全 文 ：·研究报告· 2011年第12期
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN
收稿日期 ：2011-04-25
基金项目 ： 江苏省自然科学基金（BK2010046，BK2008138，BE2008639，BY2009147），“重大新药创制”科技重大专项（2009ZX09103-675，
2009ZX09102-206），常州市科技局（CS20092003，CQ20100009，CN20100016，CZ20100008），常州市武进区科技局资助项目
作者简介 ：龚志飞，男，硕士，研究方向 ：生物工程制药 ；E-mail:gzf861119@163.com
通讯作者 ：华子春，男，教授，博士生导师，E-mail ：huazc@nju.edu.cn
重组人抗血栓蛋白在大肠杆菌中的
自诱导表达及纯化
龚志飞1，2，3 杨翔2，3 颜法宝2 陈强3 孙小强1 华子春3
（1常州大学石油化工学院，常州 213164 ；2常州靶标生物医药研究所有限公司，常州 213164 ；
3南京大学常州高新技术研究院，常州 213164）
摘 要: 旨在优化重组人抗血栓蛋白（rHAP）工程菌的自诱导培养基，以提高菌体产量及可溶性的重组 rHAP 蛋白含量。选
取蛋白胨、酵母提取物、甘油、葡萄糖为因素，各取 4 个水平，采用正交表 L16（45）进行试验设计，对影响菌体生长和可溶性
rHAP 表达水平的乳糖浓度进行了优化。结果表明自诱导培养基碳氮源的最优配比 ：2% 蛋白胨，1.5% 酵母，0.5% 甘油，0.03% 葡
萄糖，0.2% 乳糖。此时表达菌密度 OD600 和可溶性 rHAP 目标蛋白表达量分别是未优化前的 2.04 倍和 2.85 倍。在 20 L 发酵表达时，
rHAP 工程菌 OD600 值高达 93，菌体湿量为 1 620 g/20 L。利用 Q-Sepharose 和 SP-Sepharose 纯化，Western blotting 结果表明表达蛋
白为目的融合蛋白。
关键词: 抗血栓蛋白 优化培养 发酵 纯化 鉴定
Auto-inducting Expression and Purification of Recombinant Human
Anticoagulant Protein in Escherichia coli
Gong Zhifei1,2,3 Yang Xiang2,3 Yan Fabao2 Chen Qiang3 Sun Xiaoqiang1 Hua Zichun3
（1School of Petrochemical Technology，Changzhou University，Changzhou 213164 ；2Changzhou Target Pharmaceutical Research Institute,
Changzhou 213164 ；3Changzhou High-tech Research Institute of Nanjing University，Changzhou 213164）
Abstract: In order to increase the growth and the soluble expression of recombinant E. coli strain expressing human anticoagulant
protein（rHAP），auto-induction medium were optimized. Tryptone，yeast extract，glycerol and glucose（four level for each substance and
peptone used as factor and biomass and soluble expression of rHAP used as objective product respectively）were used for L16（45）orthogonal
experiment，concentrations of lactose which could affect the growth of recombinant bacterial strain and product of rHAP were investigated.
Result showed that the optimal carbon and nitrogen composition ratio in auto induction medium was obtained as followed: 2% tryptone，1.5%
yeast extract，0.5% glycerol，0.03% glucose，0.2% lactose. The optimized cultivation could increase the bacterial growth density and the
product of soluble expressed rHAP protein by 2.04 fold and 2.85 fold respectively compared with the original，non-optimized condition. When
fermented in 20 Liter fermentor，the recombinant rHAP-expressing bacteria grew to OD600 of 93 with the wet weight of bacteria of 1 620 g/20 L.
The recombinant protein of rHAP was highly purified by Q-Sepharose and SP-Sepharose，which was identified by Western blotting.
