全 文 ：·研究报告·
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2015, 31(10):191-198
收稿日期 ：2015-01-23
基金项目 ：国家科技支撑计划项目（2013BAJ11B03）
作者简介 ：何腾霞，女，硕士研究生，研究方向 ：应用微生物 ；E-mail ：hetengxia5153@163.com
通讯作者 ：李振轮，博士，教授，研究方向 ：分子微生物 ；E-mail ：lizhlun4740@sina.com
耐冷好氧亚硝酸盐型反硝化细菌的鉴定及脱氮特性研究
何腾霞 李振轮
（西南大学资源环境学院 土壤多尺度界面过程与调控重庆市重点实验室，重庆 400716）
摘 要 ： 旨在对获得的具有耐冷高效去除亚硝酸盐氮和总氮的好氧反硝化细菌进行分类地位及除氮特性研究。结合形态学
观察、特异性磷脂脂肪酸检测和 16S rRNA 基因序列分析，对实验室新分离获得的 Y-9 菌株进行鉴定，在此基础上，研究了温度、
转速、pH、接种量、碳源和亚硝酸盐氮浓度等不同条件对该菌脱氮能力的影响。结果显示，菌株 Y-9 属于恶臭假单胞菌（Pseudomonas
putida），还原亚硝酸盐氮的最适温度为 15℃，最佳溶解氧水平对应转速为 100 r/min，在该溶解氧水平下 15℃、48 h 内对亚硝酸盐
氮和总氮的去除率高达 100% 和 77.13%，最佳 pH 为 7，100 mL 反硝化培养基中最适接种量为 1 mL OD600 为 0.5 的菌悬液，碳源为
柠檬酸钠，适合治理低浓度的亚硝酸盐氮污染水体，但对高浓度的亚硝酸盐氮具有一定耐受性。Y-9 为一株耐冷反硝化细菌，在
亚硝酸盐污染的养殖水体，尤其是冷水鱼类养殖水体中具有较大的应用潜力。
关键词 ： 亚硝酸盐氮 ；恶臭假单胞菌 ；水产养殖 ；好氧
DOI ：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.10.002
Identification and Denitrification Characterization of a Psychrotrophic
and Aerobic Nitrite-bacterium
He Tengxia Li Zhenlun
（Chongqing Key Laboratory of Soil Multiscale Interfacial Process，College of Resources and Environments，Southwest University，Chongqing
400716）
Abstract: The phylogeny and denitrifying characteristics of a newly isolated strain Y-9 were clarified. The psychrotrophic and aerobic
nitrite-bacterium, strain Y-9, was successfully identified based on the analysis of its morphology, phospholipid fatty acid and 16SrRNA gene
sequence analysis. Additionally, factors such as temperature, shaking speed, pH, incubation quantity, carbon source and nitrite content affecting
the aerobic denitrification ability of Y-9 strain were investigated. Results showed that the Y-9 was identified as Pseudomonas putida which
combined with three methods to identify the newly isolated strain could offer taxonomic assignment with higher confidence. A psychrotrophic
and aerobic nitrite-denitrifying strain Pseudomonas putida Y-9 exhibited high removal efficiency of nitrite and total nitrogen. The nitrite and
total nitrogen removal efficiency was up to 100% and 77.13% with 100 r/min shaking speed at 15℃. The optimal conditions of culture were
determined, including temperature 15℃, shaking speed 100 r/min, pH 7, inoculated quantity 1 mL（OD600, 0.5）bacterial suspension within
100 mL denitrification broth medium and carbon source sodium citrate. Low concentration of nitrite nitrogen could be beneficial for the strain Y-9
to perform denitrification at 15℃. Strain Y-9 was a psychrotrophic nitrite-denitrifying bacterium with optimum temperature of 15℃ and strain
Y-9 could tolerate high concentration of nitrite nitrogen, which has a great potential for removing nitrogen from aquaculture water environment,
especially in the cold circumstance.
