全 文 ：·技术与方法·
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2015, 31(8):59-65
木质纤维素是地球上已知的最为丰富的可再生
有机物质，利用纤维素酶的生物催化能力可将大量
未被利用的废弃木质纤维素转化为生物乙醇［1］，具
有可观的经济效益和环境效益。酶的水解过程是木
质纤维素转化为生物乙醇的关键步骤，但游离纤维
素酶在工业上的应用并不理想 ：游离的纤维素酶在
高温、强酸、强碱、高离子浓度及存在部分有机溶
剂等条件下不够稳定，容易失活而降低其催化能
力，难以实现回收和重复利用，造成了在工业应用
上的很大限制。采用固定化技术对纤维素酶进行固
定，可提高其稳定性和抗抑制性，使其能重复使用，
在一定程度上提高其催化活性和选择性［2-4］。但是
酶的固定化技术中酶使用后的分离限制了酶固定化
技术的进一步应用，其中载体材料的选择影响着酶
收稿日期 ：2014-12-15
基金项目 ：国家科技重大专项（2012ZX07105-003），上海市自然科学基金项目（11ZR1417200）
作者简介 ：邢朝晖，男，硕士研究生，研究方向 ：固定化技术应用 ；E-mail ：doulejuice2013@sjtu.edu.cn
通讯作者 ：林燕，女，博士，副教授，研究方向 ：生物质能源利用 ；E-mail ：linyan2002@sjtu.edu.cn
磁性纳米材料载体固定纤维素酶技术研究进展
邢朝晖1  苏跃龙2  张琦1  阮馨怡1  林燕1  王欣泽1  孔海南1
（1. 上海交通大学环境科学与工程学院，上海 200240 ；2. 云龙县环境监测站，大理 672700）
摘 要 ： 生物质原料转化为还原性糖，从而为生物质燃料乙醇的生产提供基础原料。针对现在游离酶生产工艺中的不足，
研究者提出了纤维素酶固定化技术，其中以磁性纳米材料作为纤维素酶的固定化载体，不仅可提高纤维素酶的催化性能，增强酶
的稳定性，而且以外加磁场代替传统的机械搅拌方式可充分发挥载体材料的磁响应性，从而使制备的固定化酶从反应体系中易于
分离，高效且具有重复性。研究者们提出了很多优秀的纤维素酶固定化方案，综述了近年来磁性纳米材料固定纤维素酶的不同方法，
并对其做了较为详细的阐述，在此基础上进一步对其优缺点和发展前景进行了讨论。
关键词 ： 生物乙醇 ；纤维素酶 ；酶固定化 ；磁性纳米载体
DOI ：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.08.009
Research Progress on Cellulase Immobilized by Magnetic
Nanoparticles as Carriers
Xing Zhaohui1 Su Yuelong2 Zhang Qi1 Ruan Xinyi1 Lin Yan1 Wang Xinze1 Kong Hainan1
（1. School of Environmental Science and Engineering，Shanghai Jiao Tong University，Shanghai 200240 ；2. Environmental Monitoring
Bureau of Yunlong Country，Dali 672700）
Abstract ： Conversion of biomass to reducing sugar by cellulase is the foundation of the biomass fuel production. Nowadays researchers
have invented the enzyme immobilization technology to avoid the disadvantages of free enzymatic hydrolization. Utilization of magnetic
nanoparticles as carriers for the cellulase immobilization can increase the catalytic activities of enzyme and enhance stability of the enzyme.
Moreover, replacing conventional mechanical stirring by external magnetic field can give full play to the role of carriers’ magnetic response;
with the immobilization on magnetic nanoparticles, the produced cellulase can be separated easily from the mixture in the reaction systems.
Researchers have proposed many excellent immobilization methods. Here the different methods of cellulase immobilization by magnetic
nanoparticles are reviewed, their applications are explained in detail, and consequently the advantages and disadvantages as well as the
development prospect are discussed.
