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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2014年第7期
沙门氏菌是人类食源性疾病的重要病原细菌，
也是引起食物中毒最为常见的病原菌之一。在我
国，由沙门氏菌引起的食物中毒病例占 70%-80%，
而肉蛋奶等畜产品被沙门氏菌污染所引起的中毒可
达 90% 以上。沙门氏菌能引发人畜发热、腹泻、呕
吐等症状，严重时可导致脱水甚至死亡［1］。目前，
我国对沙门氏菌的检测常采用国标法（GB 4789.4-
2010），但其操作复杂、检测周期长，已不能满足当
今食品检测的需求。目前，随之应运而生的食源性
收稿日期 ：2014-01-13
基金项目 ：国家自然科学基金项目（31371844，31071556），国家高科技研究发展计划（2011AA100801），安徽省科技计划课题（1301032155）
作者简介 ：杨晋，女，硕士研究生，研究方向 ：粮油食品微生物 ；E-mail ：yj_yangjin@163.com
通讯作者 ：曾庆梅，男，博士，教授，研究方向 ：农产品生物化工 ；E-mail ：zengqingmei-1@163.com
添加扩增内标的沙门氏菌 PCR 检测方法
杨晋 曾庆梅 张笛 刘坤 王琳 张亚军
（合肥工业大学 农产品生物化工教育部工程中心，合肥 230009）
摘 要 ： 通过构建人工扩增内标，建立可以有效指示沙门氏菌检测过程可能出现假阴性情况的 PCR 检测方法。本研究基于
沙门氏菌 invA 基因设计特异性引物，复合法构建扩增内标，建立 PCR 检测体系。特异性引物 LW，对 33 株沙门氏菌和 6 株非沙
门氏菌标准株进行检测，结果显示，所有沙门氏菌均扩增出 385 bp 的目标片段，非沙门氏菌则只能扩增出 484 bp 的扩增内标片段，
特异性良好。灵敏度实验表明，该检测体系的灵敏度可达 6.35 fg/μL。人工污染实验表明，起始染菌量为 3.2 CFU/25 mL 时，仅需 8
h 增菌培养便可检出。大量食品样品检测证明，该检测体系确实可以有效的避免 PCR 检测过程出现的假阴性，提高检测准确性。
关键词 ： 沙门氏菌 PCR 检测 扩增内标 假阴性
Development of an Internal Amplification Control in the PCR
Detection for Salmonella
Yang Jin Zeng Qingmei Zhang Di Liu Kun Wang Lin Zhang Yajun
（Engineering Research Center of Bio-process Ministry of Education，Hefei University of Technology，Hefei 230009）
Abstract: By constructing an internal amplification control（IAC）, this study developed a PCR system for the detection of Salmonella,
which could effectively indicate false-negative results. The specific primers were designed according to the conserved gene invA in Salmonella
spp.. An IAC was constructed by the compound primer technology, and finally the PCR detection system was developed. The experiment
indicated that the specific 385 bp DNA fragment was amplified against 33 reference strains of Salmonella spp., while 6 strains of non-Salmonella
only showed the 484 bp amplified band of IAC. The detection limit of this PCR system forpurified genomic DNA was 6.35 fg/μL. The artificial
contamination assays showed that Salmonella could be detected after eight hours enrichment when the original bacterial concentration was 3.2
CFU/25 mL. A large number of food samples were also tested, and the results demonstrated that the detection system could effectively avoid the
false-negatives and improve the detection accuracy.
