全 文 ：·药理与临床·
大蒜新素对人巨细胞病毒感染的人胚肺成纤维细胞凋亡的影响
聂兴草, 方　峰X ,李　红,董永绥, 甄　宏,刘志峰,李　革
(华中科技大学同济医学院附属同济医院 儿科临床病毒研究室, 湖北 武汉　430030)
摘　要: 目的　研究大蒜新素对人巨细胞病毒 ( HCMV) 诱导感染的人胚肺成纤维细胞 ( HELF ) 凋亡的动态变化
及凋亡调控基因 bcl-2 和 fas mRNA 表达的影响。方法　用流式细胞术测定 HELF 在高、低感染复数 ( MOI 分别
为 2. 5、0. 25) HCM V 感染后 1、12、24、36、48、72、96 h 凋亡细胞比率; 大、中、小剂量大蒜新素 ( 9、6 和 3 Lg/ mL )
处理正常的和感染的 HELF 细胞 ( M OI 为 2. 5) 后上述各时间点凋亡细胞比率。用原位杂交法检测大剂量大蒜新
素处理感染细胞 ( M IO 为 0. 25) 72 h 后 bcl-2 和 fas mRNA 表达强度变化, 并与正常细胞和感染细胞对比分析。
结果　正常细胞凋亡比率保持恒定低水平 (凋亡率平均 2. 68% ) ; 低、高感染复数感染细胞随时间延长凋亡细胞逐
渐增多,凋亡率峰值分别达 8. 85% ( 96 h) 和 25. 63% ( 72 h) ;各剂量大蒜新素处理的正常细胞凋亡率增加, 呈剂
量依赖性, 峰值分别为 4. 88%、6. 47% 和 8. 35% ;但各剂量药物处理感染细胞后却使细胞凋亡比率下降,大剂量药
物处理 72 h 时效应最为明显,凋亡细胞比率由 25. 63% 降至 16. 24%。正常细胞高表达 bcl-2,低表达 fas 基因;感
染 HCMV 后, bcl-2 表达显著下调, fas 表达明显增强;大蒜新素处理感染细胞后使 bcl-2 表达强度明显高于感染细
胞, fas 表达水平明显低于感染细胞,但仍未恢复到正常细胞水平。结论　HCMV 是 HELF 凋亡的强诱导剂 ;病毒
可通过下调凋亡抑制基因 bcl-2 和上调凋亡促进基因 fa s 而发挥致凋亡作用。大蒜新素本身可诱导 HELF 凋亡,但
却能明显抑制 HCMV 诱导的细胞凋亡, 其抑制作用可能与药物干扰 HCMV 影响凋亡调控基因 bcl-2 和 fas 表达
有关。
关键词: 大蒜新素; 细胞凋亡; 凋亡调控基因; 人巨细胞病毒; 人胚肺成纤维细胞
中图分类号: R285. 51　　　文献标识码: A　　　文章编号: 0253 2670( 2004) 09 1015 04
Effect of allitridin on apoptosis of human embryonic lung
fibroblast infected by human cytomegalovirus
NIE Xing-cao, FANG Feng , LI Hong , DONG Yong-sui, ZHEN Hong , LIU Zhi-feng , LI Ge
( L abo ra tor y o f Pediatr ic Clinical V ir o lo gy , T ongji Hospital, T ong ji M edical College,
Huazhong Univ ersit y of Science and T echno lo gy , Wuhan 430030, China )
Abstract: Obj ect　T o study the ef fect of allit ridin on the dynam ic changes of apopto sis and the
expression of apopto sis-modulat ing genes, bcl-2 and fas mRNA in human embryonic lung fibroblast
( HELF ) infected by human cy tomegalov ir us ( HCMV ) . Methods　 By using f low cy tometr y, the
apoptostic cell rates in high and low MOI ( 2. 5 and 0. 25) infected cel ls at 1, 12, 24, 36, 48, 72, and 96 h
after HCMV infection and in infected cells ( MOI= 2. 5) t reated w ith dif ferent doses o f allit ridin ( 9, 6, and
3 Lg/ mL) at above t ime-course af ter tr eatment o f drug w ere measured. The levels of bcl-2 and fas mRNA
expression in infected cells ( MOI= 0. 25) t reated w ith high dose of allit ridin for 72 h w ere determ ined by
insitu hybr idizat ion method, compared w ith infected and normal cells. Results　T he apoptost ic cell rates
w er e per sistent ly low in normal HELF cells ( mean: 2. 68% ) and increased as t ime in low and high MOI
infected cells, peak reached 8. 85% ( 96 h ) and 25. 63% ( 72 h ) , respect iv ely . Allit ridin also induced
apoptosis of normal cells in a dose-dependent manner, the peak w as 4. 88%, 6. 47% , and 8. 35% ,
respect iv ely . Signif icant ly , different doses of allit ridin could inhibit apoptosis o f high MOI infected cells.