Key words ： bioethanol ； cellulase ； cellulase immobilization ； magnetic nanoparticles as carrier
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.860
的活性以及后续工艺的开展，是现今研究的关键之
一［5］。在多种载体材料中，磁性纳米载体除可有效
固定化纤维素酶外，还可利用外加磁场替代工业生
产中的传统搅拌方式 ；与其他载体材料相比，磁性
纳米载体无毒、比表面积大、机械强度优良。复合
型的纳米磁性材料是将纳米磁性材料与特定的载体
材料相结合设计的新型载体材料，目前这方面的技
术具有很大的发展潜力。
本文介绍了纤维素酶的固定化技术发展进程，
就近年来的研究热点——磁性纳米材料载体，总结
归纳了建立在磁性纳米材料载体上的纤维素酶固定
化方法研究，着重分析了以壳聚糖—磁性纳米材料
为代表的复合载体的优缺点以及进一步开发的方向，
旨在为后续的纤维素酶固定化研究提供一定的参考。
1 纤维素酶固定化发展过程
酶的固定化技术最早由 Nelson 和 Griffin［6］在
1916 年提出，他们发现将蔗糖酶与氧化铝和焦炭结
合以后，蔗糖酶仍具有催化活性。至 20 世纪 80 年
代这一意外的发现才被接受为近代酶固定化技术的
基石，随后固定化酶的技术得到了长足的发展［7］。
现阶段，酶的固定化（Immobilization of enzymes）主
要是指利用物理或化学的方法将酶束缚在一定区域
内，使得酶分子仍能进行其特有的催化反应并能有
效回收重复使用的技术［8，9］。传统意义上用来固定
化酶的载体也可以特异性地用来固定纤维素酶［10］，
其中最为常见的种类包括 ：无机载体、合成高分子
载体、天然高分子载体以及复合载体等［11］，各类载
体都有广泛的应用。
无机载体是最早应用于固定化酶的载体材料，
之后载体除了充当酶的固定化支持物以外，在实际
应用中还可以用于改造酶的性质、提高酶的催化活
性、稳定性与选择性［12，13］。高分子载体（天然及合
成载体）相对于无机载体，可供修饰的官能团增多，
其表面性质、电荷分布和尺寸大小都可以预先设计
以满足实际要求［14］。复合载体兼具了组合材料的优
良性质，不再单一选择载体材料，具有更加自由的
开发空间。各类固定化载体在实际研究中并没有严
格的时间先后顺序和绝对的优劣性，这是由于纤维
素酶分子结构的复杂性和多样性，不可能有一种固
定化方法和固定化载体是适用于每一种工业应用的。
因此，针对需要研究的酶的使用状况开发及选择新
的固定化方法和固定化载体显得尤为重要。
近年来，纳米材料的优良性能逐渐显现［15］，研
究者们逐渐把目光投向开发纳米材料作为酶的固定
化载体研究［16］。从实际应用的层面出发，纳米材料
也是一类特殊的无机载体，因此兼具了无机载体的
优良性质，纳米材料是指广义上三维空间中至少有
一维处于纳米尺度范围或者由该尺度范围的物质为
基本结构单元所构成的材料，同时纳米尺寸的物质
因具有与宏观物质所迥异的表面效应、小尺寸效应、
宏观量子隧道效应等，可以构建不同的形状［17，18］，
应用于制备固定化纤维素酶［19］。在实验室阶段，纳
米粒子作为纤维素酶固定化载体时表现出了优良的
性质［20］，但是实际工业生产中仍然存在不易分离、
酶固载率偏低和酶活力回收率较低等问题。为了有
效的解决上述问题，研究者们通过固定化策略的改
进［21］，包括结合不同的固定化技术、设计开发新的
固定化载体以及固定化条件，来提高固定化酶的催