Key words: Nitrite nitrogen ；Pseudomonas putida ；aquaculture ；aerobic
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.10192
中国是世界第一渔业大国，2013 年全国水产养
殖面积达 808.84 万 hm2，其中，淡水鱼养殖面积为
590.75 万 hm2，而且还呈逐年递增趋势［1，2］。然而，
随着集约化水产养殖的迅速发展，池塘老化、放养
密度过高以及投饲残饵过多等诸多因素引起了养殖
水体中亚硝酸盐逐年升高，这会引起水生动物血红
蛋白氧化为高铁血红蛋白，氯离子从骨骼肌和红细
胞中流失，同时扰乱细胞内外钾离子水平，影响生
物体内氧气运输，导致水生生物组织中氧含量不足、
心跳加快、呼吸急促等多种生理紊乱现象［3，4］。基
于上述亚硝酸盐危害，有研究认为养殖水体中亚硝
酸盐氮浓度不宜超过 0.2 mg/L，为确保鱼、虾、蟹
等水生动物的安全，一般将亚硝酸盐氮含量控制在
0.1 mg/L 以内，但实际养殖水体中，虾蟹池亚硝酸
盐氮含量通常都超过 0.3 mg/L［5］，有的高达 50 mg/L
甚至更高［6］，严重阻碍水产养殖的增长和发展［7］。
因此，减少或去除水产养殖水体中的亚硝酸盐已成
为一个急迫问题。目前去除水体亚硝酸盐方法包括
物理、化学和生物方法，其中物理和化学法均存在
二次污染风险 ；生物处理法因其高效低耗、无二次
污染以及经济安全等优点［8-10］而成为养殖水体亚
硝酸盐去除的首选。生物除氮包括硝化作用除氮和
反硝化作用除氮，其中反硝化除氮被认为是最有效
的除氮方式，但反硝化除氮会受很多因素限制，已
有研究表明温度、溶解氧、pH、接种量、碳源等均
会影响反硝化细菌的脱氮能力［13-16］。而低温是抑制
反硝化除氮的关键因素之一，当温度低于 20℃，细
菌的硝化和反硝化性能将会急剧下降，当温度低于
15℃时，硝化和反硝化性能会变得很微弱，当温度
低于 10℃时，将会强烈抑制硝化作用和反硝化作
用［17-19］。本研究从长期淹水的冬水田中分离获得一
株耐冷亚硝酸盐型反硝化细菌，采用形态观察，特
异性磷脂脂肪酸检测和系统进化分析对其鉴定，在
此基础上，考察不同培养条件对该菌脱氮能力的影
响，旨在为耐冷亚硝酸盐好氧反硝化细菌的实际应
用提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌株来源 新分离菌株 Y-9（本实验室分离
筛选获得）。
1.1.2 培养基 以下培养基均按照参考文献配制。
BTB 酸 碱 指 示 剂 培 养 基（bromothymol blue，
BTB）：NaNO2 1 g/L，KH2PO4 1 g/L，FeCl2·6H2O 0.5 g/L，
CaCl.7H2O 0.2 g/L，MgSO4 .7H2O 1 g/L，琥珀酸钠 8.5
g/L，琼脂 20 g/L，BTB（1.5% 溴百里酚蓝溶于无水
乙醇）1 mL，调 pH 至 7.2［20］。
反 硝 化 培 养 基［21］：乙 酸 钠 4.72 g/L，NaNO2
0.075 g/L，KH2PO4 1.5 g/L，Na2HPO4 0.42 g/L，
MgSO4·7H2O 0.1 g/L，调 pH 至 7.2。
LB 培养基 ：胰蛋白胨 10 g/L，酵母粉 5 g/L，
NaCl 10 g/L，（固体加 2.0% 的琼脂），调 pH 至 7.2。
以 上 所 有 培 养 基 均 在 0.11 MPa、121℃ 下 灭 菌 30
min，冷却后备用。
1.2 方法
1.2.1 细菌鉴定
1.2.1.1 形态学观察 将纯化的菌株划线于 BTB 培
养基上，15℃培养 48 h 后观察菌落形态，采用革兰
氏染色和电镜扫描观察细菌形态。
1.2.1.2 特异性磷脂脂肪酸鉴定 取约 40 mg 纯菌，
进行皂化、甲基化、萃取以及碱洗涤后获得上机样品，
用 Agilent 6850 气相色谱仪（FID 检测器）分析特异
性磷脂脂肪酸（Phospholipid fatty acid，PLFA）的成分。
色谱条件为 ：（25.0 m×200 μm×0.33 μm），进样量
1 μL，分流比 10∶1，载气（H2），尾吹气高纯 N2，