High dose of drug had the highest ef f icacy at 72 h, apopto st ic cell rate decreased from 25. 63% to 16. 24% .
High bcl-2 mRNA expression and low fas mRNA expression in normal HELF cells w er e observed, and in
HCMV infected cells, the expression o f bcl-2 mRNA were down-regulated and that of fas mRNA were up-
regulated. Allit ridin w as signif icantly able to up-regulate the expr ession of bcl-2 gene and down-regulate
fas gene in HCMV infected cells, although they st ill couldn t r eturn to the levels of no rmal cells.
·1015·中草药　Chinese T raditional and Herbal D rug s　第 35 卷第 9 期 2004年 9月
X 收稿日期: 2004-02-11基金项目:国家自然科学基金资助项目 ( 30070928)作者简介:聂兴草( 1974—) ,女,湖北人,华中科技大学同济医学院博士,主要从事病毒性疾病的机制和防治研究。
* 通讯作者　Tel: ( 027) 83663579　E-mail: f f ang @t jh . tjmu. ed u. cn
Conclusion　HCMV is a st rong inducer of apoptosis for HELF cells, w hich is associated w ith it s role of
altering the expr ession of apoptosis-regulating genes, bcl-2 and fas. A llitr idin, al though it induces
apoptosis of normal cells, can markedly inhibit apoptosis induced by HCMV, and this inhibition may be
related to inter fering w ith the act ion of HCMV on the expression of bcl-2 and fas mRNA.
Key words : allit ridin; cell apoptosis; apopto sis-r egulat ing genes; human cy tomegalov irus ( HCMV ) ;
human embryonic lung fibroblast ( HELF)
　　细胞凋亡是在生理或病理因素刺激下机体通过
基因控制而使细胞发生自主有序地消亡过程,对于
维持机体自身稳定具有重要意义。在受到胞内微生
物侵袭时,凋亡是机体防御机制之一。同时,细胞凋
亡异常增加已被认为是病毒性疾病的重要发病机制
之一[ 1, 2]。研究表明, 人巨细胞病毒 ( human cytome-
galo virus, HCMV ) 可致细胞染色体损伤、不成熟
和凝集[ 3] ,可使感染细胞中 p53 表达水平升高[ 4] ,诱
导高度磷酸化 Rb 基因表达 [ 5] , 进而诱导感染细胞
凋亡 [ 2, 6]。另一方面, HCMV 又可编码凋亡抑制物
vICA 和 vM IA [ 7, 8] ,抑制细胞凋亡。HCMV 病毒可
能在细胞不同感染时相和条件下诱导或抑制感染细
胞凋亡, 其双重效应可能在 HCMV 致病机制中发
挥重要作用。