化活性、选择性和稳定性，磁性纳米材料的应用是
其中一个有效方法［22］。当固定化酶载体具有磁性时，
制备得到的固定化酶易于从反应体系中分离回收，
操作简单 ；同时可以利用外加磁场代替传统的搅拌
方式。
2 磁性纳米材料固定纤维素酶研究进展
传统使用的磁性材料是四氧化三铁，一般而言，
铁的氧化物及羟基氧化物，按价态、晶型和结构的
不同可分为（α-，β-，γ-）Fe2O3、Fe3O4、FeO 和（α-、β-、
γ- 和 δ-）FeOOH，其中研究较多和具有实用价值的
铁的氧化物主要有 Fe3O4、γ-Fe2O3 及 α-Fe2O3 等
［23］。
现阶段由于纤维素酶结构的复杂性，研究者一直在
寻找合适的固定化方法，基于磁性纳米粒子与固定
的纤维素酶的结合方式，本文将固定化方案大致分
为 3 类，即直接固定、修饰固定及复合载体进行固定。
2.1 直接固定
将纤维素酶直接固定在磁性纳米颗粒表面可以
克服有孔载体普遍存在的扩散阻力，单一的磁性纳
米粒子具有更高的磁响应性和更大的比表面积。有
关酶直接固定在磁性纳米粒子表面的固定化机理一
2015,31(8) 61邢朝晖等：磁性纳米材料载体固定纤维素酶技术研究进展
般认为 ：通过化学共沉淀法制备的磁性纳米粒子属
于“巨型离子”，其表面会在特定的溶液体系中吸附
氢氧根离子从而带有正（负）电荷（粒子表面在吸
附氢氧根后还会因为氢氧根的电荷效应结合其他阳
离子，因此其所处的离子环境决定了粒子吸附后的
电荷表现）从而导致粒子在碱性环境中表面带有负
电荷，而在酸性环境中表面带有正电荷。有研究指
出在 pH7.5 时 OH-在粒子表面的电荷效应为零，这
时粒子表面电荷密度很小并且极易团聚［24］。Bacri
等指出 -OH 在 pH6-10 的范围内都会被吸附保留在
粒子表面。因此直接固定化主要是使粒子表面自由
的羟基和酶的氨基结合使得其固定在粒子表面［25］。
由于使用磁性纳米材料进行纤维素酶固定化的简易
性引起了人们广泛的兴趣，表 1 从载体制备到固定
表 1 纤维素酶直接固定在磁性纳米载体
载体制备反应条件 粒子表征
效果
固定化
纤维素酶
固定化方法 固定化条件 固定化效果 参考
文献
pH 10 ；80℃ ；30 min 20 nm 国药生化试
剂配制
N，N’- 羰基二咪
唑（CDI）活化交
联
pH 4.55 ；4℃ ；30
min
10 批次后酶活力保持 80% ；低温保存 30
d 酶活力保留 84%
［25］
70℃ ；450 r/min 食品级纤维
素酶
1-（3 二甲氨基丙
基）-3- 乙基碳二
亚胺（EDC）活化
交联
pH 4.0 ；25℃ ；
120 r/min
最适温度 60℃，最适 pH（5.0）几乎没
有变化
［26］
80℃ ；30 min 13.3 nm EDC 活化交联 混合冷却至 4℃ ；
2 h ；固化温度为
25℃
最大固载率 90%（当酶投量 1-2 mg，粒
子 50 mg）；pH 5.0 ；50℃，6 批次后
10% 的相对酶活 ；第一次水解后固定化
酶酶活力相当于游离酶的 30.2%
［2］
70℃ ；450 r/min ；1 h 11.5 nm ；
62.732
emu/g
纤维素酶
（EC 3.2.1.4）
水溶性碳二亚胺
活化交联
25℃ ；24 h ；150
r/min
粒子晶态结构无变化。纤维素酶有效
交联，粒子的比饱和磁强分别为 77.366
emu/g 和 62.732 emu/g
［27］
购置 Fe3O4 纳米粒子
（Plasma Chem 德国）
50-110
nm