助燃气空气，流速 0.8 mL/min。二阶程序升高柱温 ：
170℃起始，5℃/min 升至 260℃，而后 40℃/min 升
温至 310℃，维持 1.5 min。各成分脂肪酸通过 MIDI
Sherlock 微生物鉴定系统（Version 6.1，MIDI，Inc.，
Newark，DE）进行检测，标准品购买于美国 MIDI 公
司，PLFA 用 C19∶0 作内标换算 PLFA 的绝对含量。
1.2.1.3 菌株 16S rRNA 基因序列检测 以纯化细菌
的基因组为模板，采用通用引物 27F（5-AGAGTT-
TGATCCTGGCTCAG-3） 和 1492R（5- GGTTACCT-
TGTTACGACTT-3）进行 16S rRNA 聚合酶链式反应
（PCR）扩增。扩增体系（50 μL）：模板 2 μL，27 F
和 1492 R 各 2 μL，2×Taq PCR Master Mix 25 μL，
无菌水 19 μL。扩增程序 ：94℃预变性 5 min，94℃
变性 1 min，50.5℃退火 30 s，72℃延伸 1 min，循环
2015,31(10) 193何腾霞等：耐冷好氧亚硝酸盐型反硝化细菌的鉴定及脱氮特性研究
30 次，72℃延伸 10 min。扩增获得的目的条带经切
胶回收克隆后，送 Invitrogen 公司测序。
1.2.2 细菌系统发育分析 测序结果在 NCBI 网站进
行 Blast 同源性分析，采用软件 MEGA6.0 中 Clustal
X 程 序 进 行 多 重 序 列 比 对 分 析， 通 过 Neighbor-
Joining 方法与 1 000 次 Bootstrap 的统计检验构建系
统树，以确定新分离菌的系统发育地位。
1.2.3 各 因 素 对 亚 硝 酸 氮 和 总 氮 去 除 效 果 的 影
响 将 1 mL 处于对数生长期的菌悬液（OD600 为 0.5）
分别接入装有 100 mL 反硝化培养基的 250 mL 锥形
瓶中，研究 Y-9 菌株在不同初始温度（5℃、10℃、
15℃、20℃、25℃、30℃、35℃和 40℃）、pH 值（5.0、
6.0、7.0、8.0 和 9.0）、 转 速（0、50、100、150 和
200 r/min）、碳源（柠檬酸钠、丁二酸钠、乙酸钠、
蔗糖和葡萄糖）以及不同亚硝酸盐氮浓度（10、50、
100、150 和 200 mg/L）条件下对亚硝酸盐氮和总氮
的去除能力影响，同时分析了不同接种量（1、2、3、
4 和 5 mL OD600 为 0.5 的处于对数生长期菌悬液接种
于 100 mL 反硝化培养基）对该菌脱氮能力的影响，
以上实验除了温度影响条件外均在 15℃进行，48 h
后分别测定各亚硝酸盐氮浓度和总氮浓度，并计算
亚硝酸盐氮和总氮的去除率，确定不同因素对该菌
株脱氮的影响。亚硝酸盐氮和总氮的去除率均以 ：
Rv=（T1-T2）/T1×100% 进行计算，其中 Rv 为亚硝
酸盐氮或总氮的去除率，T1 为反硝化培养基中亚硝
酸盐氮或总氮的初始浓度，T2 为培养 48 h 后亚硝酸
盐氮或总氮的终浓度。
1.2.4 检测方法 总氮浓度采用碱性过硫酸钾消解
紫外分光光度法测定［22］；亚硝酸盐氮浓度采用 N-（1-
萘基）- 乙二胺光度法测定［23］。
1.2.5 数据处理与分析 每组实验设 3 组平行，实
验结果用 x
-
±s（n=3）表示，采用 Excel、SPSS Stati-
stics17.0、MEGA6.0 和 origin8.6 软件对实验结果进行
统计分析与做图。
2 结果
2.1 形态学特征
Y-9 菌株在 BTB 培养基上 15℃好氧培养 48 h 后，
菌落凸起成圆形，表面光滑湿润，边缘整齐、不透明，
淡蓝色（图 1）；革兰氏染色为阴性（图 2）；将该菌
固定于锡箔纸上，镀金后，其电镜扫描照片如图 3
所示，菌体细胞呈杆状，无鞭毛，无芽孢，两端钝圆，
菌体表面凹凸不平。
图 1 菌株 Y-9 在 BTB 培养基生长的菌落形态
2.2 特异性磷脂脂肪酸鉴定
本研究对 Y-9 进行特异性磷脂脂肪酸鉴定的结
果如图 4 所示，该菌与 Pseudomonas-putida-biotype
A 的相似指数为 0.407，表明该菌为非典型的恶臭假
单胞菌 A 类型。