大蒜新素 ( allitridin) 是大蒜鳞茎中的有效成
分,在体外可明显抑制 HCMV 实验毒株和临床毒
株增殖和病毒即刻早期抗原 ( immediate-early
ant igens, IEAs) 表达[ 9] ,并可明显降低巨细胞病毒
( CMV) 肝炎小鼠肝组织病毒 IE 基因负荷量和改
善肝脏组织病变及肝功能[ 10]。大蒜新素抗 CMV 的
机制并不十分明确, 其改善病毒感染组织病变作用
除与其抗病毒效应相关外,是否与药物干扰病毒对
细胞增殖或凋亡作用有关是本研究的目的。本实验
采用流式细胞术和原位杂交法分析不同浓度大蒜新
素对 HCMV 感染的人胚肺成纤维细胞 ( human
embryonic lung fibroblast , HELF) 凋亡发生的动
态变化及凋亡调控基因 bcl-2 和 fas mRNA 表达的
影响。
1　材料
1. 1　细胞:取妊娠 16 周水囊引产胚胎,按常规方
法制备原代 HELF,第 10～15代细胞用于本实验。
1. 2　病毒: HCMV AD169 株由中国预防科学院病
毒研究所提供, 平均感染性病毒量为 5. 26×106
PFU/ mL。
1. 3　药物: 大蒜新素即大蒜素注射液 ( 15 mg/
mL) , 上海禾丰制药有限公司生产, 批号: 010005。
1. 4　主要试剂与仪器:含 bcl-2 cDNA ( 2. 0 kb) 及
fas-cDNA 片段 ( 2. 3 kb) 的质粒由华中科技大学同
济医学院免疫教研室惠赠; 地高辛标记及检测试剂
盒购自德国 Boehringer M annheim 公司。FA Csort
流式细 胞仪 (美 国 Becton Diskinson 公 司 ) ;
M odel2300 型 CO 2培养箱 (美国) ;显微镜图像分析
仪 ( HPIAS—1000 医学彩色图像分析系统)。
2　方法
2. 1　凋亡细胞发生率检测:用流式细胞仪检测各组
细胞凋亡发生率。细胞按常规固定、收集、碘化丙锭
染色后上机检测。由于细胞凋亡过程中, 核 DNA 降
解成寡聚核小体,凋亡细胞在 G 0/ G 1峰前形成亚 G 1
峰,可利用该峰对凋亡细胞进行定量分析。
2. 1. 1　HCMV 对 HELF 细胞凋亡的影响:按常规
建立高、低感染复数 ( mul tiplicity of infect ion,
MOI 分别为 2. 5和 0. 25) 两种感染细胞模型,正常
细胞作为对照,于感染后 1、12、24、36、48、72 和 96
h 收集细胞,每组设 3 个复孔。
2. 1. 2　大蒜新素对正常细胞凋亡的影响:用 MTT
比色法测得细胞对药物的最大耐受质量浓度为 9. 6
Lg / mL, 据此设立大、中、小剂量 (分别为 9、6 和 3
Lg / mL ) 药物处理组, 于药物作用后 1、12、24、36、
48、72和 96 h 收集细胞, 每组设 3个复孔。
2. 1. 3　大蒜新素对 HCMV 感染细胞凋亡的影响:
先建立高感染复数 ( MOI= 2. 5) 感染细胞模型, 再
用大、中、小剂量大蒜新素处理感染细胞,观察凋亡
细胞发生率的动态变化, 药物作用后采样时间点同
上,每组设 3个复孔。
2. 2　凋亡调控基因 bcl-2 和 fas mRNA 表达水平
检测: 用大剂量大蒜新素处理低感染复数 ( MOI=
0. 25) 感染细胞 (培养板孔内置细胞飞片) 72 h后,
取出细胞飞片先用 4% 多聚甲醛固定,再用原位杂
交法检测 bcl-2 和 fas mRNA 表达强度,设正常细
胞和低感染复数 ( MOI= 0. 25) 感染细胞作为对
照, 每组设 3 个复孔。每次实验设立不加探针的阴
性对照和 Rnase 处理后的阴性对照。杂交结果用显
微镜图像分析仪进行图像分析,计算平均吸光度值。
2. 3　统计学处理:数据均用 x±s 表示,多组间均数
·1016· 中草药　Chinese T raditional and Herbal D rug s　第 35 卷第 9 期 2004年 9月
