全 文 ：第 52 卷 第 4 期
2 0 1 6 年 4 月
林 业 科 学
SCIENTIA SILVAE SINICAE
Vol. 52，No. 4
Apr．，2 0 1 6
doi:10．11707 / j．1001-7488．20160409
收稿日期: 2015 － 04 － 25; 修回日期: 2015 － 09 － 05。
基金项目: 国家自然科学基金项目(30671700) ; 中国博士后科学基金项目(20090460866) ; 东北林业大学国家级大学生创新性实验计划
项目(201410225069 ) ; 东北林业大学博士研究生自主创新基金项目(2572015AA32)。
* 池玉杰为通讯作者。
构巢曲霉转化子菌株产 MnP条件优化
及对 3 种染料的脱色*
孙世娜 池玉杰 于 存 李 月
(东北林业大学林学院 哈尔滨 150040)
摘 要: 【目的】对转入猴头菌 MnP1 和 MnP2 基因的 2 个构巢曲霉转化子菌株 TN02A7-He-mnp1 和 TN02A7-He-
mnp2 产 MnP 的初始培养条件进行优化，然后用优化后的酶液对 3 种染料进行脱色研究，以期提高锰过氧化物酶
(MnP)活性。【方法】采用单因素试验进行最适产酶温度的筛选; 正交试验检测血红素浓度、Mn2 + 浓度、pH 值和
转速 4 个因素在 3 个水平下对酶活性的影响，并通过优化培养验证试验检测酶活性;吸光度法检测优化后的酶液
对 3 种染料的脱色率。【结果】菌株 TN02A7-He-mnp1 产 TN02A7-He-MnP1 最适培养条件为: 在 MMPGRT 培养基
的基础上，加入 2 g 青杨木屑作为产酶底物，Mn2 +浓度为 267 μmol·L － 1、氯化血红素浓度为 0. 05 g·L － 1、培养液 pH
值为 7. 5，100 mL 三角瓶中装液量为 50 mL、接入 2 个 φ = 10 mm 的菌块，于 37 ℃、180 r·min － 1的摇床中培养 120 h;
菌株 TN02A7-He-mnp2 产 TN02A7-He-MnP2 最适培养条件与 TN02A7-He-mnp1 相似，只是氯化血红素溶液浓度为
0. 03 g·L － 1，摇床转速为 220 r·min － 1，其他条件相同。在上述最适培养条件下，2 个构巢曲霉转化子菌株产
TN02A7-He-MnP1 和 TN02A7-He-MnP2 的酶活性分别为 133. 62 和147. 09 U·L － 1，是初始培养条件的 2. 89 和 3. 46
倍。染料脱色试验表明，2 个菌株对杂环类染料中性红和偶氮类染料刚果红在 4 h 内达到 58%以上的脱色率，16 h
对中性红达到或接近 100%，20 h 对刚果红达到或接近 100%。【结论】通过优化培养基成分与条件可以提高 2 个
构巢曲霉转化子菌株 MnP 的产酶量，2 个菌株对中性红和刚果红都有高效的脱色作用。
关键词: 锰过氧化物酶; 构巢曲霉; 转化子; 优化培养; 染料脱色
中图分类号: Q936 文献标识码: A 文章编号: 1001 － 7488(2016)04 － 0075 － 08
Optimization of Culture Conditions to Produce MnP and Dye
Decolorization of TN02A7-He-mnp1 and TN02A7 － He-mnp2
Sun Shina Chi Yujie Yu Cun Li Yue
( School of Forestry，Northeast Forestry University Harbin 150040)
Abstract: 【Objective】The initialized culture conditions for two Aspergillus nidulans tranformant stains TN02A7-He-
mnp1 and TN02A7-He-mnp2 to produce manganese preoxidase(MnP) were optimized so as to enhance MnP activity and
yield significantly． The decolorizing capacity of optimized culture solutions of two stains to 3 kinds of dyes was determined．
【Method】Single-factor test was conducted to screen the optimal temperature for two strains to produce MnP． An orthogonal