图 2 菌株 Y-9 细胞革兰氏染色图片（10×100）
图 3 电镜扫描下的 Y-9 菌株
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.10194
2.3 16S rDNA序列与系统发育分析
通过对菌株 Y-9 的 16S rRNA 基因序列进行 PCR
扩增测序，获得 1 476 bp 片段，NCBI 网站上 Blast
同 源 性 比 对 结 果 显 示， 菌 株 Y-9 与 Pseudomonas
putida 相似性高达 99%，采用 MEGA6.0 构建进化树
（图 5）可看出，Y-9 与 Pseudomonas putida 类群聚集
在一起。通过形态学、磷脂脂肪酸和 16S rRNA 基因
序列分析，其鉴定结果一致，表明将菌株 Y-9 鉴定
为恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）具有高度的
图 4 特异性磷脂脂肪酸的鉴定结果
76
51
99
99
82
83
Pseudomonas oryzihabitans Cl-13 KC178587
Pseudomonas putida IHB B 1369 GU186116
Pseudomonas putida POS-F84 GU208206
Pseudomonas putida CE1 JN786882
Pseudomonas putida DE5 JQ435693
Pseudomonas putida ATCC 12633 NR—114479
Pseudomonas putida SAs-14 JQ782896
Pseudomonas putida CDd-9 GU248219
Pseudomonas plecoglossicida IHBB1544 KF475839
Pseudomonas monteilii SB 3067 GU191931
Pseudomonas plecoglossicida PSG1 KF661549 Y-9 strain
0.001
图 5 菌株 Y-9 的系统发育进化树
可靠性。
2.4 温度对脱氮能力的影响
温度对菌株 Y-9 去除反硝化培养基中亚硝酸盐
氮和总氮效果的影响如图 6 所示，当温度由 5℃上
升至 15℃时，其反硝化作用去除亚硝酸盐氮和总氮
的效率随着温度的上升而增加到最大值，达到 100%
和 55.51% ；当温度在 20℃至 35℃之间时，亚硝酸
盐氮和总氮去除率没有明显的变化 ；当温度上升至
40℃，亚硝酸盐氮和总氮的去除率被强烈抑制，这
可能是高温破坏或抑制酶催化反应过程，导致强烈
抑制了该菌株的反硝化脱氮能力。
2.5 pH对脱氮能力的影响
本实验比较了 5 个不同初始 pH 值对菌株 Y-9
脱氮影响，结果如图 7 所示，pH 值在 6 以下时，会
完全抑制该菌的反硝化活性 ；当 pH 值增加到 7 时，
其亚硝酸盐氮和总氮去除率最大，48 h 内其去除率
分别达到了 100% 和 59.97% ；当 pH 值继续增加至 9
时，亚硝酸盐氮去除率没有显著变化，但总氮去除
率下降至 38.30%，表明该菌脱氮的最佳 pH 条件为
0
0 5 10 15 20ᓖć25 30 35 40 452040
60৫䲔⦷% 80100
图 6 温度对菌株 Y-9 去除氮的影响
中性，过酸或过碱都会影响反硝化作用的进行，但
酸性环境对反硝化作用的抑制强度显著大于碱性环
境，表明该菌对碱性环境条件具有一定的耐受性。
反硝化作用是一个产碱的过程，因此在中性环境条
件下，无需人工提高环境中 pH 条件即可满足反硝
化作用的顺利进行。
2015,31(10) 195何腾霞等：耐冷好氧亚硝酸盐型反硝化细菌的鉴定及脱氮特性研究
2.6 接种量对脱氮能力的影响
接种量对 Y-9 去除亚硝酸盐氮和总氮的影响如
图 8 所示，OD600 为 0.5 的 1 mL 对数生长期菌液接入
100 mL 反硝化培养基中时，在 15℃、48 h 内对亚硝
酸盐氮和总氮去除率分别达到了 100% 和 54.80%。
随着接种量的逐步增加，Y-9 菌株对亚硝酸盐氮的
去除率没有显著影响，而对总氮的去除率连续降低，
当接种量为 5 mL 时，菌株 Y-9 对总氮的去除率显著