Key words: Anticoagulant protein Optimization of cultivation Fermentation Purification Identification
重组人抗血栓蛋白（rHAP）[1] 正是利用蛋白质
工程和基因工程技术，将人胎盘抗凝蛋白与水蛭素
C 端结构域结合在一起的一种新的抗凝蛋白，分子
量大小约为 38 kD。初步研究表明，重组人胎盘抗
凝蛋白变体保留了 Annexin V 和血小板结合的性质，
同时又具有明显的凝血酶抑制活性，而且其凝血酶
抑制活性具有明显的剂量依赖关系 [2]。体外和动物
试验都表明其具有良好的抗凝、抗栓作用，而且出
2011年第12期 193
血副作用低，具有良好的应用前景 [3]。
在构建重组工程菌时，常将外源基因安置在可
被诱导控制的启动子序列下游。异丙基 -β-D- 硫代
半乳糖苷（IPTG）是实验室常用的诱导剂，但由于
其昂贵的价格和潜在的毒性，使其应用于大规模发
酵生产重组蛋白有一定的局限性 [4]。自诱导培养基
中的乳糖是一种二糖，无毒且价格低廉，可以作为
诱导剂启动 pET 载体中的 T7 启动子，从而进行蛋
白质基因的转录。乳糖需要经过 β- 半乳糖苷酶的作
用转化为异乳糖才会起到诱导剂的作用，利用乳糖
作为诱导剂的诱导过程更为复杂和繁琐。但乳糖价
格低廉，能大大降低成本，使在重组蛋白的发酵生
产中替代 IPTG 作为新的诱导剂的研究有着重要意
义。本研究旨在通过优化培养基的碳氮源组分及调
整乳糖浓度，筛选出能高效可溶表达 rHAP 蛋白的
工艺条件，并将表达产物进行纯化和生物活性的检
测，为进一步的研究及工业化生产奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌种 重组大肠杆菌（质粒 pET-23a ；宿主
菌 E.coli BL21（DE3））为南京大学常州高新技术研
究院（常州靶标生物医药研究所有限公司）构建和
保存。
1.1.2 培养基 （1）MDG 培养基（非诱导型基础
培 养 基 ）：25 mmol/L Na2HPO4，25 mmol/L KH2PO4，
50 mmol/L NH4Cl，5 mmol/L Na2SO4，2 mmol/L
MgSO4，0.2% Trace Metal，0.5% glucose，0.05%
aspartic acid。（2） ZYM-0.8G 培养基 （种子培养基）：1%
N-Z-Amine，0.5% yeast extract，25 mmol/L Na2HPO4，
25 mmol/L KH2PO4，50 mmol/L NH4Cl，5 mmol/L
Na2SO4，2 mmol/L MgSO4，0.2% Trace Metal，0.8%
glucose。（3）P-5052 培 养 基 ：50 mmol/L Na2HPO4，
50 mmol/L KH2PO4，25 mmol/L（NH4）2 SO4，2 mmol/L
MgSO4，0.2% Trace Metal，0.5% glycerol，0.05%
glucose，0.2% lactose。（4）ZYP-5052 培 养 基 ：1%
N-Z-Amine，0.5% yeast extract，50 mmol/L Na2HPO4，
50 mmol/L KH2PO4，25 mmol/L（NH4）2SO4，2 mmol/L
MgSO4，0.2% Trace Metal，0.5% glycerol，0.05%
glucose，0.2% lactose。（5）ZYM-5052 培 养 基 ：1%
N-Z-Amine，0.5% Yeast Extract，25 mmol/L Na2HPO4，
25 mmol/L KH2PO4，50 mmol/L NH4Cl，5 mmol/L
Na2SO4，2 mmol/L MgSO4，0.2% Trace Metal，0.5%
glycerol，0.05% glucose，0.2% lactose。（6）N-5052
培 养 基 ：50 mmol/L Na2HPO4，50 mmol/L KH2PO4，