Key words: Salmonella PCR detection Internal Amplification Control false-negative
致病菌的快速检测方法发展迅速。其中，以核酸为
基础的 PCR 检测技术以其检测操作方法简单、检测
周期短、特异性好等特点，在沙门氏菌检测应用中
越来越受到重视［2，3］。Malorny 等［4］在 16 所国际实
验室开展验证食源性致病菌 PCR 检测方法的准确性
研究，结果表明引物特异性达 99.6%，对 28 份样品
进行双盲检测准确率达 98%，确立沙门氏菌 PCR 检
测国际标准。
近来的应用实践表明，PCR 检测方法存在一些
2014年第7期 55杨晋等 ：添加扩增内标的沙门氏菌 PCR 检测方法
不足，其检测结果会存在假阴性现象［5，6］，造成漏检。
究其原因主要是食品基质、培养基成分以及 DNA 提
取残留的试剂等抑制 PCR 扩展反应所致［6，7］。因此，
有效的减少或消除 PCR 检测可能存在的假阴性问题
成为近来研究的热点。食源性致病菌的生物学检测
技术研究报道中指出，扩增内标现已被认为是分子
生物学检测技术所必须的组成元件［9］。扩增内标是
加入到 PCR 检测体系中的非靶点 DNA 序列，它可
与目标基因一起扩增，根据其扩增情况来指示 PCR
反应过程是否存在假阴性［10，11］。
本研究拟设计一种添加扩增内标的沙门氏菌
PCR 检测方法，以减少 PCR 检测出现的假阴性现象，
并通过人工污染蛋液实验、实际样品的检测来评价
其应用于食品样品检测的效果。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌株 5 株沙门氏菌标准株均购于中国工业
微生物菌种保藏管理中心，其余 28 株沙门氏菌为实
验室从畜禽蛋品中分离而得，6 株非沙门氏菌均为
本实验室保存菌（表 1）。
表 1 实验菌株及其 PCR 检测结果
菌株 菌株编号 数量
PCR 检测结果
LW 139-141
肠炎沙门氏菌 CICC21482 1 + +
鼠伤寒沙门氏菌 CICC10420 1 + +
甲型副伤寒沙门氏菌 CICC21501 1 + +
乙型副伤寒沙门氏菌 CICC10437 1 + +
猪霍乱沙门氏菌 CICC21493 1 + +
沙门氏菌 Sal1-28 28 + +
大肠杆菌 ATCC11246 1 - -
大肠杆菌 ATCC43889 1 - -
单核细胞增生李斯特菌 ATCC50002 1 - -
金黄色葡萄球菌 ATCC27664 1 - -
枯草芽孢杆菌 ATCC6633 1 - -
副溶血弧菌 ATCC33846 1 - -
+ ：扩增到目标片段 ；- ：未扩增到目标片段
1.1.2 主要试剂与仪器 细菌基因组提取试剂盒、
琼 脂 糖 凝 胶 DNA 回 收 试 剂 盒、Taq DNA 聚 合 酶、
Marker、10×PCR Buffer、MgCl2，均购于生工生物
工程上海股份有限公司 ；pMD18-T 购于宝生物工程
大连有限公司 ；PCR 扩增仪杭州博日科技有限公司 ；
电泳仪 Bio-Rad ；凝胶图像分析仪上海天能科技有限
公司。
1.2 方法
1.2.1 菌种的活化及基因组 DNA 的提取 将实验
室保存的菌种，接种于 LB 液体培养基内，37℃过
夜培养，LB 平板划线，挑单菌落接种于 LB 培养基
内，37℃过夜培养。取 1 mL 菌液于 1.5 mL 离心管，
采用细菌基因组提取试剂盒提取沙门氏菌基因组
DNA，并将提取的基因组 DNA 置于 -20℃下保存。
1.2.2 基因组 DNA 的纯度测定 无菌水稀释 20 倍，
采用紫外分光光度计在波长 260、280 和 230 nm 下
测定其浓度和纯度。
1.2.3 引物的筛选 参考文献［4，12，13］，选择
沙门氏菌特异性基因序列 invA，利用软件 Primer
Premier5.0 设计引物。经 PCR 反应验证，最终筛选
出一对性能优良的沙门氏菌特异性检测引物 LW，
扩增片段大小为 385 bp。序列如表 2 所示。引物合
成均由上海生工生物工程有限公司完成。
1.2.4 扩增内标的构建及浓度测定 扩增内标利用
复合引物法［14］构建，根据内标片段与目的片段同
源性不超过 20% 的原则，筛选一段来源于沙门氏菌
的基因片段（446 bp），设计一对内标引物 YJ，在其
5 端分别连接上目标引物 LW，形成一对长引物 LJ，
该长引物对 446 bp 基因片段进行 PCR 扩增得到 484
bp 的产物，即为构建的扩增内标［15］。
将内标片段经琼脂糖凝胶 DNA 回收试剂盒回