低于 1mL 接种量，仅为 25% 左右。
和总氮去除率均有影响，以蔗糖为碳源时，培养液
比较清澈，亚硝酸盐氮和总氮去除率低 ；以葡萄糖
为碳源时，培养液的浑浊度显著提高，能 100% 地
去除亚硝酸盐氮，但对总氮的去除率只有 18.27%，
表明蔗糖和葡萄糖显著降低 Y-9 菌株的脱氮能力。
比较 5 种不同碳源对亚硝酸盐氮和总氮的去除效率，
柠檬酸钠为 Y-9 的最佳碳源，在以柠檬酸钠为唯一
碳源的反硝化培养基中，该菌对亚硝酸盐氮和总氮
的去除率分别高达到 100% 和 66.57%。0
5 6 7
pH
8 9
20
40
60৫䲔⦷% 80100 ᙫ≞ӊ⺍䞨ⴀ≞
图 7 pH 对菌株 Y-9 去除氮的影响
20
1 2 3᧕⿽䟿mL 4 530406050৫䲔⦷
%
80
70
90
100 ᙫ≞ӊ⺍䞨ⴀ≞
图 8 接种量对菌株 Y-9 除氮的影响
2.7 碳源对反硝化能力的影响
本实验研究了 5 种碳源对菌株 Y-9 去除亚硝酸
盐氮和总氮的影响，结果如图 9 所示，表明 Y-9 菌
株能利用柠檬酸钠、丁二酸钠和乙酸钠有效去除亚
硝酸盐氮和总氮。但不同种类的碳源对亚硝酸盐氮
0 Ḑ⃜䞨䫐 бҼ䞨䫐 ҉䞨䫐⻣Ⓚ 㭇㌆ 㪑㨴㌆204060৫䲔⦷%
80
100 ᙫ≞ӊ⺍䞨ⴀ≞
图 9 碳源对菌株 Y-9 除氮的影响
2.8 亚硝酸盐浓度对反硝化能力的影响
本实验比较了 5 个亚硝酸盐氮浓度对菌株 Y-9
脱 氮 能 力 影 响， 如 图 10 所 示， 亚 硝 酸 盐 氮 为 10
mg/L 时，Y-9 对亚硝酸盐氮和总氮的去除率分别
为 100% 和 55.52%，随着亚硝酸盐氮浓度不断升高
至 200 mg/L 时，对亚硝酸盐氮和总氮的去除率持续
20
0 50 100ӊ⺍䞨ⴀ≞⎃ᓖ mg·L-1 150 2004060
80৫䲔⦷% 100 ᙫ≞ӊ⺍䞨ⴀ≞
图 10 亚硝酸盐氮对菌株 Y-9 除氮的影响
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.10196
下降至 22.69% 和 21.44%。由此可见，高浓度亚硝
酸盐会抑制 Y-9 的脱氮能力，但即使在 200 mg/L 的
亚硝酸盐氮浓度下，Y-9 仍具有一定的反硝化活性。
因此，该菌对亚硝酸盐的耐受程度完全能够满足养
殖水体除氮要求，对治理养殖水中亚硝酸盐污染具
有很大的应用潜力。
2.9 溶解氧对脱氮能力的影响
为了研究溶解氧对菌株 Y-9 脱氮能力的影响，
设置了 5 个不同转速，于 15℃条件下考察该菌对亚
硝酸盐氮和总氮的去除效果，结果如图 11 所示。当
静止培养时，亚硝酸盐氮和总氮去除率均较低，表
明低溶解氧会限制细菌的生长以及脱氮能力的发挥；
随着转速的增大，亚硝酸盐氮和总氮的去除速率迅
速增加，当转速增加至 100 r/min 时，亚硝酸盐氮和
总氮的去除率分别达到 100% 和 77.13%，继续增大
转速时，亚硝酸盐氮的去除率不再发生变化，但总
氮去除率显著下降，但高溶解氧如何抑制 Y-9 的脱
氮作用有待进一步研究。
菌的一个重要指标。本实验结合形态学观察、特异
性磷脂脂肪酸检测和 16S rRNA 基因测序分析，一致
确定菌株 Y-9 为恶臭假单胞菌。然而，菌株 Y-9 在
BTB培养基上生长菌落颜色呈现出淡蓝色，与郑佳
佳等［28］报道恶臭假单胞菌在该培养基上生长菌落
颜色为米黄色具有明显差异 ；菌株 Y-9 不具有鞭毛，
这显著不同于李怡等［29］报道的恶臭假单胞菌 M6 具
有端生鞭毛的特点，这可能与生长的环境条件不同
有关。
微生物去除水体中的亚硝酸盐会受很多因素的
限制，其中温度是影响细菌活性与功能的重要环境
条件之一，只有在适宜温度条件下，反硝化细菌才
会表现出良好的反硝化能力［30］。本实验研究温度对
菌株 Y-9 脱氮能力的影响发现，该菌脱氮的最适温
度比已报道的假单胞菌属反硝化细菌脱氮温度低，
脱氮效率高［24，31-33］，适合初冬至春末阶段养殖水体
亚硝酸盐污染处理。此外，pH 值不仅影响细胞内的
电解质平衡，而且还影响溶液中营养物质或抑制物
质的浓度，从而直接或间接影响微生物的活性［34］，
养殖水体的 pH 一般为中性或偏碱性，菌株 Y-9 适
宜的脱氮 pH 条件非常适合治理养殖水体。
接种量也是影响反硝化脱氮的一个重要因素，