50 mmol/L NH4Cl，5 mmol/L Na2SO4，2 mmol/L MgSO4，
0.2% Trace Metal，0.5% glycerol，0.05% glucose，0.2%
lactose。（7）C-750501 培养基 ：50 mmol/L Na2HPO4，
50 mmol/L KH2PO4，50 mmol/L NH4Cl，5 mmol/L
Na2SO4，2 mmol/L MgSO4，0.2% Trace Metal，0.75%
glycerol，0.05% glucose，0.01% lactose。
Trace Metal（1 L）：50 mmol/L FeCl3·6H2O，
20 mmol /L CaCl 2，10 mmol /L MnCl 2·4H 2O，
10 mmol/L ZnCl2，2 mmol/L CoCl2·6H2O，2 mmol/L
CuSO4·5H2O，2 mmol/L NiSO4·6H2O，2 mmol/L
Na2MoO4·2H2O，2 mmol/L H3BO3，60 mmol/L HCl。
1.2 方法
1.2.1 基础培养基的筛选 根据 Studier[5] 的方法进
行自诱导培养。用保存在甘油管中菌种在含 100 mg/L
氨苄青霉素（Ampicilin，Amp）的 MDG 培养液中，
37℃，220 r/min 培养过夜，以 ZYM-0.8G 为种子培
养液，按 0.1% 接种量，37℃，220 r/min 接入培养
12 h，作为种子液。重组人抗血栓蛋白（rHAP）工
程菌种子液在 P-5052、ZYP-5052、ZYM-5052、N-5052、
C-750501 五种培养基中进行培养，接种量为 1%，
含 Amp 为 0.1%，37℃培养 6 h，降温至 32℃，再培
养 18 h。培养结束时测定工程菌的菌体密度（OD600）
及可溶性 rHAP 的含量。
1.2.2 正交试验设计 [6] 选取蛋白胨（N-Z-Amine）、
酵母提取物（yeast extract）、甘油（glycerol）、葡萄
糖（glucose）4 个 因 素， 每 个 因 素 选 取 4 个 水 平，
采用正交表 L16（45）进行试验设计的优选。
1.2.3 乳糖浓度对目的蛋白表达的影响 培养物以
1% 的种子液接种量分别接种于乳糖含量为 0.1%、
0.2%、0.4% 和 0.6% 的 50 mL 含 Amp 的 优 化 后 的
培养基中，37℃培养 6 h 后，降温至 32℃再培养
18 h，培养结束后分别测定工程菌的菌体密度及可
溶性 rHAP 的含量。
1.2.4 可 溶 性 蛋 白 含 量 的 测 定 和 Western blotting
龚志飞等 ：重组人抗血栓蛋白在大肠杆菌中的自诱导表达及纯化
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2011年第12期194
鉴 定 菌 体 培 养 结 束 后， 吸 取 样 品 菌 液 1 mL，
10 000 r/min 离心 1 min，去除菌液；用 1 mL PBS（pH
7.4）洗涤 2 次，对其超声（超声功率 400 W、超声 2 s、
间歇 2 s、次数 15 次），10 000 r/min 离心 1 min，取
上清液进行电泳分析。采用 Tris-Tricine 系统进行还
原 SDS-PAGE 电泳，电泳完毕后考马斯亮蓝染色，
目的蛋白条带经 BIO-BEST-140E 型凝胶成像系统成
像和 SIM 公司的 ImageMaster 软件进行分析。SDS-
PAGE 电泳结束后电转移到 PVDF 膜上，用含有 5%
脱脂牛奶的 PBST 缓冲液封闭过夜。分别用一抗
anti-Annexin V 单克隆抗体和带有辣根过氧化物酶的
二抗 anti-goat 孵育 2 h，然后用 ECL 法进行曝光。
1.2.5 重组抗血栓蛋白的纯化 目的蛋白 rHAP 诱
导表达，收集菌液，离心用缓冲悬匀湿菌。经高压
破菌后，离心收集上清，硫酸铵沉淀进行粗提，缓
冲液溶解沉淀上样流经 Q-Sepharose 离子交换层析