纤维素酶来
自绿色木霉
离子吸附法 pH 5 ；室温 ；7 h 最大固载率 95%（当酶投加量 2 mg，
粒子 60 mg）；最适温度接近 60℃，在
pH>7 时活性变强
［28］
购置磁性纳米粒
子（经戊二醛活化，
Chemicell（德国））
1 μm CellicCTec2
纤维素酶半
纤维素酶复
合体
pH 7.4 ；室温 ；24
h
2.8 g 还原糖 /kg 粒子 /min ［29］
化效果梳理了常见的纤维素酶固定化方案。
在直接固定化中，更加常见和成熟的方案是共
价吸附法［30］。表 1 中列举的前几项研究都建立在此
方法之上。一般在载体结合酶的时候要经过两个阶
段 ：吸附与共价结合。当酶分子在溶液中因为物理
作用靠近带有化学功能基团位点的载体附近后，足
够接近的酶分子上的非活性部位基团与载体上数量
足够的活性化学功能团发生化学反应，使得酶分子
结合到载体上。虽然直接固定不需要对磁性纳米粒
子进行修饰，流程较为简单，在这种条件下，酶的
活力取决于吸附与共价结合两个操作过程［31］，扩散
限制、载体活性位点官能团和固定化条件、体系的
pH 及温度等都会影响酶的活性。表 1 显示，直接固
定条件的选择存在多样性，而共价结合的取向难以
控制［32］，从而导致了酶活力的差异。20 世纪 70 年
代就有研究者提出，固定化载体和酶之间的静电复
合物对于固定化酶的活性与稳定性具有重要意义，
不同的活化剂选择、固定化条件的控制都会导致纤
维素酶的固载率和酶活力的差异，从而导致应用上
的局限。除了磁性纳米粒子的物理特性（粒径、比
表面积以及粒子形貌等）的差异，选择合适的活化剂，
调控合适的固定化条件仍是现在研究的重点。表 1
中列举的方案多采用水溶性碳二亚胺活化纤维素酶
再将其与磁性纳米粒子交联固化，无论是 EDC 还是
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CDI，价格都偏高，若需要大规模生产经济成本较高，
有待进一步寻找合适的交联活化剂。
2.2 修饰固定
相比较直接将酶固定于磁性纳米粒子，对载体
表面化学修饰后使其带上各种反应性功能基团（如
环氧基、羰基或氨基等），可在一定程度上增加其结
合酶的强度［33］，使得固定化酶不易脱落［34］，同时
因为部分修饰方法需要进行较为剧烈的化学反应，
因此可能会对酶的活性中心造成相对的损伤，从而
导致固定化酶活性的下降，所以在修饰固定化纤维
素酶时需要格外注意修饰的功能团化学生物性质以
及修饰方法的温和性，尽量不要对固定化的酶催化
性能造成损失，表 2 列举了近年来常见的几种较为
成熟的修饰固定纤维素酶的方法。
表 2 纤维素酶固定在表面修饰的磁性纳米载体
载体修饰 修饰方法
条件
粒子表征 固定化纤
维素酶
固定化方法 固定化条件 固定化效果 参考
文献
聚乙二醇 反应直接投
加
纤维素酶
（Sigma 公
司）
以戊二醛交联
剂，吸附交联
pH 4.5 ；50℃ 10 批次后活性保持 59%，低
温贮藏 26 d 活性下降 42.6%，
Km=4.48 mg/mL
［35］
聚乙烯醇 反复冻融 10 nm ；47.55
Am2/mg
纤维素酶
R-10
物理交联 pH6.0 ；11h ；
酶 /PVA=4 ；
PVA/Fe=50
酶回收率 42% ；5 批次后酶活
力保持 50% 以上
［36］
正硅酸乙酯（TEOS）
烷化 ；表面氨基化
TEOS 和丙
酮水浴反应，
加入磁流体，
50℃研磨 ；
加入 APTES
室温搅拌 7 h
25 nm ；晶体
结构没变 ；
