全 文 ：·研究报告·
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2012年第10期
收稿日期 : 2012-03-17
基金项目 : 国家自然科学基金项目（30770106），国家自然科学基金重大研究计划面上项目（90608024），广东省自然科学基金项目（06025162）
作者简介 : 李婧惠 , 女 , 硕士 , 研究方向 : 微生物学 ; E-mail: mjxdmn@163.com
人巨细胞病毒（human cytomegalovirus，HCMV）
是疱疹病毒科 β 亚科中基因组最大的 DNA 病毒，其
基因组为 235 kb，所编码的蛋白质超过 200 种，具
有种属特异性［1］。在发达国家人群感染率为 40%-
60%，而在发展中国家几乎达到 100%［2］。近年来，
随着免疫低下状态人群（如艾滋病、恶性肿瘤和器
官移植等患者）的增多，HCMV 感染及其引发疾病
的日益增加，人们对人巨细胞病毒的分子生物学、
流行病学、治疗与预防研究愈加重视［3］。随着多
人巨细胞病毒编码蛋白 pUL23在 E. coli BL21（DE3）
中的表达和纯化
李婧惠 刘明亮 李继东 张忠明 冉艳红 周天鸿 李弘剑
（暨南大学生命科学技术学院，广州 510632）
摘 要： 大肠杆菌中高效表达携带组氨酸标签的人巨细胞病毒皮层蛋白 pUL23，并进行纯化以及鉴定。提取感染 HCMV
Towne病毒株的 HFF细胞的总 RNA，逆转录为 cDNA作为模板，经 PCR获得 UL23的基因片段，将此片段插入表达载体 pET-28a
（+），构建 pET28a（+）-UL23重组质粒。将 pET28a（+）-UL23转化至大肠杆菌 BL21（DE3），进行 IPTG 诱导表达。表达产物经
Western blotting分析后进行发酵，再用 Ni sepharose亲和层析纯化，纯化产物进行 SDS-PAGE和Western blotting检测。结果表明，
成功构建 pET28a（+）-UL23原核表达载体，表达及纯化了 His-pUL23 融合蛋白，为进一步研究 pUL23奠定基础。
关键词： 人巨细胞病毒 pUL23 原核表达 纯化 组氨酸标签
Expression and Purification of Human Cytomegalovirus Encoding
Protein pUL23 in E. coli BL21（DE3）
Li Jinghui Liu Mingliang Li Jidong Zhang Zhongming Ran Yanhong Zhou Tianhong Li Hongjian
（College of Life Science and Technology，Jinan University，Guangzhou 510632）
Abstract: To express and purify human cytomegalovirus encoding protein pUL23 with His-tag in E. coli BL21（DE3）. Extracting the
RNA of HFF cells which infected HCMV Towne virus strains and reverse transcribed it into cDNA. Using PCR and recombinant DNA technology,
UL23 gene sequence was amplified from cDNA and inserted into the prokaryotic expression vector pET-28a（+）. The recombinant plasmid was
then transformed into E. coli BL21（DE3） and induced with IPTG. After fermentation the His-pUL23 was purified by affinity chromatography
using Ni-NTA column and it was analyzed by SDS-PAGE and Western blotting. The result shows that we successfully constructed the pET28a
（+）-UL23 recombinant plasmid, produced and purified the His-pUL23 fusion protein, which would lay a foundation for further research of
pUL23 protein．
Key words: HCMV pUL23 Prokaryotic expression Purification His-tag
个 HCMV 病毒株的完整基因组核苷酸序列分析的完
成［4， 5］，HCMV 分子病毒学研究的重点逐渐进入到
功能基因组学。研究的焦点也主要集中于病毒基因
编码产物的功能、病毒自身编码蛋白之间及病毒与
宿主蛋白之间相互作用的机制及病毒感染过程的调
控等领域。
人巨细胞病毒（HCMV）UL23 基因，属病毒
US22 基因家族成员，编码病毒皮层蛋白，该基因缺
失时，病毒在人包皮成纤维细胞（HFF）中的繁殖
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第10期120
速度加快［6］，这种病毒自身蛋白抑制病毒生长的现
象引起了人们对 UL23 基因及其产物功能进行深入
研究的兴趣。本研究通过构建 pET28a（+）-pUL23
原核表达载体及在大肠杆菌中的高效表达融合蛋白
pUL23，旨在为进一步研究和应用奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌株、细胞株、病毒株和质粒 大肠杆菌 E.
