生成葡萄糖6磷酸,从而进入糖酵解和
戊糖磷酸途径, 这个过程会消耗大量 PEP。除 PTS
外,葡萄糖还可通过半乳糖苷透性酶 ( Ga lP )以较低
速率转运进入细胞, 在葡萄糖激酶 ( G lucok inase)的
作用下消耗 ATP生成葡萄糖 6磷酸。
敲除 ptsH Icrr基因, 可以使 PTS被破坏, 彻底
阻断 PTS对 PEP的消耗,此种菌株葡萄糖转运能力
较差, 称为 PTS- G lc-菌株 [ 5]。通过大量表达半乳
糖苷透性酶和葡萄糖激酶可使葡萄糖转运能力得到
修复, 即得到 PTS- G lc+菌株 [ 6] ,这样既保证了葡萄
糖转运能力,又能增加 PEP在苯丙氨酸合成等代谢
途径中的流量。另一方面, 由于 PTS转运葡萄糖速
率过快会产生大量丙酮酸, 使得细胞碳代谢速率不
平衡, 导致乙酸等不利于菌体生长的物质大量积
累, 抑制菌体生长。 PTS缺陷菌株葡萄糖吸收速
率较慢, 可减少乙酸积累, 使菌体生长代谢更加
平衡和有效率, 菌体生长状况更好, 发酵产物积
累更多 [ 7]。
PTS缺陷菌株的研究在国外已取得一定进展,
但国内还没有报道。BezV iveros等 [ 8 ]用 PTS缺陷
菌株生产 L苯丙氨酸, 从葡萄糖到苯丙氨酸的转化
率达到了 033 g /g,为理论最大值的 60% ,比非 PTS
缺陷菌株提高了 57%。本研究旨在采用 R ed同源
重组技术敲除大肠杆菌 ptsH Icrr基因,获得 PTS缺
陷菌株,并考察缺陷菌株生长特性及对苯丙氨酸生
产的影响。
Red同源重组技术的原理是将一段含标记基因
的 PCR片段导入宿主菌细胞, 该 PCR片段两端分
别携带着与靶基因两翼同源的序列。在 噬菌体
Red重组酶 ( Exo、Beta和 Gam 3种蛋白 )的作用下,
线性标记基因 DNA片段与宿主细胞染色体上的特
定靶序列发生同源重组, 靶基因被标记基因置换下
来,达到敲除基因的目的 [ 9]。
1 材料与方法
11 材料
111 菌株与质粒 E scherichia coli w3110、DH5;
质粒 pKD46(含 噬菌体 R ed重组酶, 阿拉伯糖诱
导表达 ), 质粒 pACYC184(含四环素抗性基因 ), 质
粒 pGG(含葡萄糖激酶和半乳糖苷透性酶基因, 可
通过消耗 ATP来完成葡萄糖的跨膜转运及磷酸
化 ) ,质粒 pEK22(含有苯丙氨酸的代谢途径关键酶
基因 )。其中 pKD46为军事医学科学院生物工程研
究所王恒樑赠送, 其它菌株与质粒均由本实验室
保存。
112 PCR引物设计 扩增四环素抗性基因的引
物 FPH、RPH分别由两部分组成,靠近 5 端未加下
划线的序列与 ptsH Icrr基因两翼序列同源,靠近 3
端加下划线的序列与质粒 pACYC184上四环素抗性
基因两侧序列互补。
FPH: 5 CACTTCTGAAATTACTGTGACTTCCAA
CGGCAAAAGCGCCAGCGCGAAGTCAGCCCCATAC
GAT3
RPH: 5 GATCTCAATAGTTCCGGTATCCTTCTT
GTCGTCGGAAACCAGAGATTTCTTGGAGTGGTGAA
TCCGT3
在大肠杆菌染色体上 ptsH Icrr基因同源重组
区域外侧, 设计鉴定引物 H IF、H IR: H IF: 5 CCT
GCTGCCCAGTTTGTA3 , H IR: 5 AATGCGTGGTTG
GTTTCA3 。引物由上海生工生物工程技术服务有
限公司合成。
113 主要试剂 Taq DNA聚合酶、Pfu DNA聚合
酶、UN IQ 10柱式通用 DNA纯化试剂盒购自上海生
工生物工程技术服务有限公司, 限制性内切酶 E coR
!购自宝生物工程 (大连 )有限公司, 其它为市售分
析纯化学试剂。