28.715 emu/g
纤维素酶
（宁夏和氏
璧生物技
术公司）
戊二醛活化粒
子表面交联
25℃ ；5 h ；
150 r/min
6 批次后酶活力保留 62.7% ［37］
氨丙基三乙氧基硅
烷（APTES），丙烯
酸丁酯（BA），乙
二胺（EDA）修饰
超声 20 min
搅拌 7 h ；超
声 30 min 反
应 48 h ；双
倍 BA，EDA
反应
氨基含量
0.41，0.69，
0.87 mmol/g ；
12，14，27，
40 nm
修饰磁性颗粒粒径 40 nm ；三
代产品仍具较高饱和磁化强度
29.97 emu/g
［38］
修饰固定法的设计理念是 ：先经过与化学试剂
反应使得制备的磁性纳米颗粒表面带上特定的官能
团，再通过物理或化学作用让酶分子接近反应位点
并与活化的官能团结合，从而使得酶分子牢固结合
到载体上［39］。在表 2 列举的固定化方法中，经过多
批次的水解之后，固定纤维素酶仍保有相当高的酶
活性，这说明了经过修饰的载体与酶分子间的结合
更为牢固，并且可以重复水解纤维素。修饰载体上
共价结合的酶可以看作是经过化学或物理作用修饰
过的酶，它们的理化性质被所使用的载体修饰了。
在进行固定化的时候，酶和载体上修饰的化学官能
团发生反应，这改变了酶的构象，同时酶分子的空间
取向也因为结合到反应位点而发生了相应的改变，
因此酶的化学性质也相应改变，这都使得成功固定
化的纤维素酶在催化性能、选择性和稳定性上都比
传统吸附法固定的酶或天然酶有了显著提升。
2.3 复合载体固定
以磁性纳米粒子作为载体直接通过吸附、偶联
的方式固定纤维素酶，操作要求较低、工艺较为简
便，易于实现工业化，但是直接固定往往导致纤维
素酶的固载量偏低，这是由于简单吸附的附着力较
弱，酶分子易脱落，即使是使用脱水剂活化之后共
价结合，也较容易受到溶液环境的影响，在表 1 实
验方案中的高固载率往往要在比较低的纤维素酶投
加量下得到，且高固载率下的重复性能仍待实验验
证 ；以表面功能化的磁性纳米粒子作为载体固定纤
维素酶，虽然可以通过增加粒子表面的可用官能团
数量，或者利用复杂化的空间结构提高酶分子与结
2015,31(8) 63邢朝晖等：磁性纳米材料载体固定纤维素酶技术研究进展
合位点的反应机会，从而增加酶分子的固载量，但
是表 2 固定化方法中，化学修饰相对繁琐，操作要
求较高，而且经过复杂的表面修饰，高刺激性的化
学试剂残留也可能会对酶的生物特性产生影响。另
外，由于共价结合改变了酶分子的空间构象，有时
反而会使固定的纤维素酶酶活降低。因此，研究者
们开始研究以磁性高分子微球为载体的复合固定化
酶技术。对于无孔的磁性载体颗粒，如以包覆法制
备的微球，在可分离的非均相反应体系中，颗粒越小，
其固定化的表面积越大，越有利于增加载体的固载
量；对于制备的多孔载体，因为会有浓度梯度的存在，
渗透到载体内部的酶分子会因为扩散限制出现功能
性失活，通常在制备载体微球时可以通过改变载体
制备条件，如致孔剂，交联剂的选择和浓度，控制
载体的孔隙率，对于较大的颗粒，酶活可以通过酶
的固载率进行控制。另外复合载体兼有强磁响应性、
高比表面积、机械强度高、单分散性好的优势。其
中四氧化三铁 - 壳聚糖复合载体因为其良好的机械
性能、化学稳定性以及抗金属离子干扰等优点而备
受关注。
壳聚糖本身也可以单独成为纤维素酶的固定化
载体［40］，结合磁性材料的壳聚糖复合载体继承了其
生物大分子的特性［41］，目前，磁性壳聚糖微球的结
构可分为 3 类［42］：核 - 壳结构，磁性材料为核，高
分子材料为壳 ；混合结构，磁性材料分散在磁性微