test was conducted to determine the effects of four factors- hemin concentration，Mn2 + concentration，pH value，and
rotation speed on MnP activity，and a confirmation test was conducted to measure MnP activity． The absorbance value was
determined to evaluate the decolorizing capacity of optimized culture solutions to 3 kinds of dyes．【Result】Results showed
that the most optimal culture parameters for TN02A7-He-mnp1 to produce MnP were Mn2 + 267 μmol·L － 1，hemin 0. 05 g·
L － 1，2 tablets of φ = 10 mm inoculum，50 mL culture solution of pH = 7. 5 in 100 mL flask at 180 r·min － 1 shaking
condition，and under culture temperature of 37 ℃，on the basis of MMPGRT liquid medium plus to 2 g wood chip of
Populus ussuriensis as substrate． The most optimal culture parameters for TN02A7-He-mnp2 to produce MnP were similar to
those of TN02A7-He-mnp1，but only hemin 0. 03 g·L － 1 and at 220 r·min － 1 shaking condition． Under above-mentioned
optimal culture conditions，the highest MnP activity reached 133. 62 and 147. 09 U·L － 1 after 120 h culture for TN02A7-
林 业 科 学 52 卷
He-mnp1 and TN02A7-He-mnp2，respectively，which was 2. 89 and 3. 46 times higher than that produced at initial
conditions． Decolorization tests showed that decolorization percents of two strains to heterocyclic dye neutral red and azo
dye congo red surpassed 58% at 4 h，as high as or nearly to 100% at 16 h to neutral red and 20 h to congo red，
respectively．【Conclusion】The MnP yield produced by two A． nidulans tranformants could be enhanced under optimal
medium composition and culture conditions，and optimized extracellular MnP solutions of two strains could effectively
decolorize heterocyclic dye neutral red and azo dye congo red．
Key words: manganese peroxidase(MnP); Aspergillus nidulans; tranformant; optimized culture; dye decolorization
染料按其化学结构中的特征基团不同可分为偶
氮、蒽醌、靛类、酞菁、硫化、甲川、三苯基甲烷和杂环
8 类。在印染、纺织和造纸等领域，各种染料的使用
非常普遍，其工业废水中不仅含有以芳烃及杂环化
合物为母体并带有偶氮基等显色基团和磺酸基、羟