114 培养基 2 ∀YT培养基: 16 g /L胰蛋白胨,
10 g /L酵母提取物, 5 g /L NaC,l pH70; MG培养基:
葡萄糖 5 g /L、氯化钠 4 g /L、硫酸铵 3 g /L、磷酸二氢
钾 2 g /L、磷酸氢二钾 15 g /L、硫酸镁 05 g /L、柠檬
酸钠 02 g /L、氯化钙 100 mg /L、酪氨酸 100 mg /L、
硫胺素 100mg /L、硫酸亚铁 5mg /L、硫酸锰 3mg /L、
硫酸锌 2mg /L、钼酸钠 1mg /L、氯化钴 01 mg /L、硼
酸 02 mg /L、氯化铜 01mg /L、pH70。
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2010年第 11期 张怀等:大肠杆菌 ptsH Icrr基因的敲除及其对苯丙氨酸生产的影响
12 方法
121 打靶 PCR片段制备 将质粒 pACYC184经
E coR !酶切线性化作为模板, FPH、RPH为引物,用
Pfu DNA聚合酶进行 PCR扩增, 反应条件: 94# 预
变性 5 m in后扩增 30个循环 ( 94# 变性 30 s, 54#
退火 30 s, 72# 延伸 2 m in 30 s)。 PCR产物经
UN IQ10柱式 DNA回收试剂盒切胶回收纯化后溶
于无菌超纯水。
122 电转化 将 E. coli w3110(含质粒 pKD46)
接种于含氨苄青霉素的 2 ∀ YT培养基中 30# 培养
过夜, 然后以 1%比例接种于 100mL 2 ∀YT培养基
(含 50mg /mL氨苄青霉素 )中, 30# 200 r/m in培养
至 OD 600为 02左右,加入 L阿拉伯糖至 10 mmo l /L
诱导 1 h,冰上预冷 10 m in后 4# 10 000 r/m in离心
2 m in收集菌体,用冰冷无菌超纯水 100mL重悬离
心洗涤 2次, 最后用 1 mL无菌水重悬得感受态细
胞。取上述 PCR产物约 400 ng与 100 L感受态细
胞混匀后加入电击杯进行电击, 电击条件为电压
2 000 V、电阻 200 !、电容 25 F; 电击后立即加入
1 mL 2 ∀YT培养基, 37# 200 r /m in振荡培养 1 h,
取 150 L 涂布于含有四环素的 2 ∀ YT 平板上,
37# 培养过夜。
123 敲除菌株的鉴定与筛选 从四环素平板上
随机挑取长出菌落以引物 H IF、H IR进行菌落 PCR
鉴定。质粒 pKD46的复制子具有温度敏感性, 培养
温度高于 37# 则不能复制而丢失, 将鉴定正确的重
组菌株接种于 2 ∀ YT培养基中, 39# 培养过夜后,
在 37# 条件下划线分离培养。质粒 pKD46为氨苄
青霉素抗性,对划线得到的单菌落分别进行氨苄青
霉素和四环素的抗性检测, 筛选对氨苄青霉素敏感
而对四环素具有抗性的克隆, 即得到 pKD46消除的
敲除菌株,此菌株葡萄糖吸收能力极差, 称为 PTS-
G lc
-菌株。将表达半乳糖苷透性酶和葡萄糖激酶
的质粒 pGG转化敲除菌株使其葡萄糖吸收能力得
到修复,得到 PTS- G lc+菌株。
124 敲除菌株生长特性测定 分别将 E. coli
w3110 PTS
-
G lc
+、E. coli w3110 PTS- G lc+与对照菌
株 E. coli w3110接种于 2 ∀YT培养基与 MG培养基
(以葡萄糖为惟一碳源 )中, 37# 200 r/m in振荡培
养,定时测定菌密度、残糖浓度和 pH值。
125 敲除菌株对苯丙氨酸生产的影响 将表达
L苯丙氨酸代谢途径关键酶基因的质粒 pEK22分
别转化 E. co li w3110 PTS- G lc+与对照菌株 E. coli