coli DH5α、E. coli BL21（DE3）为本实验室保存 ；
人包皮成纤维细胞细胞（HFF 细胞）购自 Cascade
Biologics 公司 ；人巨细胞疱疹病毒（HCMV）Towne
株为加州大学伯克利分校刘奋勇实验室馈赠 ；质粒
载体 pET-28a（+）购自美国 Promega 公司。
1.1.2 培养基 大肠杆菌培养基 LB 的配制参见分
子克隆操作指南 ；硫酸卡那霉素在 LB 培养基中使
用浓度为 50 μg/mL ；HFF 细胞所用 DMEM 培养基购
自 Gibico 公司。
1.1.3 工具酶和生化试剂 限制性内切酶、T4
DNA 连接酶等均购自 TaKaRa 公司 ；IPTG 购自北
京鼎国生物技术有限公司 ；Pfu DNA 聚合酶购自上
海生物工程公司 ；质粒抽提试剂盒购自 Omega 公
司 ；抗 His 单克隆抗体购自 Invitrogen 公司 ；引物
合成与测序由上海生工生物工程技术服务有限公司
完成。
1.1.4 仪器 T1 Thermocycler型 PCR仪购自BIOME-
TRA 公司 ；凝胶成像仪购自 Muli Genius 公司 ；半干
转印仪自 Bio-Rad 公司 ；CK40 型倒置荧光显微镜购
自 OLYMPUS 公司 ；CO2 培养箱购自 Thermo 公司 ；
Ni-NTA 树脂购自 QIAGEN 公司。
1.2 方法
1.2.1 UL23 基因的获得 将生长良好的人包皮成纤
维细胞（HFF）弃细胞培养液，用胰酶消化后，传
到 25 cm2 细胞瓶培养。待细胞密度达到 100% 后，
把适量 HCMV（Towne 株）接种于 HFF 细胞，加新
鲜细胞维持液（含 5% 胎牛血清）于 5% CO2、37℃
细胞培养箱中培养。培养 4 d 后，弃细胞培养液，
HFF 细胞用 Trizol 进行消化、裂解，Trizol 体积按
10 cm2/mL 比例加入。室温放置 5 min，使其充分裂
解，并收集裂解液于 1.5 mL EP 管中，12 000 r/min
离心 5 min，弃沉淀 ；按 200 μL 氯仿 /mL Trizol 加入
氯仿，振荡混匀 15 min，室温放置 15 min；4℃ 8 000
r/min 离心 15 min 后，吸取上层水相，至另一离心
管中 ；按 0.5 mL 异丙醇 /mL Trizol 加入异丙醇混匀，
室温放置 5-10 min ；4℃ 8 000 r/min 离心 10 min，弃
上清，RNA 沉于管底 ；按 1 mL 75% 乙醇 /mL Trizol
加入 75% 乙醇，温和振荡离心管，悬浮沉淀 ；4℃
5 000 r/min 离心 5 min，尽量弃上清 ；室温晾干或真
空干燥5-10 min 后用 50 μL DEPC水溶解RNA样品，
55-60℃放置 5-10 min。然后用琼脂糖凝胶电泳检测
抽提的细胞总 RNA 的完整性。将感染 HCMV Towne
病毒株的 HFF 细胞的总 RNA 逆转录为 cDNA 作为
后续 PCR 试验的模板。
1.2.2 pET28a（+）-UL23 表达载体的构建 根据
pET-28a（+）载体上的多克隆位点设计引物。上游
引 物 ：5-GAAGAATTCGCCACCATGTCGGTAATCAA
GGACTGTTTTC-3，酶切位点为 EcoR I ；下游引物 ：
5-GAACTCGAGCGCGTCGTCAAAAAGTTGGTGG-3，
酶切位点为 Xho I。以 cDNA 为模板扩增 UL23 基因，
扩增产物用 EcoR I，Xho I 双酶切后与纯化后的 pET-
28a （+） 载体进行连接，然后转化 E. coli DH5α 中，
在含有 50 μg/mL 硫酸卡那霉素的 LB 琼脂平板上挑
选转化子。转化子提质粒后进行酶切鉴定，并送上
海生工进行测序验证。
1.2.3 pET28a（+）-UL23 在大肠杆菌中表达鉴定
将重组载体 pET28a（+）-UL23 转化大肠杆菌 BL21
（DE3）中，37℃过夜培养后挑取单菌落。在 4 mL
LB 培养液中 37℃振荡培养过夜，次日取 20 μL 上
述菌液，转种 4 mL LB 培养基中 37℃培养，待菌液
OD600 约为 0.6-1.0 时，取 1 mL 作为阴性对照，剩余
菌液加入异丙基 -β-硫代半乳糖（IPTG），使其终浓
图 1 pET-28a（+）的多克隆位点图谱
2012年第10期 121李婧惠等：人巨细胞病毒编码蛋白pUL23在 E. coli BL21（DE3）中的表达和纯化
度为 0.06 mmol/L，诱导 4 h ；离心收集菌体，加入