收，将内标片段插入到载体 pMD18-T 中，然后转化
至 JM109 感受态细胞，涂布 LB/Amp/X-Gal/IPTG 固
体培养基，挑选白色菌落，经通用引物 BcaBESTTM
Sequencing Primer 鉴定。阳性克隆菌落接种于 LB 液
体培养基，37℃过夜培养，采用质粒提取试剂盒提
取质粒，按方法 1.2.2 测定浓度，-20℃保存。
1.2.5 PCR 检 测 方 法 的 建 立 及 内 标 添 加 量 确
定 PCR 反应体系包括 ：10×PCR Buffer 2.5 μL、25
mmol/L MgCl2 2.0 μL、2.5 mmol/L dNTP 2.0 μL、10
μmol/L 引 物 1.0 μL、 模 板 2.0 μL、5 U/μL Taq DNA
聚合酶 0.5 μL，用 ddH2O 将体积调整为 25.0 μL。
反应条件 ：94℃预变性 5 min ；94℃变性 30 s，
55℃退火 30 s，72℃延伸 40 s，40 个循环 ；72℃延
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第7期56
伸 10 min。用 1.5% 琼脂糖凝胶电泳观察结果，以无
菌水为模板做空白对照。
内标添加量的确定 ：理论上内标片段与目标基
因二者共用同一对引物进行扩增，两者之间存在一
定竞争，应尽量控制扩增内标的浓度，避免对目标
引物灵敏度影响［16］。通过预实验，将已知浓度的扩
增内标质粒作 10 倍梯度稀释，按上述方法进行 PCR
扩增，以出现肉眼可见的最后 1 个的条带作为内标
添加的考察量。再以 10 倍系列梯度稀释的沙门氏菌
DNA 为模板，进行 PCR 扩增，选取最适内标添加量。
1.2.6 建立的 PCR 检测体系特性
1.2.6.1 特异性提取 菌株基因组 DNA，取 5 μL 作
为模板，按方法 1.2.5 进行 PCR 检测。同时，以沙
门氏菌通用检测引物 invA 139-141［17］进行对照验证。
1.2.6.2 灵敏度的检测基因组 DNA 灵敏度评价 将
已知浓度的沙门氏菌标准株基因组 DNA 做 10 倍系
列梯度稀释，每个梯度各取 5 μL 作为模板，进行
PCR 扩增，能得到肉眼可见条带的最低浓度梯度即
为该 PCR 检测体系的灵敏度。
纯培养物灵敏度评价 ：将沙门氏菌标准株活化
后，接入 LB 培养基，37℃培养 10 h，用无菌水作
10 倍梯度稀释，取 10-5、10-6 和 10-7 3 个稀释梯度
做平板计数，计算原始菌落数。每个稀释度各取 1
mL 菌液，提取 DNA，取 5 μL 作为模板，进行 PCR
扩增。
1.2.6.3 重复性检测 取 5 株沙门氏菌标准株，每株
菌做 3 个平行，按 1.2.5 建立的方法进行 PCR 检测。
1.2.7 人工污染食品样品检测 取污染菌肠炎沙门
氏菌标准株经活化后，挑取单菌落接种于 LB 培养基，
37℃培养 8 h，用 0.9% 的无菌生理盐水 10 倍梯度稀
释后，取 10-5、10-6 和 10-7 3 个稀释梯度做平板计数，
计算原始菌落数。取 10 份无菌蛋液与缓冲蛋白胨水
混合液（25 mL225 mL），取适当稀释浓度的菌液
1 mL 接至混合液中，使接种量分别为 0-1 CFU、1-10
CFU、10-100 CFU，每组做 3 个平行，另取 1 mL 0.9%
的无菌生理盐水加入混合液为空白对照，即接菌量
为 0。将上述样品于 37℃，150 r/min 的摇床中增菌
培养，每隔 2 h 取样，提取沙门氏菌基因组 DNA 作
为模板，用该 PCR 检测方法检测。
1.2.8 食品样品检测 采集肉样、蛋样和奶样等 3
种食品样品，共 105 份，按照国标法（GB 4789.4-
2010）进行处理。每份样品取 25 g（mL），移入 225
mL 缓冲蛋白胨水液体培养基中，37℃，150 r/min
的摇床培养 10 h。取 1 mL 增菌液，提取基因 DNA，
用该 PCR 检测方法进行检测，结果与国标法检测结
果进行比较。
2 结果
2.1 基因组DNA浓度和纯度及扩增内标浓度测定
经测定，沙门氏菌基因组 OD260/OD280=1.96，在
1.7-2.0 之 间，OD260/OD230=2.07>2.0， 可 知 基 因 组
DNA 纯度较高，浓度为 6.35×105 ng/μL ；扩增内标
浓度为 4.56 ng/μL，根据 DNA 拷贝数公式［18］：สഐDNA ⎃ᓖ ng/μL ×10-9×Arogado㌫ᮠ
DNA䮯ᓖ bp ×650