w3110,在 MG培养基中诱导培养,定时测定菌体密
度和苯丙氨酸含量。
126 分析方法 葡萄糖采用 3, 5二硝基水杨酸
比色法 ( DNS法 )测定 [ 10 ] ; 苯丙氨酸含量采用高效
液相色谱测定: 岛津 LC10AT高效液相色谱, SPD
10A紫外检测器, D iamonsil 5 m C18色谱柱 ( 250 ∀
46 mm)柱, 流动相为甲醇 25 mmo l /L NaH 2 PO4水
溶液 ( pH 30, 25∃75, V /V ), 流速 1 mL /m in, 检测波
长 205 nm。
2 结果与讨论
21 打靶 PCR片段制备
将质粒 pACYC184线性化后为模板, 可减少敲
除菌株筛选过程假阳性。以 FPH、RPH为引物, 线
性化 pACYC184为模板扩增出的 PCR片段两端与
ptsH Icrr基因上下游序列同源, 中间为四环素抗性
基因, PCR产物电泳如图 1所示, PCR片段长度约
1 400 bp,与理论值1 442 bp相符。
1. 四环素抗性基因 PCR产物; 2. E coT14 ! d igest
DNA M arker
图 1 四环素抗性基因的 PCR扩增
22 敲除菌株的鉴定
从四环素抗性平板上随机即挑取 4个菌落作为
模板,以 H IF、H IR为引物, 进行 PCR鉴定,结果如图
2所示。敲除前菌株的 PCR片段含 ptsH Icrr基因,
其大小为 2 252 bp; 敲除菌株的 PCR片段含四环素
抗性基因,大小为 1 641 bp。从图 2中可看出, PCR
鉴定的产物与预期大小相符, 表明重组菌株染色体
上 ptsH Icrr基因已被四环素抗性基因取代, ptsH I
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生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 11期
crr操纵子敲除成功, 得到 PTS缺陷菌株 E. coli
w3110 PTS
-
G lc
-。
23 PTS缺陷菌株的生长特性
231 PTS缺陷菌株在 2 ∀YT培养基中的生长
在不含葡萄糖的复合碳源培养基 ( 2 ∀YT培养基 )中,
PTS缺陷菌株的生长速度稍慢于对照菌株,结果如图
3所示,缺陷菌株达到的最终菌密度仅稍低于对照菌
株, PTS只对葡萄糖转运起作用, PTS- G lc+菌株 (含
有表达半乳糖苷透性酶和葡萄糖激酶的质粒 pGG)与
PTS
-
G lc
-菌株在 2 ∀YT培养基中的生长能力并未受
到很大影响,对其它物质仍可正常代谢。
M 1. E coT14! d igest DNA M arker; 1- 4.敲除菌株 PCR产
物; P1, P2.对照菌株 PCR产物; M2. DL 2000DNA Marker
图 2 ptsHIcrr敲除菌株的 PCR鉴定
% .对照菌株; & . E. coli w3110 PTS- G lc- ;
∋ . E. coli w 3110 PTS- G lc+
图 3 大肠杆菌 PTS缺陷菌株在 2 ∀ YT
培养基中的生长曲线
232 PTS缺陷菌株在 MG培养基中的生长 PTS
缺陷菌株在以葡萄糖为惟一碳源的 MG培养基中的
生长曲线如图 4所示, 培养过程中葡萄糖浓度变化
如图 5所示, pH值变化如图 6所示。从图 5中可看
出, E. coli w3110 PTS- G lc-菌株葡萄糖吸收能力极
弱,生长速度缓慢, 敲除 PTS使菌体几乎完全失去葡
萄糖吸收能力,所以 PTS- G lc-菌株生长能力极差,生
长量很少 (图 4), pH值几乎没有下降 (图 6)。E. coli
w3110 PTS
-
G lc
+菌株吸收利用葡萄糖的能力较强,