接种量不足，在短时间内很难达到理想的反硝化脱
氮效果 ；接种量过大时，会引起细菌死亡而导致总
氮去除不显著。本实验结果表明，接种量对菌株 Y-9
脱氮能力的影响与周莉等［35］报道不一致，他们的
研究结果表明假单胞菌属的反硝化能力会随着接种
量增加而增加。但张文艺等［36］对假单胞菌属 N1 和
H1 研究结果表明，过大的投菌量会使细菌对硝酸
盐氮和总氮的去除率均下降，其原因可能是碳源不
足使细菌提前进入衰亡期或者缺氧导致不适宜细菌
生长。本研究与之不同的是接种量并不显著影响亚
硝酸盐氮的去除率，只降低菌株 Y-9 对总氮的去除
率 ；碳源在反硝化过程中作为细胞生长的能源和反
硝化作用脱氮的电子供体，会直接或间接影响细胞
生长繁殖和功能基因的表达，前人研究认为不同种
类的碳源至少会影响一氧化二氮还原酶的活性［37］。
因此，研究碳源对微生物脱氮的影响具有重要的意
义。王慧聪等［7］、李慧颖等［38］和李兵等［39］的研究
认均为乙酸盐为反硝化脱氮的最佳碳源，而本研究
20
0 50 100䖜䙏 r·min-1 150 2004060
80৫䲔⦷% 100 ᙫ≞ӊ⺍䞨ⴀ≞
图 11 转速对菌株 Y-9 除氮的影响
3 讨论
在进行细菌鉴定分类时，单一鉴定方法准确性
相对较差，多种鉴定方法相结合可以使鉴定结果更
加科学、准确和可靠。磷脂脂肪酸是细胞膜的主要
成分之一，在不同种生物细胞膜上具有特异性，同
种生物细胞膜上比较恒定，可利用气相色谱简单、
快速、灵敏且精确地检测细胞上所特有的磷脂脂肪
酸种类［24-27］，因而磷脂脂肪酸已成为鉴定细菌和真
2015,31(10) 197何腾霞等：耐冷好氧亚硝酸盐型反硝化细菌的鉴定及脱氮特性研究
结果表明，菌株 Y-9 能利用多种碳源进行反硝化脱
氮作用，其最佳碳源柠檬酸钠。众所周知，亚硝酸
盐是一种强烈的有毒物质，已有研究表明亚硝酸盐
对水生动物、两栖动物、哺乳动物等均具有毒害作
用［40-42］，但对微生物的毒害作用还鲜见报道。本研
究结果表明高浓度的亚硝酸盐对菌株 Y-9 的脱氮能
力具有强烈的抑制作用，但并不会引起细菌大量死
亡，该菌对亚硝酸盐浓度耐受程度完全能够满足治
理水产养殖水体的要求。此外，在好氧反硝化过程中，
溶解氧可作为电子受体，竞争性地抑制亚硝酸盐氮
的还原，而且溶解氧还会抑制一氧化二氮还原酶的
活性，导致 N2O 大量溢出，产生温室效应
［33，43-45］，
因此，在实际污水处理过程中适当的控制溶解氧具
有现实意义。菌株 Y-9 对溶解氧的需求并不十分严
格，如需在短时间内降低水环境中的亚硝酸盐氮，
将溶解氧控制在 100 r/min 所对应的溶解氧水平条件
下最理想 ；如有特殊情况，无需在短时间内去除亚
硝酸盐，在低溶解氧或高溶解条件下延长反硝化脱
氮时间也许会达到同样的效果，但其脱氮产物仍需
进一步研究。
4 结论
通过形态学、特异性磷脂脂肪酸检测和 16S
rRNA 基因序列分析，将实验室分离获得的 Y-9 菌株
鉴定为恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）。
菌株 Y-9 的反硝化作用最适温度为 15℃，是一
株耐冷反硝化细菌，对溶解氧具有一定耐受性，其
最佳溶解氧水平对应转速为 100 r/min，在该溶解氧
水平下，15℃、48 h 内对亚硝酸盐氮和总氮的去除
率高达 100% 和 77.13%，最佳 pH 为 7，对碱性环
境条件的耐受性高于酸性环境，最佳接种量为 1 mL
（OD600 为 0.5），最佳碳源为柠檬酸钠，但能利用多
种碳源进行细胞生长和反硝化脱氮作用，适合治理
低浓度的亚硝酸盐氮污染水体。
参 考 文 献
［1］赵永锋 , 胡海彦 , 蒋高中 , 等 . 我国大宗淡水鱼的发展现状及趋
势研究［J］. 中国渔业经济 , 2012, 30（5）：91-99.
［2］董金和 . 《 2013 中国渔业统计年鉴》 解读［J］. 中国水产 ,
2013（7）：19-20.
［3］Jensen FB. Nitrite disrupts multiple physiological functions in
aquatic animals［J］. Comp Biochem Phys A, 2003, 135（1）：9-24.