柱，用 10 倍柱体积的平衡缓冲液平衡柱子，然后在
上述缓冲液中增加 NaCl 的浓度洗脱目的蛋白。收集
洗脱峰，得到初步纯化产物。洗脱峰流出液在过 SP-
Sepharose 离子交换层析，以 20-100 mmol/L NaCl 缓
冲液梯度洗脱，收集洗脱蛋白峰。SDS-PAGE 检测
纯化过程中目的蛋白的纯度。
1.2.6 重组蛋白生物学活性测定 待测血浆加入部
分凝血活酶溶液，在 Ca2+ 参与下纤维蛋白原转变为
不溶性纤维蛋白，从而测得活化部分凝血活酶时间
（APTT）。根据参考文献 [7-10] 测试活化部分凝血活
酶时间来评价重组人抗血栓蛋白的抗凝效果。取待
测血浆 0.1 mL，加入 APTT 试剂 0.1 mL，加入含不
同浓度（0、5、10、15 和 20 µg/mL）的重组抗血栓
蛋白溶液各 0.1 mL，37℃孵育 5 min ；加入 37℃预
温 0.025 mol/mL CaCl2 溶液 0.1 mL，记录凝固时间。
绘制不同含量的重组蛋白溶液与凝血时间的曲线图。
1.2.7 重组工程菌的高密度发酵培养 重组工程菌
在 MDG 培养液（含氨苄青霉素钠 50 µg/mL），37℃，
220 r/min 培 养 过 夜， 在 按 0.1% 接 种 量 接 入 ZYM-
0.8G 培养液中培养 12 h，作为二级种子液。配制优
化后的发酵培养基倒入发酵罐内，高压灭菌后，冷
却至 30-40℃，将制备的二级种子液按 10% 接种量
接入发酵罐，37℃培养 3 h 后降温至 32℃继续培养。
发酵期间，每隔 2 h 取样，测工程菌的菌体密度及
可溶性 rHAP 的含量，绘制生长及目的蛋白可溶性
表达的曲线。
2 结果
2.1 基础培养基的筛选
250 mL 摇瓶分别装 50 mL P-5052、ZYP-5052、
ZYM-5052、N-5052、C-750501 培 养 液， 摇 床 速
度 220 r/min， 培 养 温 度 37 ℃， 接 种 量 1%， 培 养
6 h 后降温至 32℃再培养 18 h，吸取 1 mL 菌液在
10 000 r/min 转速离心，分离获得的菌经超声破碎
后，离心取上清进行 SDS-PAGE 分析，经凝胶光密
度扫描分析可溶性 rHAP 表达含量。
图 1 不同培养基对 rHAP 工程菌密度和 rHAP 可溶性
表达含量的影响
图 1 结果表明，含有有机碳源、氮源的培养
基（ZYP-5052、ZYM-5052） 可 溶 性 rHAP 表 达 水
平都较高，而不含有机碳氮源的培养基表达水平较
低，并且培养结束时 rHAP 工程菌的菌密度也较低 ；
ZYP-5052 培养基不论是菌密度还是可溶性 rHAP 表
达水平都高于 ZYM-5052 培养基。因此，我们选择
ZYP-5052 为基础培养基。
2.2 正交试验优化培养液成分
采用 L16（45）正交试验对培养液的碳氮比进行
优化，对蛋白胨、酵母提取物、甘油及葡萄糖进行
4 因素 4 水平的正交试验 ；考察培养基碳源、氮源
组分对菌体生长及表达的综合影响，选取最优的培
养基配方。正交试验因素水平见表 1，试验结果和
极差分析试验因素对指标的影响结果见表 2。
由表 2 得出，培养基对可溶性 rHAP 表达的影
2011年第12期 195 龚志飞等 ：重组人抗血栓蛋白（rHAP）在大肠杆菌中的自诱导表达及纯化
响顺序为 C>A>D>B，最终确定优化培养基的组分为
A4B3C2D1，即 2% 蛋白胨、1.5% 酵母、0.5% 甘油、0.03%
葡萄糖。在此配比下，菌体密度（OD600）达到 7.87，
即菌体干重 2.655 g/L，可溶性 rHAP 表达水平占菌
体可溶性总蛋白的 22.45%。
2.3 乳糖浓度对大肠杆菌生长的影响
选用优化后的 ZYP-5052 培养液，加入乳糖使
其含量为 0.1%、0.2%、0.4% 及 0.6%，37℃培养 6 h，
降温至 32℃再培养 18 h，培养结束后分别测定工程
菌的菌体密度及可溶性 rHAP 的含量。
图 2 表 明， 乳 糖 浓 度 对 菌 体 的 生 长 有 一 定
的促进作用，并且乳糖浓度的增加可提高可溶性