基和氨基等极性基团的染料成分，而且还含有较多
的原料和副产品，如卤化物、硝基物、苯胺、酚类以及
无机盐等，对人体及生态环境构成很大的威胁，已成
为严重的污染源和国际性环保难题( Shakeri et al．，
2008; 郑永良等，2008)。目前，人们积极探索能够
有效降解染料的方法，使其变成环境友好无公害的
物质，因此合成染料的脱色降解研究意义重大。利
用经济有效的投菌法和生物酶法对染料进行生物脱
色，可避免化学和物理方法漂白染料带来的二次污
染及高成本、低效益的弊端(Modi et al．，2010)。木
质素是由苯丙烷单元经过碳碳键和碳氧键相互连接
和无规则偶合而成的，很多染料与木质素的基本结
构相似，大多具有芳香环或杂环，而白腐真菌天然具
有降解木质素的特性，具有非特异性的胞外氧化降
解酶系统，对染料等异生物质具有广谱的降解能力。
锰过氧化物酶 ( manganese preoxidases -MnPs; EC
1. 11. 1. 13)是白腐菌分泌的 1 种糖基化胞外过氧化
物酶，是启动木质素降解的关键酶，能裂解木质素聚
合物和染料中的侧链和芳环部分:一方面，依赖
Mn2 +的 MnP 能优先氧化存在于木材和土壤中的
Mn2 +，以 Mn2 +作为首选还原底物即电子供体，使其
变成高度活性强氧化态的 Mn3 +，被草酸、丙二酸、苹
果酸、酒石酸、乳酸等有机酸螯合后的 Mn3 +作为可
扩散的氧化还原介质，非特异性地进攻和氧化占木
质素结构单元 10% 的芳香环酚结构，螯合的 Mn3 +
可氧化各种单酚和二聚酚、一些甲氧基、硝基、氯代
芳香族化合物和有机酸; 另一方面，不饱和脂肪酸
类结构经过 MnP 的过氧化作用，可以产生瞬间的脂
肪过氧化基团中介体，这些中介体能够氧化木质素
非酚的亚基，使得 MnP 可以切断原先不能切断的化
合键如非酚类的芳基醚、某些多环的芳香族碳氢化
合物。木质素和染料中的酚和非酚结构被氧化后形
成不稳定的、易于自发裂解的苯氧基团自由基，会进
行一系列非酶催化的自发裂解反应继续裂解，从而
进行木材的最初脱木质素作用，最终导致木质素大
分子和染料发色基团的断裂和脱色 ( Hofrichter，
2002; 王慧等，2009)。近些年来，国内外很多研究
者都利用 MnPs 进行了降解二氯苯胺、多氯联苯等
有机污染物及纸浆漂白和染料脱色的研究。
对产酶条件的完善和优化至关重要。为了实现
高效表达从而提高 MnP 基因的表达产量，一方面可
进行基因转化与表达，另一方面可进行培养基成分
和培养条件的综合调控，从而大幅度提高优良菌种
的产酶水平。Larrondo 等(2001)研究发现，构巢曲
霉(Aspergillus nidulans)适合白腐菌外源基因有效的
表达和分泌，是理想的宿主表达菌株。尹立伟等
(2013) 和尹立伟 ( 2013 ) 已将猴头菌 ( Hericium
erinaceum)的 MnP1 和 MnP2 基因转入到了构巢曲霉
尿嘧啶尿苷营养缺陷菌株 TN02A7 的原生质体中，
获得 了 2 个 转 化 子 菌 株 TN02A7-He-mnp1 和
TN02A7-He-mnp2。本文在此基础上，对构巢曲霉这
2 个 MnP 基因转化子菌株产 MnP 的初始培养条件
进行优化，然后用优化后的酶液对 3 种染料进行脱
色研究，旨在提高 MnP 的酶活性，以便后期对其纯
化研究其酶学性质，并最终在生产实践中得到实际
应用。
1 材料与方法
1. 1 菌种来源、培养基与菌种复壮
猴头菌 MnP1 和 MnP2 基因的 2 个构巢曲霉转
化子菌株 TN02A7-He-mnp1 和 TN02A7-He-mnp2 由
东北林业大学林学院森林病虫病理实验室提供，保
存在 MMPGRT 平板培养基上，4 ℃冰箱冷藏。
MMPGRT 培养基( L － 1 )按照曹进玲 (2011)方
法配制。
取出在冰箱中冷藏的 MMPGRT 平板培养基上
的构巢曲霉转化子菌株，室温下静置 24 h 后，转接
入新的 MMPGRT 平板培养基上，37 ℃下培养 5 天
即可长满平板。然后再进行 1 次转接培养 5 天，此
67
第 4 期 孙世娜等: 构巢曲霉转化子菌株产 MnP 条件优化及对 3 种染料的脱色
时菌种的生长势最旺盛。以后试验中所用菌块，均
取自第 2 次转接培养到第 5 天的菌种。
1. 2 MnP 培养条件的优化
每项试验对 2 个构巢曲霉转化子菌株都进行 3
组重复。
1. 2. 1 初始培养以及酶活性的测定 在 100 mL 三
角瓶中加入 50 mL MMPGRT 培养液，并加入 2 g 青
杨木屑作为产酶底物，调 pH 值为 6. 5，121 ℃灭菌