50 μL 1×SDS 缓冲液裂解，100℃煮 10 min 后各取
10 μL 进行 SDS-PAGE 电泳和 Western blotting 分析目
的蛋白表达情况。
1.2.4 融合蛋白重组表达菌株的发酵 取已转入重
组表达载体的大肠杆菌 BL21（DE3）接种于 4 mL
LB 培养基中，200 r/min，37℃振荡培养 5 h，用含
硫酸卡那霉素营养琼脂平板划线分离，37℃培养 12
h 从平板上挑选单菌落接种于 4 mL LB 培养基中，
37℃，200 r/min 振荡培养 12 h。将上述一级种子接
种于 200 mL 摇瓶培养基 6 h，然后接入发酵罐发酵。
发酵培养条件为 ：初始 pH7.0，硫酸卡那霉素的浓
度 50 μg/mL，37℃、200 r/min 振荡培养。然后接种
于 5 L 发酵罐中发酵，接种量为 1%（V/V）。待菌
体进入对数生长期后，加入 0.6 mmol/L IPTG 诱导，
4 h 后放罐。放罐后 6 000 r/min 离心 20 min 收集菌
体，-20℃冻存，冻融后菌液容易裂解。
1.2.5 表达菌体的裂解 根据需要，称取适量冻融
后的菌体，按 0.1 g/mL 的浓度加入含 10 mmol/L 咪
唑的 Lysis Buffer，混匀后放置 30-60 min，用玻璃棒
充分搅拌菌体裂解液，将 60 mL 菌液装入 100 mL 的
离心管中，置于冰水浴中超声波破碎，破碎条件为
工作 5 s，停止 5 s，20 min，功率 400 W。菌体破碎
完成后 4℃低温 10 000 r/min 离心 30 min，收集上清。
1.2.6 His-pUL23 融合蛋白纯化及鉴定 将 50 mL
Ni-NTA 树脂加入 2.5×25 cm 的层析柱中，使树脂
在重力作用下自然沉降 ；打开核酸蛋白检测仪，预
热 1 h ；用约 2 倍柱床体积的含 10 mmol/L 咪唑的
Lysis Buffer 平衡 Ni-NTA 柱，待检测仪上的示数稳
定后，旋转广度按钮，调节光度为 100，待示数稳
定在 100 后，将调零旋钮调至 0.5 ；柱床平衡完毕
后，将破碎菌体的上清 200 mL，用恒流泵上样，流
速 4 mL/min，His-pUL23 融合蛋白将通过 6 个组氨
酸结合在 Ni-NTA 柱上 ；上样完毕后，用 10 mmol/L
咪唑的 Lysis Buffer 洗涤柱床，直至蛋白检测仪上的
基线水平 ；先用 40 mmol/L 咪唑 Lysis Buffer 洗脱柱
子，以去除一些非特异性结合的杂蛋白 ；然后用含
250 mmol/L 咪唑的 Lysis Buffer 洗脱柱子，直至带有
组氨酸标签的目的融合蛋白完全洗脱下来，取少量
4℃保存待鉴定 ；用 3 倍柱体积的含 1 mol/L 咪唑的
Lysis Buffer 冲洗 Ni-NTA 柱，将残留在柱上的蛋白
和其他杂质全部洗脱下来 ；用 5 倍的去离子水冲洗
Ni-NTA 柱 ；用 3 倍体积的乙醇溶液冲洗 Ni-NTA 柱，
4℃存贮 Ni-NTA 柱。利用 SDS-PAGE 电泳及 Western
blotting 分析蛋白的纯化情况。
2 结果
2.1 UL23基因的获得
用 HCMV-Towne 株感染 HFF 细胞，感染后病毒
生长状态良好（图 2）。4 d 后收集病毒提取细胞总
RNA，琼脂糖凝胶电泳检测结果显示 RNA 完整性较
好（图 3），可用于逆转录。
图 3 RNA抽提琼脂糖凝胶电泳检测
1, 2. 病毒感染 4 d 后 HFF 细胞总 RNA
图 2 Towne病毒株感染 HFF细胞
A. 病毒感染 4 d 后病毒繁殖情况； B. 病毒感染 4 d 后细胞生长状况
2.2 pET28a（+）-UL23表达载体的构建
将感染 HCMV Towne 病毒株的 HFF 细胞的总
RNA，逆转录为 cDNA 作为模板，经进行 PCR 扩增，
得到预期大小的 PCR 产物（图 4-A），然后连入载体
pET-28a（+）中，构建重组质粒 pET28a（+）-UL23。
转化大肠杆菌 DH5α 后，挑取单菌落，进行重组质粒
的 EcoR I，Xho I 双酶切鉴定（图 4-B）。鉴定正确后
送往上海生工生物工程技术服务有限公司进行测序，
测序正确后表明 pUL23 基因成功插入了 pET-28a
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第10期122
（+）质粒。将获得的重组表达质粒命名为 pET28a
（+）-UL23。将重组表达质粒转化 E. coli BL21（DE3）