球内部 ；多层夹心结构，外层和内层为高分子材料，
中间为磁性材料。
制备的四氧化三铁 - 壳聚糖复合载体兼具磁性
纳米材料的磁响应性以及壳聚糖生物大分子的生物
相容性、易于修饰的特点，提高了载体的机械性能
以及稳定性，在酶固定化领域具有广阔的应用前景，
表 3 以修饰方法为出发点，介绍了以壳聚糖磁性纳
米材料为固定化载体制备的纤维素酶（蛋白质）固
化方法及效果。
表 3 纤维素酶固定在四氧化三铁 - 壳聚糖复合载体
修饰方法条件 粒子表征效果 固定化酶（蛋白） 固定化方法 固定化反应
条件
固定化效果 参考
文献
60℃，1 h 滴加甲醛 ；
80℃，1 h 滴加戊二醛
纤维素酶（上海
博奥生物）
EDC 活化，戊
二醛交联
pH 7 ；50℃ 耐受磁场，酶活 18-27
U/g/min
［43］
混合搅拌 30 min ；加入 1
mol/L NaOH
10-18 nm，粒子晶型
未变
纤维素酶（Meiji
Seika Pharma Co.
日本）
戊二醛交联 pH 5 ；25℃ ；
2 h
固载 112.3 mg/g，酶活
5.231 U/mg ；10 批次酶
活保留 50%
［44］
70℃，1 h ；逐滴加入油酸 10-20 nm， pH<3
（>10）稳定存在
牛血清白蛋白 吸附 pH 6 BSA 吸附 300 mg/g 粒子 ［45］
180℃ ；24 h ；静电自组装 49 nm ［40］
现阶段应用于固定纤维素酶的复合载体，特别
是与磁性纳米粒子复合的载体数量还有待进一步开
发，研究者们就如何得到更高效的四氧化三铁 - 壳
聚糖磁性纳米复合载体，在修饰基团［46］、固定化方
法［47］、固定化条件［48］控制等方面并未达成一致，
还有待深入研究。由于结合了两种或多种载体材料，
复合载体显示出了优于单一载体的理化性能，同时
也发挥了磁性纳米材料的优势，但是开发新的载体
并不表明要与已有的载体材料分割开来，研究者们
开发了众多的酶固定化载体，这些载体材料都可能
经过新的设计特异性地应用到纤维素酶的固定化中。
可以说，利用磁性纳米材料为基础的复合固定化载
体会为大规模的工业应用奠定基础。但是不容忽视
的一点是，虽然复合载体优势突出，但是制作工艺
相对较复杂，操作条件要求相对较高，所以寻找更
优化的复合材料，以及如何简化复合材料的制备和
固定化流程将是进一步研究开发的重点。
3 展望
纤维素酶以其高效、专一的催化作用已经成为
国内外研究者开发的关注点。壳聚糖是自然界含量
第二丰富的天然高分子，具有多种优良的生物、物
理化学性能，是一种出色的纤维素酶固定化载体，
两者结合必然能为生物质转化领域带来新的突破。
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.864
从现在国内外研究者们的成果来看，利用磁性纳米
粒子固定纤维素酶已展现出卓有成效的科研和实业
价值。但是现阶段关于磁性纳米作为固定纤维素酶
的研究中仍然存在一些亟待进一步研究的方面 ：（1）
研究开发优质的交联剂，制备出具有更高活力和稳
定性的固定化纤维素酶 ；（2）采用结构、化学键检
测手段深入研究酶的集聚状态、超分子结构等微观
结构的变化，更好的阐明磁性固定化交联酶聚集形
态形成机理 ；（3）针对不同的纤维素结构和纤维素
酶种类，研究开发更适宜的改性结构以及更加深入
阐释固定化纤维素酶水解发酵工艺中的微观动力学。
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（责任编辑 狄艳红）