20 min，然后加入 2 个 φ = 10 mm 的菌块，于 37 ℃、
220 r·min － 1下摇床培养 (尹立伟等，2013)。分别
在培养 0，24，48，72，96，120，144 h 时各提取 1 mL
培养液，6 000 r·min － 1离心 5 min，取上清液测酶活
性(池玉杰等，2009)。以 1 mL 去离子水作为对照，
测定 470 nm 处吸光度在 1 min 内的变化值。酶活
性单位(U·L － 1 ): 上述条件下，每分钟催化 1 μmol
2，6 － DMP 所需的酶量。酶活性的计算公式如下:
酶活性 =［106 × V1 × ΔA × N］/［V2 × ε × Δt］。
式中: V1 为反应总体积; V2 为酶液的体积; N 为酶
液 稀 释 倍 数; ε 为 摩 尔 消 光 系 数，ε470 =
49 600 mol·L － 1 cm － 1; Δt 为反应时间; ΔA 为反应时
间内吸光度的变化增量。
1. 2. 2 最适产酶温度的筛选 在明确了 2 个构巢
曲霉转化子菌株产 MnP 酶活性随时间变化的规律
后，先对培养温度进行筛选验证。尽量选用适于 2
个菌株生长和产酶的温度范围，因此选定在 29，33，
37，41 ℃下摇床培养与检测酶活性，以进一步确证
最适产酶温度。
1. 2. 3 4 因素 3 水平正交试验 Mn2 +浓度( Scheel
et al．，2000; Nüske et al．，2002)、添加与不添加血红
素及其浓度(尹立伟等，2013)、培养液 pH 值(张玉
龙等，2011)、培养方式 (振荡 /静置)、转速等都是
影响构巢曲霉转化子菌株分泌 MnP 的主要因素，因
此在正交试验设计中应先固定那些对产酶影响较小
和难于控制的因素，而选取一些对产酶影响较大并
易于控制的因素作为试验因素。本项正交试验在各
单因素预试验的基础上，进行了血红素浓度 A
( g·L － 1)、Mn2 +浓度 B(μmol·L1)、pH 值 C 和转速 D
( r·min － 1)4 个因素在 3 个水平下 (表 1)酶活性的
检测和筛选。选择各因素水平的原则是将参数的水
平区间拉开，尽可能使最适区域包含在设定的水平
区间内。采用 SPASS 软件设计了 4 因素 3 水平 L9
(34)正交表，在最适产酶温度 37 ℃下，对 2 个构巢
曲霉转化子菌株分别进行 9 组不同组合的正交试
验，然后在预计酶活性最高时的 120 h 测定酶活性。
表 1 2 个构巢曲霉转化子产 MnP 正交试验因素水平设计
Tab． 1 The factors and levels of the orthogonal design for TN02A7-He-mnp1and mnp2 to produce MnP
水平
Level
血红素浓度 A
Heme concentration /( g·L － 1 )
Mn2 + 浓度 B
Mn2 + concentration /(μmol·L － 1 )
pH C
转速 D
Revolution /( r·min － 1 )
1 0. 03 0 5. 5 0
2 0. 05 26. 7 6. 5 180
3 0. 07 267 7. 5 220
1. 2. 4 固 体 培 养 基 加 入 优 化 后 的 条 件 对
MMPGRT 固体平板培养基进行优化，即分别在培养
基中添加最适量的血红素和 MnSO4，并调节 pH 值
到最适。分别在平板中心接入 2 个构巢曲霉转化子
菌株的菌块各 1 块，在 37 ℃下培养，观察并记录 2
个菌株的生长势，然后以其上 φ = 10 mm 的菌块为
接种体应用于优化后的液体培养基，以没有优化的
MMPGRT 固体平板培养基上 φ = 10 mm 的菌块为接
种体作为对照，检测优化后的液体培养基内的酶活
性，研究优化后的 MMPGRT 固体培养基其上的菌体
作为接种体对后续液体培养酶活性的影响。
1. 2. 5 优化培养验证试验 对于 2 个构巢曲霉转
化子菌株，分别以优化后的 MMPGRT 固体培养基其
上的菌体为接种体，应用于后续优化的液体培养基
内进行培养，以没有优化的 MMPGRT 固体平板培养
基上的菌体为接种体接种于初始的液体培养基内培
养作为对照，共 4 组试验，每组 5 个平行，验证优化
产酶条件的结果。
1. 3 2 个构巢曲霉转化子菌株胞外培养液对 3 种
染料的脱色试验
一种特定成分的染料水溶液在特定波长下都有
最大的光密度值，通过这一特性可以检测染料的浓
度。本研究选择偶氮类的刚果红、杂环类的中性红、
三苯 基 甲烷 类的结 晶紫 3 种染 料，分 别 配 制