［4］Lewis WM, Morris DP. Toxicity of nitrite to fish ：a review［J］. T
Am Fish Soc, 1986, 115（2）：183-195.
［5］凌歌 . 一种亚硝酸盐降解新方案及其在水产养殖上的应用［J］.
渔业致富指南 , 2010（12）：27-28.
［6］洪美玲 , 陈立侨 , 孙新谨 , 等 . 亚硝酸盐急性胁迫对中华绒螯蟹
幼体相关免疫指标和应激蛋白（HSP70）表达的影响［J］. 应
用与环境生物学报 , 2011, 17（5）：688-693.
［7］王会聪 , 曹海鹏 , 何珊 , 等 . 一株亚硝酸盐降解菌的分离鉴定与
系统发育分析［J］. 环境污染与防治 , 2012, 34（4）：32-36.
［8］周超 , 高乃云 , 楚文海 , 等 . 水体中亚硝酸盐生物毒性和去除的
研究进展［J］. 给水排水 , 2011, 37（5）：104-108.
［9］赵翠娟 , 宋文军 , 朱高雄 , 等 . 除氨氮菌在污水处理中的研究进
展［J］. 生物技术通报 , 2013（2）：31-34.
［10］ Layva-Diaz JC, Gonzalez-Martinez A, Gonzalez-Lopez J, et al.
Kinetic modeling and microbiological study of two-step nitrification
in a membrane bioreactor and hybrid moving bed biofilm reactor-
membrane bioreactor for wastewater treatment［J］. Chem Eng J,
2015, 259 ：692-702.
［11］Zhu G, Peng Y, Li B, et al. Biological removal of nitrogen from
wastewater［M］. Rev Environ Contam T, 2008, 192 ：159-195.
［12］Yu L, Liu YJ, Wang GJ. Identification of novel denitrifying bacteria
Stenotrophomonas sp. ZZ15 and Oceanimonas sp. YC13 and
application for removal of nitrate from industrial wastewater［J］.
Biodegradation, 2009, 20（3）：391-400.
［13］Guo L, Chen Q, Fang F, et al. Application potential of a newly
isolated indigenous aerobic denitrifier for nitrate and ammonium
removal of eutrophic lake water［J］. Bioresour Technol, 2013,
142 ：45-51.
［14］Čuhel J, Šimek M, Laughlin RJ, et al. Insights into the effect of soil
pH on N2O and N2 emissions and denitrifier community size and
activity［J］. Appl Environ Microb, 2010, 76（6）：1870-1878.
［15］Ellis S, Howe MT, Goulding KWT, et al. Carbon and nitrogen
dynamics in a grassland soil with varying pH ：Effect of pH
on the denitrification potential and dynamics of the reduction
enzymes［J］. Soil Biol Biochem, 1998, 30（3）：359-367.
［16］Ji B, Wang H, Yang K. Tolerance of an aerobic denitrifier
（Pseudomonas stutzeri）to high O2 concentrations［J］. Biotechnol
Lett, 2014, 36（4）：719-722.
［17］Kroupova H, Machova J, Svobodova Z. Nitrite influence on fish ：a
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.10198
review［J］. Vet Med-Czech, 2005, 50（11）：461.
［18］Rodriguez-Caballero A, Hallin S, Pahlson C, et al. Ammonia
oxidizing bacterial community composition and process
performance in wastewater treatment plants under low temperature
conditions［J］. Water Sci Technol, 2012, 65（2）：197-204.
［19］陈忠祥 , 曹广斌 , 杨谦 , 等 . 低温硝化细菌的筛选及降解特
性［J］. 江苏农业科学 , 2011, 39（4）：284-286.
［20］邵晴 , 余晓斌 . 好氧反硝化细菌的筛选及反硝化特性研究［J］.
生物技术 , 2008, 18（3）：63-65.
［21］Song ZF, An J, Fu GH, et al. Isolation and characterization of
an aerobic denitrifying Bacillus sp. YX-6 from shrimp culture
ponds［J］. Aquaculture, 2011, 319（1）：188-193.
［22］中华人民共和国环境保护部 . 水质总氮的测定碱性过硫酸钾
消解紫外分光光度法（HJ636-2012）［S］. 2012.
［23］ 魏复盛 , 毕彤 , 齐文启 . 水和废水检测分析方法［M］. 第 4 版 .
北京 ：中国环境科学出版社 .
［24］张国赏 , 吴文鹃 , 潘仁瑞 . 气相色谱—质谱法检测细胞脂肪酸
及其在细菌鉴定上的应用［J］. 合肥联合大学学报 , 2005, 10
（4）：92-96.