其 中，Avogadro 系 数 为 1 mol 6.022×1023，650
为每个碱基对平均分子量，又 DNA 长度 =2 692 bp（载
体 pMD18-T）+484 bp（内标片段），可知 ：1 μL 扩
增内标的拷贝数为 1.33×109）。
2.2 扩增内标添加量的确定
经 预 试 验 肉 眼 可 见 最 后 1 个 条 带 的 浓 度
1.33×103 拷贝 /PCR，进一步优化内标添加量。扩增
内 标 分 别 以 7.65×103、1.33×103 和 1.67×102 这 3
个浓度加入体系，考察其对检测限的影响。结果表明，
添加 7.65×103 拷贝 /PCR 的内标时，体系检测限与
未添加内标的检测限相比，高一个数量级 ；而添加
1.33×103、1.67×102 拷贝 /PCR 两个浓度，对目标
条带的检测限无影响，条带均清晰可见，无太大差异，
表 2 引物序列
引物 序列（5-3） 扩增长度（bp）
LW GTCCTCCGCCCTGTCTACTT 385
CTTCCCAGCAGCAATCCATAC
YJ TGGGTAACGCATGAAGAGGG 446
GGGAGAACTTCGCAATGGGT
LJ GTCCTCCGCCCTGCTACTTTGGGT- 484
AACGCATGAAGAGGG
CTTCCCAGCAGCAATCCATACGG-
GAGAACTTCGCAATGGGT
139-141 GTGAAATTATCGCCACGTTCGGGCAA 284
TCATCGCACCGTCAAAGGAACC
2014年第7期 57杨晋等 ：添加扩增内标的沙门氏菌 PCR 检测方法
此说明，该检测体系，经 8 h 增菌，即可从初始染
菌量为 3.2 CFU/mL 的样品中检测出沙门氏菌，阳性
检出率为 100%。
表 3 人工污染食品检测结果
菌株
时间
（h）
接菌量（CFU/mL）
32 32 32 3.2 3.2 3.2 0.32 0.32 0.32 0
肠
炎
沙
门
氏
菌
2 - - - - - - - - - -
4 - - - - - - - - - -
6 + + + - - - - - - -
8 + + + - + + - - - -
10 + + + + + + - - - -
12 + + + + + + + + - -
2.5 食品样品检测结果
105 份食品样品经检测结果（表 4）显示 ：添
加内标 PCR 检测结果，25 份为阳性，77 分为阴性，
3 份为 PCR 受到抑制（即目标条带与内标条带都未
扩增出），国标法与未添加内标 PCR 检测结果相同，
阳性结果仍为 25 份，阴性结果为 80 份 ；将未出现
条带的 3 份样品重新增菌培养，对模板 DNA 进行稀
释处理，添加内标 PCR 方法再次检测，2 份为阳性，
1 份为阴性。同样延长增菌时间，国标法得到同样
385
1 2 3 4 5 6 7 8 M 9 10 11 12 13 14 15 16
385
484
484
385385
484
1 2 3 4 5 6 7 8 M 9 10 11 12 13 14 15 16
bp bp
bp bp
A
B
A ：1-7 ：模板 DNA 浓度分别为 6.35×105-0.635 fg/μL ；8 ：negative control，
内标添加量为 7.65×103 拷贝 ；10-16 ：模板 DNA 浓度分别为 6.35×105-
0.635 fg/μL ；9 ：negative control，未添加内标 ；M ：200 bp ladder marker
B ：1-7 ：模板 DNA 浓度分别为 6.35×105-0.635 fg/μL ；8 ：negative control，
内标添加量为 1.33×103 拷贝 ；10-16 模板 DNA 浓度分别为 6.35×105-
0.635 fg/μL ；9 ：negative control，内标添加量为 1.67×102 拷贝 ；M ：200
bp ladder marker
图 1 扩增内标添加量对检测灵敏度的影响
故选择较小添加量 1.67×102 拷 贝 /PCR 为 内 标 添
加量。
2.3 建立的PCR检测体系特性
2.3.1 特异性 按方法 1.2.5 对表 1 进行 PCR 检测，
结果（表 1）显示，所有沙门氏菌均能扩增出 385
bp 的目的条带，即阳性 ；非沙门氏菌仅能扩增出
484 bp 的内标条带，为阴性。其结果与目前常用引
物 invA 139-141 结果相同。表明引物 LW 特异性良好。
2.3.2 灵敏度 如图 2 所示，沙门氏菌基因组 DNA