比较采用方差分析和 q 检验,两组均数比较采用 t检
验。数据用 SPSS for Window s 10. 0统计软件处理。
3　结果
3. 1　HCMV 对 HELF 细胞凋亡的影响:结果见表
1。正常细胞凋亡发生率保持恒定低水平;低、高感染
复数感染细胞在感染 24和 12 h 后凋亡发生率逐渐
增高, 峰值分别在感染后 96 和 72 h, 后者增幅
更大。
3. 2　大蒜新素对正常 HELF 细胞凋亡的影响: 结
果见表 1。大、中、小剂量药物分别于处理 12、36、48
h 后使凋亡发生率明显增加,剂量愈大, 增幅愈大。
3. 3　大蒜新素对 HCMV 感染细胞凋亡的影响: 各
剂量药物处理感染细胞 12、24 h 后凋亡发生率明显
降低,下调效应随药物剂量增加而增强,见表 2。
表 1　大蒜新素及 HCMV 对正常 HELF 细胞凋亡的影响 ( x±s, n= 3)
Table 1　Effect s of allitridin and HCMV on cell apoptosis of normal HELF ( x±s, n= 3)
组　别 剂　量 凋亡率/ %
1 h 12 h 24 h 36 h 48 h 72 h 96 h
正常 　　- 2. 68±0. 05 2. 66±0. 04 2. 67±0. 04 2. 69±0. 06 2. 69±0. 04 2. 69±0. 06 2. 68±0. 06
HCMV MOI= 0. 25 2. 75±0. 04 2. 82±0. 04 4. 92±0. 35* 5. 00±0. 02* 5. 62±0. 04* 6. 63±0. 03* 8. 85±0. 14*
MOI= 2. 5 2. 73±0. 05 4. 56±0. 06* # 7. 11±0. 60* # 8. 65±0. 11* # 10. 83±0. 32* # 25. 63±0. 29* # 20. 53±0. 32* #
大蒜新素 3 Lg·mL- 1 2. 72±0. 05 2. 60±0. 04 2. 68±0. 04 2. 51±0. 04 3. 63±0. 04* 3. 55±0. 06* 4. 88±0. 05*
6 Lg·mL- 1 2. 68±0. 06 2. 55±0. 03 2. 76±0. 07 4. 69±0. 07* ▲ 5. 25±0. 08* ▲ 6. 47±0. 06* ▲ 6. 43±0. 05* ▲
9 Lg·mL- 1 2. 74±0. 06 4. 16±0. 04* ▲△4. 93±0. 05* ▲△5. 76±0. 08* ▲△ 7. 07±0. 04* ▲△8. 35±0. 06* ▲△ 8. 28±0. 06* ▲△
　　　与正常组比较: * P< 0. 05;　与 HCMV ( MOI= 0. 25) 组比较: # P < 0. 05
　　　与大蒜新素小剂量组比较: ▲P < 0. 05;　与大蒜新素中剂量组比较: △P< 0. 05
　　　* P < 0. 05 v s normal group # P < 0. 05 v s HCMV (M OI= 0. 25) group
　　　▲P < 0. 05 v s small dosage alli trid in gr ou p; △P < 0. 05 v s midd le dosage allit ridin grou p
表 2　大蒜新素对 HCMV 感染的 HELF 细胞凋亡的影响 ( x±s, n= 3)
Table 2　Ef fects of allitridin on cell apoptosis of HELF infected by HCMV ( x±s, n= 3)
组　别 剂　量 凋亡率/%
1 h 12 h　　 24 h　　 36 h　 48 h　 72 h　　 96 h　　
正常 　　- 2. 68±0. 05 2. 66±0. 04 2. 67±0. 42 2. 69±0. 06 2. 69±0. 04 2. 69±0. 06 2. 68±0. 06