50 mg·L － 1溶液，用紫外分光光度计在波长 300 ～
800 nm 区间内进行扫描，以得到各染料最大吸收峰
光谱，从中查找最大吸收峰处的吸光值及与其对应
的波数，以去离子水为对照。
将 2 个菌株按照 1. 2. 5 中的优化条件进行培
养，第 5 天时产酶量都达到最大值，这时将菌丝滤
除，分设成试验组和对照，试验组向培养液中分别加
入终浓度为 50 mg·L － 1的 3 种染料，对照不加染料，
77
林 业 科 学 52 卷
静止培养，在 5 min，4 h，8 h，12 h，16 h，20 h 时，在
最大吸收峰处的波数下测其吸光值，试验组的吸光
值减去对照的吸光值记为 Ai值，以含 50 mg·L
－ 13 种
不同染料水溶液的吸光值减去对照菌液的吸光值记
为 A0值，取 3 组数据的平均值。2 个菌株胞外培养
液对 3 种染料的脱色率计算公式为: 脱色率(% ) =
［(A0 － Ai) /A0］× 100%。然后绘制 3 种染料脱色率
随时间的变化图。
2 结果与分析
2. 1 初始培养条件下产 MnP 的活性
在 初 始 培 养 条 件 下，TN02A7-He-mnp1 和
TN02A7-He-mnp2 分 别 产 TN02A7-He-MnP1 和
TN02A7-He-MnP2 的活性见图 1，3 组重复数据的误
差线标注其上。从图中可以看出，TN02A7-He-mnp1
和 TN02A7-He-mnp2 产 MnP 的活性规律随时间变化
的趋势是一致的: 从开始接入菌块到 120 h 后，酶活
性呈不断上升趋势，在 72 ～ 120 h 之间酶性活增长
迅速，在 120 h 时 2 个菌株产酶活性都达到最高，分
别为 45. 46 和 42. 74 U·L － 1，以后产酶活性都迅速
下降。总的来看，TN02A7-He-mnp1 产 TN02A7-He-
MnP1 的活性略高于 TN02A7-He-mnp2 产 TN02A7-
He-MnP2 的活性。
图 1 初始培养条件下 TN02A7-He-mnp1 和
TN02A7-He-mnp2 产 MnP 的活性
Fig． 1 MnP activity over time produced by
TN02A7-He-mnp1 and TN02A7-He-mnp2
2. 2 不同温度对 MnP 活性的影响
在 29，33，37，41 ℃ 4 种培养温度下，同时对 2
个构巢曲霉转化子菌株进行培养，检测了 96 和
120 h下的酶活性如图 2 所示。在 37 ℃下，2 个菌株
产 MnP 的活性均为最高，因此 37 ℃是 2 个菌株产
MnP 的最适温度，都是在 120 h 达到最高。同时，在
29，33 ℃下，2 个菌株产 MnP 的最大酶活性均出现
在 96 h; 而在 37，41 ℃下，2 个菌株产 MnP 的最大
酶活性均出现在 120 h。
图 2 TN02A7-He-mnp1 和 TN02A7-He-mnp2
在 4 种温度下的 MnP 活性
Fig． 2 MnP activity of TN02A7-He-mnp1 and
TN02A7-He-mnp2 at four different temperatures
2. 3 正交试验结果
2 个构巢曲霉转化子菌株 TN02A7-He-mnp1 和
TN02A7-He-mnp2 产 MnP 的正交试验结果见表 2。
通过比较正交试验 4 因素 3 水平的均值 ki，得到各
因素的最大平均值，从而得出最佳培养方案。
TN02A7-He-mnp1 产 TN02A7-He-MnP1 的最佳培养
方案是 A2B3C3D2，即血红素浓度为 0. 05 g·L
－ 1、
Mn2 +浓度为 267 μmol·L － 1、pH 值为 7. 5、摇床转速
为 180 r·min － 1。通过极差和方差分析可得出 4 个
因素对 TN02A7-He-MnP1 酶活性影响的主次顺序为
A ＞ C ＞ B ＞ D，即血红素对 TN02A7-He-MnP1 酶活
性影响最大，其次是 pH 值、Mn2 + 浓度、摇床转速。
TN02A7-He-mnp2 产 TN02A7-He-MnP2 的最佳培养
方案是 A1B3C3D3，即血红素浓度为 0. 03 g·L
－ 1、
Mn2 +浓度为 267 μmol·L － 1、pH 值为 7. 5、摇床转速
为 220 r·min － 1。通过极差和方差分析可得出 4 个
因素对 TN02A7-He-MnP2 酶活性影响的主次顺序为
A ＞ D ＞ B ＞ C，即血红素对 TN02A7-He-MnP2 酶活
性影响最大，其次是摇床转速、Mn2 +浓度、pH 值。