［25］蓝江林 , 刘波 , 陈璐 , 等 . 芭蕉属植物内生细菌磷脂脂肪酸
（PLFA）生物标记特性研究［J］. 中国农业科学 , 2010, 43（10）：
2045-2055.
［26］ Pratt B, Riesen R, Johnston CG. PLFA analyses of microbial
communities associated with PAH-contaminated riverbank
sediment［J］. Microbial Ecol, 2012, 64（3）：680-691.
［27］Trögl J, Jirková I, Zemánková P, et al. Estimation of the quantity
of bacteria encapsulated in Lentikats Biocatalyst via phospholipid
fatty acids content ：a preliminary study［J］. Folia Microbiol,
2013, 58（2）：135-140.
［28］李怡 , 何珊 , 曹海鹏 , 等 . 孔雀石绿脱色恶臭假单胞菌菌株 M6
的分离、鉴定及其生长特性研究［J］. 微生物学通报 , 2009,
36（1）：57-63.
［29］郑佳佳 , 沈涛 , 傅罗琴 , 等 . 一株硝化反硝化细菌 Pseudomonas
putida F6 的筛选鉴定及反硝化特性研究［J］. 水生生物学报 ,
2012, 36（1）：1-12.
［30］杨小龙 , 李文明 , 陈燕 , 等 . 一株好氧反硝化菌的分离鉴定及
其除氮特性［J］. 微生物学报 , 2011, 51（8）：1062-1070.
［31］李焱生 , 魏民 , 张艾晓 , 等 . 一株异养型亚硝酸盐氧化细菌的
分离及其降解特性的研究［J］. 生物技术通报 , 2010（5）：
196-202.
［32］ Ridgway HF, Safarik J, Phipps D, et al. Identification and catabolic
activity of well-derived gasoline-degrading bacteria from a contami-
nated aquifer［J］. Appl Environ Microb, 1990, 56 ：3565-3575.
［33］ Bonin P, Gilewicz M. A direct demonstration of “co-respiration”
of oxygen and nitrogen oxides by Pseudomonas nautica ：some
spectral and kinetic properties of the respiratory components［J］.
Fems Microbial Lett, 1991, 80（2）：183-188.
［34］杨洋 , 左剑恶 , 沈平 , 等 . 温度、pH 值和有机物对厌氧氨氧化
污泥活性的影响［J］. 环境科学 , 2006, 27（4）：692-695.
［35］周莉 , 汤江武 , 等 . 好养反硝化细菌的筛选鉴定及其反硝化反
应条件优化［J］. 浙江农业学报 , 2011, 23（5）：942-947.
［36］张文艺 , 陆丽巧 , 姚立荣 , 等 . AF 反应器中好氧反硝化细菌的
筛选分离及硝化特性的研究［J］. 中国农村水利水电 , 2011, 1：
59-64.
［37］傅利剑 , 郭丹钊 , 史春龙 , 等 . 碳源及碳氮比对异养反硝化微
生物异养反硝化作用的影响［J］. 农村生态环境 , 2005, 21（2）：
42-45.
［38］李慧颖 , 黄少斌 , 范利荣 , 等 . 一株好氧反硝化菌的反硝化性
能研究［J］. 环境科学与技术 , 2009, 32（8）：9-12.
［39］ 李兵 , 林炜铁 . 1 株好氧反硝化芽孢杆菌的脱氮特性研究［J］.
水生态学杂志 , 2009, 2（3）：48-52.
［40］Lemis WM, Morris DP. Toxicity of nitrite to fish - a review［J］. T
Am Fish Soc, 1986, 115（2）：183-195.
［41］Jensen FB, Hansen MN. Differential uptake and metabolism of
nitrite in normoxic and hypoxic goldfish［J］. Aquat Toxicol,
2011, 101（2）：318-325.
［42］Ozen H, Kamber U, Karaman M, et al. Histopathologic, biochemical
and genotoxic investigations on chronic sodium nitrite toxicity
mice［J］. Exp Toxicol Pathol, 2014, 66（8）：367-375.
［43］Shinn C, Marco A, Serrano L. Influence of low levels of water
salinity of nitrite to anuran larvae［J］. Chemosphere, 2013, 92（9）：
1154-1160.
［44］于爱茸 , 李尤 , 俞吉安 . 一株耐氧反硝化细菌的筛选及脱氮特
性研究［J］. 微生物学杂志 , 2005, 25（3）：77-81.
［45］ Bernat K, Wojnowska I. Carbon source in aerobic denitrification
［J］. Biochem Eng J, 2007, 36（2）：116-122.
（责任编辑 马鑫）