感受态细胞，获得 E. coli BL21（DE3）/pET28a（+）-
UL23 菌株。
一条分子量约 33 kD 的清晰区带，这一分子量与融
合蛋白的分子量相吻合，与预期结果相符。进行灰
度扫描后，所得融合蛋白的纯度大于 90%。
1,2. UL23 的 PCR 产物 ；3. 阴性对照 ；4，5. pET28a（+）-UL23 经
EcoR I 和 Xho I 酶切后的产物 ；M.DS5000 分子量标准
图 4 UL23的 PCR扩增图（A）及 pET28a（+）-UL23
酶切鉴定图（B）
2.3 pET28a（+）-UL23在大肠杆菌中表达鉴定
以 0.06 mmol/L IPTG 诱导 4 h 后，用抗 His-tag
进行 Western blotting 检测。在约 33 kD 处有一明显
杂交条带（图 5），表明该特异条带为组氨酸标签的
pUL23 蛋白。
M. 蛋白 Marker ；1. 未诱导 ；2. IPTG 诱导
图 5 IPTG诱导 His-pUL23融合蛋白表达
2.4 组氨酸标签的 pUL23蛋白的纯化
将 pUL23 表达菌株 E. coli BL21（DE3）/pET28a
（+）-UL23 接种于 5 L 的发酵罐中发酵，发酵完成后
收集菌体。超声波破碎后用 Ni-NTA 柱进行亲和纯
化，然后收集目的蛋白。用 SDS-PAGE 电泳（图 6-A）
和 Western blotting（图 6-B）进行检测，纯化后仅有
图 6 His-pUL23融合蛋白的纯化（A）及Western
blotting检测（B）
1. 纯化后的 His-pUL23 融合蛋白的考马斯亮蓝染色 ；M1. 非预染蛋
白 Marker ：2. 纯化后 His-pUL23 融合蛋白 ；M2. 预染蛋白 Marker
3 讨论
UL23 属 HCMV US22 基因家族成员，生物学功
能尚不清楚。曾涛等［7］通过酵母双杂交，GST-pull
down 等试验已确定 pUL23 分别与 ATP 酶抑制因子 1
（ATPase inhibitory factor1，ATIF1），真核翻译起始因
子 3（eukaryotic translation initiation factor3，subunit
E interacting protein，eIF3e）［8］，热体克蛋白 40 同源
物［DnaJ（Hsp40）homolog，subfamily B，member6，
DNAJB6］［9］等 3 个蛋白相互作用。ATIF1 属于核
基因编码的线粒体蛋白，在线粒体中 ATIF1 的功能
主要是调节 F1F0-ATPase 的催化作用。eIF3 在真核
翻译起始进程中起着核心作用，它可以与不同的真
核起始因子以及 RNA 结合来调控整个翻译起始进程
从而选择性地调控蛋白的合成，调控细胞的生长。
DnaJ 蛋白参与广泛的细胞活动，例如蛋白折叠、寡
聚蛋白体的装配。pUL23 可能通过与这些蛋白的结
合参与并影响此过程，从而共同对病毒的生长起到
调节的作用。因此构建 E. coli BL21（DE3）/pET28a
（+）-UL23 融合蛋白的原核表达载体和纯化 HIS-
pUL23 蛋白，为制备 pUL23 单克隆抗体来进一步研
究 pUL23 在病毒生长过程中可能发挥的调控机制起
到了重要的作用。
2012年第10期 123李婧惠等：人巨细胞病毒编码蛋白pUL23在 E. coli BL21（DE3）中的表达和纯化
本研究采用大肠杆菌表达系统中常用的 E. coli
BL21（DE3），该宿主是以 T7 RNA 聚合酶为表达系
统的高效外源基因的蛋白表达宿主。pET-28a（+）
载体是一种常用的原核表达载体，在多克隆位点区
域含有多个常用的内切酶位点序列，便于不同基因
的克隆。并且在载体的 N 端携带 His 标签、凝血酶
基因及 T7 启动子标签序列，在 C 端具有 His 标签序
列。可在 BL21（DE3）中高表达融合有 His 标签的
蛋白，便于下游蛋白纯化。本工作结果表明在此系
统中可成功表达 pUL23 蛋白，并且利用 Ni sepharose
亲和层析纯化后，所得融合蛋白的纯度大于 90%。
4 结论
本研究成功构建了 pET28a（+）-UL23 重组质
粒，通过诱导其在大肠杆菌中表达及后续的纯化试
验，成功获得了纯化的 His-pUL23 融合蛋白，为制
备 pUL23 单克隆抗体和进一步研究 pUL23 的功能奠
定了重要的基础。
参 考 文 献
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（责任编辑 马鑫）