HCM V M OI= 2. 5 2. 73±0. 05 4. 56±0. 06* 7. 11±0. 06* 8. 65±0. 11* 10. 83±0. 32* 25. 63±0. 29* 20. 53±0. 32*
大蒜新素 3 Lg·mL- 1 2. 69±0. 04 4. 45±0. 04 6. 21±0. 05* # 7. 84±0. 06* # 9. 81±0. 12* # 23. 39±0. 39* # 18. 24±0. 38* #
6 Lg·mL- 1 2. 77±0. 04 3. 94±0. 04* 5. 44±0. 05* # ▲ 7. 11±0. 08* # ▲ 8. 33±0. 20* # ▲ 20. 84±0. 24* # ▲ 14. 72±0. 22* # ▲
9 Lg·mL- 1 2. 77±0. 03 3. 15±0. 06* # ▲△4. 87±0. 09* # ▲△6. 82±0. 10* # ▲△ 7. 11±0. 10* # ▲△16. 24±0. 33* # ▲△ 13. 18±0. 14* # ▲△
　　　与正常组比较: * P< 0. 05;　与 HCMV ( MOI= 2. 5) 组比较: # P < 0. 05
　　　与 HCMV+ 大蒜新素 ( 3 Lg/ mL) 组比较: ▲P < 0. 05;　与 HCMV + 大蒜新素 ( 6 Lg/ mL) 组比较: △P< 0. 05
　　　* P < 0. 05 v s normal group; # P < 0. 05 v s HCM V ( M OI= 2. 5) group
　　　▲P < 0. 05 v s HCMV+ allit ridin ( 3 Lg/ mL) group;　△P< 0. 05 v s HCM V+ all it ridin ( 6 Lg /m L) gr ou p
3. 4　大蒜新素对 HCMV 感染细胞 bcl-2 和 fas
mRNA 表达强度的影响:结果显示,正常 HELF 高
表达 bcl-2,低表达 fas 基因;感染 HCMV 后, bcl-2
表达明显下调, fas 表达明显增强; 大蒜新素处理感
染细胞后 bcl-2 表达强度明显高于感染细胞, 而 fas
表达水平明显低于感染细胞, 但仍与正常细胞有明
显差异,结果见表 3。
4　讨论
4. 1　HCMV 对细胞凋亡的影响和机制初探:流式
细胞术动态定量分析 HCMV 感染细胞的凋亡发生
率,发现高感染复数感染后 12 h 就可见到凋亡细胞
比率明显增高,随着感染时间延长增幅逐渐增加, 72
h 增幅最大,为正常细胞的 9. 5 倍。低感染复数感染
时,也观察到凋亡细胞增多现象,但与高感染复数感
表 3　大蒜新素对 HCMV 感染细胞 bcl-2 和
fas mRNA 表达的影响 ( x±s, n= 3)
Table 3　Effect of allitridin on expression of bcl-2 and fas
mRNA in HCMV-inf ected cells ( x±s, n= 3)
组　别 剂　量 平均吸光度值
bcl-2　 f as
正常 - 9. 517±0. 203 2. 468±0. 121
HCMV MOI= 0. 25 1. 723±0. 193* * 8. 416±0. 147* *
大蒜新素 9 Lg·mL- 1 6. 595±0. 133* * # 3. 199±0. 114* * #
　　与正常组比较: * * P < 0. 01; 与 HCM V 组比较: # P < 0. 01
　　* * P < 0. 01 v s n or mal gr ou p; # P < 0. 01 v s HCM V group
染相比, 凋亡细胞有意义增多的时间较晚 ( 24 h ) ,
且凋亡发生率也明显低于后者,最大凋亡细胞比率
约为后者的 1/ 3,是正常细胞的 3. 3 倍。结果证实,