2. 4 固体培养基加入优化条件后的结果
对于 TN02A7-He-mnp1，在 MMPGRT 固体平板
培养基中添加 0. 05 g·L － 1血红素和 267 μmol·L － 1
MnSO4; 对于 TN02A7-He-mnp2，在 MMPGRT 固体平
板培养基中添加 0. 03 g·L － 1血红素和 267 μmol·L － 1
MnSO4 ; 并且都调节 pH 值为 7. 5。分别在平板中心
接入 2 个菌株的菌块进行培养，结果发现 2 个菌株
的生长速度都减慢，要到 144 h 才能基本长满平板
87
第 4 期 孙世娜等: 构巢曲霉转化子菌株产 MnP 条件优化及对 3 种染料的脱色
培养基(没有添加血红素和 MnSO4 时都是 120 h 长
满平板)。后期继续进行液体培养试验测其酶活
性，发现 96 h 时 TN02A7-He-mnp1 产 TN02A7-He-
MnP1 的酶活性达到最高，而 TN02A7-He-mnp2 产
TN02A7-He-MnP2 仍是在 120 h 的酶活性略高于 96
h，即前期的优化可使 TN02A7-He-mnp1 产 TN02A7-
He-MnP1 的酶活性最高峰提前 1 天出现。
表 2 构巢曲霉 2 个转化子菌株产 MnP 正交试验结果
Tab． 2 Orthogonal test results of MnP produced by TN02A7-He-mnp1 and TN02A7-He-mnp2
试验组号
Group No．
因素 Factor 在 120 h MnP 活力 MnP activity /(U·L － 1 )
A B C D MnP1 MnP2
1 1 1 1 1 43. 35 66. 94
2 1 2 2 2 116. 94 75. 00
3 1 3 3 3 120. 97 164. 92
4 2 1 2 3 76. 61 75. 00
5 2 2 3 1 123. 99 40. 32
6 2 3 1 2 120. 97 51. 21
7 3 1 3 2 62. 50 32. 66
8 3 2 1 3 29. 23 24. 60
9 3 3 2 1 47. 38 33. 47
TN02A7-He-mnp1
各因素水平均值
Mean value of
three levels
k1 93. 75 60. 82 64. 52 71. 57
k2 107. 19 90. 05 80. 31 100. 13
k3 46. 37 96. 44 102. 49 75. 60
菌株 1 极差 Maximal range 60. 82 35. 62 37. 97 28. 56
菌株 1 最适合水平
The most optimal level
2 3 3 2
TN02A7-He-mnp2
各因素水平均值
Mean value of
three levels
k1 102. 28 58. 20 47. 58 46. 91
k2 55. 51 46. 64 61. 16 52. 96
k3 30. 24 83. 20 79. 30 88. 17
菌株 2 极差 Maximal range 72. 04 36. 56 31. 72 41. 26
菌株 2 最适合水平
The most optimal level
1 3 3 3
2. 5 优化培养验证试验结果
对于 2 个构巢曲霉转化子菌株，以没有优化的
MMPGRT 固体平板培养基上的菌体为接种体接种于
初始的液体培养基内培养作为对照，TN02A7-He-
mnp1 产 TN02A7-He-MnP1 在 120 h 时酶活性达到最
高为 46. 21 U·L － 1，TN02A7-He-mnp2 产 TN02A7-He-
MnP2 在 120 h 时酶活性也达到最高为 42. 56 U·L － 1;
以优化后的 MMPGRT 固体培养基其上的菌体作为
接种体，应用于后续优化的液体培养基内进行培养，
TN02A7-He-mnp1 产 TN02A7-He-MnP1 在 96 h 时酶
活性达到最高为 133. 62 U·L － 1，是初始条件下培养
的 2. 89 倍; TN02A7-He-mnp2 产 TN02A7-He-MnP2
在 120 h 时酶活性达到最高为 147. 09 U·L － 1，是初
始条件下培养的 3. 46 倍。
综合以上在初始条件下进行培养、最适产酶温
度的单因素试验、4 因素 3 水平的正交试验、固体培
养基加入优化条件后试验及优化培养验证试验，可
得出 2 个构巢曲霉转化子菌株产 MnP 的优化培养条
件。TN02A7-He-mnp1 产 TN02A7-He-MnP1 的最佳