10 倍梯度稀释至 6.35 fg/μL 时，取 5 μL 检测时仍有
肉眼可见目标条带，与对照引物 139-141 的检测限
相比处于同一数量级。而纯培养的沙门氏菌菌体的
检测限为 4.3×102 CFU/mL。
2.3.3 重复性 以 5 株沙门氏菌基因组 DNA 为模板，
分别进行 3 次重复检测，均扩增出目标条带，证明
该检测方法有良好的重现性。
2.4 人工污染食品样品的检测
由平板计数知，肠炎沙门氏菌原始菌液接种量分
别为 3.2×108 CFU/mL，则蛋液样品中接入的 3 个浓
度的菌量分别为 32 CFU、3.2 CFU 和 0.32 CFU。PCR
检测结果（表 3）显示。样品蛋液初始接菌量为 3.2
CFU/mL 时，仅需 8 h 增菌培养便可检出 ；空白对照
组均没有扩增出目的条带，只扩增出内增条带。由
A
484
bp
385
1 2 3 4 5 6 7 8 9 M
B
484
bp
385
1 2 3 4 5 6 7 8 M
A ：1-8 ：沙门氏菌基因组模板浓度分别为 6.27×1050.0627 fg/μL ；
9 ：negative control ；M ：200 bp ladder marker
B ：1-7 ：沙门氏菌菌体浓度分别为 4.3×106-0.43 CFU/mL ；
8 ：negative control ；M ：200 bp ladder marker
图 2 检测体系灵敏度评价
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第7期58
表 4 食品样品检测结果
样品 数量 国标法检测结果（阳性 / 阴性） 未添加内标 PCR 检测结果（阳性 / 阴性） 添加内标 PCR 检测结果（阳性 / 阴性） 假阴性结果
鲜蛋 37 7/30 7/30 7/29 1
鲜奶 35 4/31 4/31 4/31 0
鲜肉 33 14/19 14/19 14/17 1
总样 105 25/80 25/80 25/77 2
结果。可能原因染菌量较低，模板 DNA 提取试剂中
存在抑制因子。由此可知，本研究建立的检测体系
在进行大量样品检测时，确实能够指示假阴性，提
高检测的准确性。
3 讨论
本研究建立的内标 PCR 检测方法，基于沙门氏
菌常用检测基因 invA 设计目标引物 LW，invA 为沙
门氏菌基因库内高保守基因，有较强的特异性。引
物 LW 经 33 株沙门氏菌、6 株非沙门氏菌 PCR 检测
验证，特异性良好，与目前 PCR 检测沙门氏菌常用
引物 139-141 检测结果相同。
欧盟委员会在规定 PCR 检测标准中指出，添加
扩增内标成为 PCR 检测必需，它可有效指示检测中
存在的假阴性，且在欧洲被广泛认可推广［4，19，20］，
而我国扩增内标的未得到广泛应用。本研究采用复
合引物法构建的扩增内标，扩增内标与目标基因之
间同源性很低，防止二者在扩增中，通过互补链而
结合交联在一起，影响检测灵敏度。理论上，由于
扩增内标与目的片段，二者共用同一对引物，在同
一 PCR 扩增中会存在竞争，这点在本研究中得到验
证，当目的片段浓度较大时，内标片段扩增效果较
差，条带较弱，相应随着目标片段浓度减小或无时，
内标片段扩增效果良好，条带清晰。因此，选择适
宜的扩增内标添加量显得尤为重要。本研究建立的
检测体系，当内标添加量为 1.67×102 拷贝 /PCR 时，
与未添加内标的检测灵敏度相同（6.35 fg/μL），不会
降低检测灵敏度。且比刘斌［15］报道沙门氏菌检测
限 12.8 fg/μL 降低，增大可检出范围。
由 人 工 污 染 食 品 检 测 实 验 可 知，25 mL 蛋 液
初 始 染 菌 量 为 3.2 CFU 时， 只 需 增 菌 8 h 便 可 检
出， 这 与 Hadjinicolaou 等［13］ 报 道 相 同，González-
Escalona［3］在 qPCR 中 5 CFU/100 g 人工染菌可被检
出结果相似。一般增菌培养 8-10 h，都可满足 PCR
检测限，再加后期样品处理 PCR 扩增，整个检测约
15 h，这与国标法 4-5 d 的常规鉴定相比，大大降低
了检测时间。此外，在大量食品样品的检测中，与
未添加内标相比，添加扩增内标的 PCR 方法确实能
够有效的避免检测中存在的假阴性情况。
4 结论
本研究建立添加扩增内标的沙门氏菌 PCR 检测
方法，特异性良好，可有效的指示检测过程存在的
假阴性现象，提高 PCR 检测准确率。
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（责任编辑 狄艳红）