rHAP 的产量。造成这些现象的原因可能是 ：乳
糖在诱导和促进外源基因表达的同时，其中一部
分乳糖会被细菌当作碳源利用，促进细菌的生长。
但当乳糖浓度过高时产生抑制效应，也会抑制细
菌生长和降低目的蛋白的表达得率。经过优化，
rHAP 工程菌表达的最适乳糖的诱导浓度为 0.2%。
表 1 优化培养基碳氮比试验的因素水平设计
水平 N-Z-amine（蛋白胨）A%（W/V） 酵母 B%（W/V） 甘油 C%（W/V） 葡萄糖 D%（W/V）
1 0.5 0.5 0.3 0.03
2 1.0 1.0 0.5 0.05
3 1.5 1.5 0.7 0.07
4 2.0 2.0 0.9 0.09
表 2 优化培养基碳氮比对工程菌生长及表达的影响
编号 A B 空白 C D 菌体干重（g/L） 可溶性蛋白含量（%） 相对含量（干重 * 含量）（%）
1 1 1 1 1 1 1.625 15.902 25.841
2 1 2 2 2 2 1.815 14.446 26.219
3 1 3 3 3 3 2.100 15.127 31.767
4 1 4 4 4 4 2.525 15.852 40.026
5 2 1 2 3 4 1.900 18.175 35.533
6 2 2 1 3 4 2.025 16.531 33.475
7 2 3 4 1 2 1.845 15.547 28.684
8 2 4 3 2 1 2.350 17.550 41.243
9 3 1 3 4 2 1.705 18.341 31.271
10 3 2 4 3 1 2.085 16.692 34.803
11 3 3 1 2 4 2.835 15.677 44.444
12 3 4 2 1 3 1.875 13.340 25.013
13 4 1 4 2 3 2.925 16.844 49.269
14 4 2 3 1 4 1.775 17.675 31.373
15 4 3 2 4 1 2.875 18.947 54.473
16 4 4 1 3 2 1.805 19.695 35.549
K1 123.853 141.914 110.911 156.360
K2 138.935 148.970 161.175 121.723
K3 135.531 159.368 137.652 139.524
K4 170.664 141.831 159.245 151.376
R 46.811 17.537 50.264 34.637
C >A>D>B
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2011年第12期196
2.4 rHAP蛋白的纯化及Western blotting鉴定
上清液经过 Q-Sepharose 和 SP-Sepharose 离子交
换柱，用高盐洗脱收集洗脱峰（图 3，图 4），可见
明显洗脱峰。Q-Sepharose 离子交换柱吸附目的蛋白
特异性很强，但仍含有少量杂蛋白 ；再经过一步 SP-
Sepharose 离子交换柱纯化，SDS-PAGE 分析（图 5）
表明，蛋白纯度达到 96% 以上。Western blotting（图
6）显示，在分子量约 38 kD 处有一明显条带，再一
次验证了诱导 rHAP 蛋白的正确表达。
图 2 乳糖浓度对菌密度和可溶性 rHAP 表达水平的影响
图 3 Q-Sepharose 层析图谱
图 4 SP-Sepharose 层析图谱
M. 蛋白分子量 Marker ；1.rHAP 表达产物 ；2. 可溶性 rHAP 蛋白 ；3, 4. 浓
缩纯化蛋白 ；5. 经 Q-Sepharose 纯化蛋白 ；6. 经 SP-Sepharose 纯化蛋白
图 5 Q-Sepharose 和 SP-Sepharose 层析纯化
rHAP 电泳分析
1. 经 SP-Sepharose 纯化蛋白 ；2.Western blotting 鉴定 rHAP ；
3. 蛋白分子量 Marker
图 6 rHAP 蛋白的电泳分析及 Western blotting 鉴定
2.5 目的蛋白的生物学活性的测定
结果（图 7）显示，rHAP 浓度越高，测试的