虽然初始阶段生长速度慢于对照菌株,但持续生长时
间更长,最终菌密度也更高,大约为对照菌株的 27倍。
% . 对照菌株; & . E. coli w 3110 PTS- G lc- ;
∋ . E. coli w 3110 PTS- G lc+
图 4 大肠杆菌 PTS缺陷菌株在
MG培养基中的生长曲线
% .对照菌株; & . E. coli w 3110 PTS- G lc- ;
∋ . E. coli w3110 PTS- G lc+
图 5 大肠杆菌 p tsG基因缺陷株在MG培养基中
的葡萄糖利用情况
% . 对照菌株; & . E. coli w3110 PTS- G lc- ;
∋ . E. coli w3110 PTS- G lc+
图 6 大肠杆菌 PTS缺陷菌株生长过程中的 pH变化曲线
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2010年第 11期 张怀等:大肠杆菌 ptsH Icrr基因的敲除及其对苯丙氨酸生产的影响
PTS
-
G lc
+菌株含有表达半乳糖苷透性酶和葡
萄糖激酶的质粒 pGG, pGG表达的葡萄糖激酶和半
乳糖苷透性酶能够修复葡萄糖转运能力, 葡萄糖被
半乳糖苷透性酶以较小的速率吸收通过细胞膜,然
后被葡萄糖激酶磷酸化进入代谢途径, 同时消耗一
分子 ATP[ 11] ,此路径转运葡萄糖效率与 PTS相比较
低,所以 PTS- G lc+菌株在生长初期生长速率低于
对照菌株。但由于 PTS- G lc+菌株葡萄糖吸收速率
较小, 使丙酮酸积累减弱, 其代谢产乙酸速率大为降
低, pH下降速度明显减缓,有利于菌体的持续生长,
所以 PTS- G lc+菌株能够达到远高于对照菌株的最
终菌密度,对葡萄糖的最终吸收量也达到和对照菌
株相当的水平,其碳代谢更加平衡高效,更适合高密
度发酵培养。培养基中 pH 值对菌体生长影响很
大,当 pH值降低到 5以下后菌体生长基本停止。
24 PTS缺陷菌株对苯丙氨酸生产的影响
将表达 L苯丙氨酸代谢途径关键酶基因的质
粒 pEK22分别转化 E coli w3110 PTS- G lc+和对照
菌株 E. coliw3110,摇瓶培养结果如图 7所示。由图
7可看出, PTS- G lc+菌株的苯丙氨酸产量要明显高
于对照菌株,约为对照菌株的 63倍,表明 PTS缺陷
有利于苯丙氨酸的生物合成。在 PTS- G lc+ 菌株
中,葡萄糖的转运吸收通过半乳糖苷透性酶和葡萄
糖激酶来完成, 消除了 PTS对磷酸烯醇丙酮酸
( PEP)的竞争性消耗,使 PEP更多地流向苯丙氨酸
等芳香族氨基酸的生物合成,所以苯丙氨酸合成量
得到提高。另一方面, PTS- Glc+菌株葡萄糖吸收速率
较小, 代谢产生乙酸等不利于菌体生长的物质大幅较
少, pH下降速度减缓,代谢更加平衡和高效,菌体生长
状况更好,稳定生长期更长,发酵产品产量也更高。
% .对照菌株; ∋ . E. coli w 3110 PTS- G lc+
图 7 大肠杆菌 PTS缺陷菌株对苯丙氨酸生产的影响
3 结论
本研究通过 Red同源重组技术成功敲除大肠
杆菌 ptsH Icrr基因, 获得大肠杆菌 PTS缺陷菌株。
摇瓶培养结果显示 PTS- G lc+缺陷菌株在复合碳源
培养基 ( 2 ∀YT培养基 )以及葡萄糖为惟一碳源的
培养基 (MG培养基 )中均有良好的生长能力, 而且
在 MG培养基中最终菌密度大大高于对照菌株, 不
利于菌体生长的酸性物质大幅减少。同时, PTS缺
陷株发酵生产苯丙氨酸的能力更强, 苯丙氨酸产量
约为对照菌株的 63倍, 达到 900 mg /L。
参 考 文 献
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