无论是低感染量还是高感染量 HCMV 病毒均可诱
·1017·中草药　Chinese T raditional and Herbal D rug s　第 35 卷第 9 期 2004年 9月
导感染细胞凋亡。有学者在 HCMV 视网膜炎时发
现视网膜色素上皮细胞发生凋亡 [ 6] , 与本实验结果
一致。推测 HCMV 感染细胞发生凋亡机制有两方
面:一方面 HCMV 感染细胞后,受染细胞通过启动
凋亡机制以清除感染细胞内病毒作为对 HCMV 感
染的一种防御反应, 这在高感染复数感染时最为明
显,在感染早期 ( 12 h) 细胞凋亡机制就开始启动,
其发生率在感染后 72 h 时陡然显著增高, 与
HCMV 子代病毒增殖高峰期吻合[ 9]。感染 72 h 后,
凋亡发生率有所下降可能与感染后 72 h 高峰表达
的病毒 IE 蛋白发挥其抑制感染细胞凋亡的机制有
关[ 11 ]。另一方面, 体外研究发现, HCMV 的 UL36
和 UL37 基因可分别编码参与凋亡级联反应的
Caspase-8 抑制子—vICA 和位于线粒体的凋亡抑
制子—vMIA [ 7, 8]。这些事实说明, HCMV 为逃避受
染细胞启动凋亡所引发的病毒清除机制而采取相应
抑制凋亡措施, 以利于病毒的进一步增殖。此外,
HCMV 感染量大, 感染时间较长时, 发生凋亡的细
胞增多。这时凋亡在 HCMV 引致感染组织细胞损
伤,即在 HCMV 疾病的发病机制中起到不可忽视
的作用。
bcl-2 和 fas 基因是细胞凋亡的重要调控基因,
前者抑制细胞凋亡,后者促进细胞凋亡。原位杂交结
果显示, 体外培养的正常人 HELF bcl-2 基因高表
达, fas 基因低表达, 使细胞凋亡发生率维持低水
平; HCMV 感染 72 h 后,诱导 bcl-2 基因表达明显
降低, fas 基因表达明显增高, 与感染细胞凋亡发生
率明显增高相一致, 表明 bcl-2 和 fas 基因参与
HCMV 病毒诱导凋亡机制。
4. 2　大蒜新素对正常细胞和感染细胞凋亡的影响:
大蒜新素已被证明在体内外均具有良好的抗 CMV
病毒效应,特别是用于治疗小鼠 CMV 病毒性肝炎,
可明显减轻肝组织病变和改善肝细胞功能。大蒜新
素的这种治疗作用机制并不十分清楚。本实验结果
表明大、中、小剂量大蒜新素处理正常 HELF 后分
别在 12、36、48 h 出现凋亡细胞增多,与药物处理的
时间和质量浓度梯度呈正相关, 但保持在较低水平,
这可能是正常细胞对外来刺激的一种反应, 或认为
大蒜新素本身可诱导 HELF 发生凋亡。但将大蒜新
素处理感染细胞后并未出现所预想的大蒜新素和
HCMV 致细胞凋亡效应叠加的结局,却见大蒜新素
使感染细胞凋亡发生率明显下降, 药物质量浓度与
感染细胞凋亡发生率呈负相关, 即大蒜新素质量浓
度愈高,感染细胞凋亡发生率愈低。大蒜新素的这种
反差效应提示, 大蒜新素可抑制 HCMV 感染细胞
凋亡而具明显的保护作用。为进一步研究大蒜新素
抑制感染细胞凋亡的机制, 本实验还观察了药物对
HCMV 感染细胞凋亡抑制基因 bcl-2 和凋亡促进
基因 fas 表达的影响, 发现大蒜新素可显著上调
bcl-2 mRNA 表达和下调 fas mRNA 表达。提示大
蒜新素对 bcl-2 和 fas 基因在转录水平的调控可能
是其抑制 HCMV 感染细胞凋亡的机制之一。
本研究结果表明, HCMV 是 HELF 细胞凋亡
的强诱导剂; 病毒可通过下调凋亡抑制基因 bcl-2
和上调凋亡促进基因 fas 表达而发挥作用; 病毒诱
导细胞凋亡效应可能在其致病机制中起作用。大蒜
新素虽然本身可诱导细胞凋亡, 但却能明显抑制
HCMV 感染诱导的细胞凋亡,其机制与药物干扰病
毒影响凋亡调控基因 bcl-2 和 fas 表达这一作用环
节有关;大蒜新素抗 HCMV 致凋亡作用可能是其
减轻病毒致组织病变和功能异常的机制之一。
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