APTT 时间越长，且表现出明显的剂量依赖性，但当
蛋白浓度超过 20 µg/mL，测试的 APTT 时间超过凝
血仪的最大量程（600 s），与理想曲线一致。
图 7 rHAP 蛋白的浓度对活化部分凝血活酶时间
（APTT）的影响
2011年第12期 197
2.6 重组人抗血栓蛋白（rHAP）工程菌的高密度
发酵
在 Jcbio-B50L 发酵罐中，发酵体积为 20 L，发
酵参数 ：起始设定 pH7.0，搅拌转速 300 r/min，通
气量 1 000 L/h ；发酵过程中通过调节通气量与搅拌
转速来控制溶氧不小于 30% ；培养基为优化后的自
诱导培养基，通过流加乳糖控制目的蛋白的表达，
经过 37℃培养 3 h 和 32℃诱导培养 9 h，每隔 2 h
取样，测试菌体密度和可溶性 rHAP 的含量，最终
发酵密度达到 OD600=93，菌体湿量为 1 620 g/20 L，
rHAP 的可溶性含量为 20.13%（图 8），每 2 h 可溶
性 rHAP 的含量见 SDS-PAGE 分析（图 9）。
xinV）属于 annexins 家族的成员，最初从人胎盘中
纯化，因其抗凝活性被称为人胎盘抗凝蛋白。它对
暴露于活化血小板表面的磷脂酰丝氨酸具有高亲和
性，对未活化的静止血小板亲和力极低。在动物动
脉栓塞模型中，放射性标记的人胎盘抗凝蛋白能选
择性地聚集于动物模型的血栓处，浓集于动物模型
血栓处的人胎盘抗凝蛋白比对照蛋白质高 13 倍。重
组人抗血栓蛋白既有 annexinV 的特性又具有水蛭素
的抗凝作用。因此，表达和纯化重组人抗血栓蛋白
对深入研究重组人抗血栓蛋白在基础和临床研究中
的作用具有重要意义。
本研究采用自动诱导细胞表达的培养基系统，
可以最大程度地提高 pET 系列和其他 IPTG 原核诱
导表达系统在大肠杆菌中蛋白的表达量，其最大的
方便之处在于使用这种培养基不需要对大肠杆菌的
生长密度进行检测。因为 IPTG 对细胞存在毒性，因
此使用了这种不含 IPTG 的自动诱导体系，与传统培
养基相比可以使细胞数量和目的蛋白量都大大增加。
本 研 究 在 获 得 了 rHAP 蛋 白 的 基 础 上， 经
Q-Sepharose 和 SP-Sepharose 层析两步纯化，获得了
较高纯度的目的 rHAP 蛋白。在对 rHAP 蛋白生物学
活性鉴定时，测试了不同浓度蛋白的活化部分凝血
活酶时间，结果显示凝血时间与 rHAP 浓度具有明
显的剂量依赖性。
4 结论
本研究对 rHAP 工程菌的优化条件进行了验证
试验，菌密度 OD600=7.87，可溶性 rHAP 的表达水平
为占菌体可溶性总蛋白的 22.45%。生长和表达水平
是优化前的 2.04 倍和 2.85 倍。在 20 L 发酵表达时，
rHAP 工 程 菌 OD600 值 高 达 93， 菌 体 湿 量 为 1 620
g/20 L。在获得了 rHAP 蛋白的基础上，经 Q-Sepharose
和 SP-Sepharose 层析两步纯化，获得的目的 rHAP 蛋
白纯度在 96% 以上。在对 rHAP 蛋白生物学活性鉴
定时，测试了不同浓度蛋白的活化部分凝血活酶时
间，结果显示凝血时间与 rHAP 浓度具有明显的剂
量依赖性。本试验重组表达了 rHAP 蛋白，建立了
其分离纯化技术，获得了高纯度的具有生物学活性
的 rHAP 蛋白，为 rHAP 工程菌走向实际应用奠定了
基础。
图 8 高密度培养 rHAP 工程菌的生长和可溶性表达曲线
1-6. 分别经 2，4，6，8，10 和 12 h 表达的 rHAP 可溶性蛋白 ；
M. 蛋白分子量 Marker
图 9 rHAP 工程菌在不同时间的可溶性表达
龚志飞等 ：重组人抗血栓蛋白（rHAP）在大肠杆菌中的自诱导表达及纯化
3 讨论
人胎盘抗凝蛋白（即钙磷脂结合蛋白，anne
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2011年第12期198
参 考 文 献
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