培养方案是: 在 MMPGRT 固体平板培养基中添加
0. 05 g·L － 1血红素和 267 μmol·L － 1 MnSO4，在37 ℃
下培养至 144 h 后，取 2 个 φ = 10 mm 的菌块接入到
后续的优化液体培养基中。液体培养基是在100 mL
三角瓶中接入 50 mL MMPGRT 培养液，并加入 2 g
青杨木屑作为产酶底物，以及 0. 05 g·L － 1血红素、
267 μmol· L － 1 MnSO4、调 节 pH 值 至 7. 5、在
180 r·min － 1 摇 床 转 速 下 于 37 ℃ 进 行 培 养。
TN02A7-He-mnp2 产 TN02A7-He-MnP2 的最佳培养
方案 是: 在 MMPGRT 固体平 板培 养 基中 添 加
0. 03 g·L － 1血红素和 267 μmol·L － 1 MnSO4，在 37 ℃
下培养至 144 h 后，取 2 个 φ = 10 mm 的菌块接入到
后续的优化液体培养基中。液体培养基是在 100 mL
三角瓶中接入 50 mL MMPGRT 培养液，并加入 2 g
青杨木屑作为产酶底物，以及 0. 03 g·L － 1血红素、
267 μmol·L － 1 MnSO4、调 节 pH 值 到 7. 5、在
220 r·min － 1摇床转速下于 37 ℃进行培养。
2. 6 染料的脱色试验结果
利用紫外分光光度计在波长 300 ～ 800 nm 区间
97
林 业 科 学 52 卷
内进行扫描，得到了 3 种染料的最大吸收峰光谱，从
中查找到最大吸收峰处的吸光值及与其对应的波
数: 刚果红在 496 nm 处有最大吸收峰值 Abs =
1. 90; 中性红在 485 nm 处有最大吸收峰值 Abs =
2. 317; 结 晶 紫 在 529 nm 处 有 最 大 吸 收 峰 值
Abs = 1. 676。
2 个构巢曲霉转化子菌株在第 5 天产酶量最高
时的培养液对 3 种染料脱色率随时间的变化如图 3
所示。TN02A7-He-mnp1 和 TN02A7-He-mnp2 的培养
液对 3 种结构类型的染料都有很大程度的脱色，尤
其对杂环类的中性红和双偶氮类的刚果红脱色效果
显著。脱色率都是随着时间的延长而增高，在 4 h 时
均达到 58% 以上的脱色率; 在 16 h，TN02A7-He-
mnp1 和 TN02A7-He-mnp2 对中性红的脱色率分别为
98. 78% 和 100%，在 20 h 都为 100% ; 在 20 h，
TN02A7-He-mnp1 和 TN02A7-He-mnp2 对刚果红的脱
色率分别为 100%和 97. 43%，对结晶紫的脱色率分
别为 85. 82%和 80. 23%。
图 3 2 个转化子菌株 MnP 活性优化后的
胞外酶液对 3 种染料脱色率随时间的变化
Fig． 3 The decolorization percents of extracellular enzyme
solution to three kinds of dyes of TN02A7-He-mnp1
and TN02A7-He-mnp2
3 结论与讨论
本研究结果表明，通过优化培养基成分与条件
可较大程度地提高 2 个构巢曲霉转化子菌株 MnP 的
产酶量，TN02A7-He-mnp1 和 TN02A7-He-mnp2 对杂
环类染料中性红、偶氮类染料刚果红都有高效的脱
色作用，对结晶紫的脱色率也相对较高，表明 2 个菌
株对含有中性红和刚果红的工业染料废水具有极强
的处理应用潜能。
最适产酶温度试验表明 37 ℃ 是 2 个菌株产
MnP 的最适温度，与构巢曲霉菌丝体的最适生长温
度一致，有利于培养。前期固体培养基中也加入血
红素和 MnSO4，并于 pH 值为 7. 5 的环境中培养，虽
然其生长势并不如未优化时，但转入液体培养基后，
菌块能更快地适应环境，缩短后期培养时间。酶活
性优化培养的结果也表明，2 个构巢曲霉转化子菌株
产 MnP 的优化培养条件相似，酶活性也相近，但二
者与大多数白腐菌相比，产酶高峰提早出现很多，表
明在实际应用中潜能更大。
细菌、放线菌和真菌等微生物对各种染料都有
脱色功能，脱色能力和参与脱色降解的酶不尽相同，
对漆酶、MnP、木质素过氧化物酶 ( LiP)等酶的脱色
效果都有研究。任随周等(2006)研究表明，嗜水气
单胞菌(Aeromonas hydrophila)菌株 DN322 所产的细
菌脱色酶 TpmD 对 4 种三苯基甲烷类染料结晶紫、
碱性品红、灿烂绿和孔雀绿都具有较强的脱色能力，
结晶紫是该酶的最适反应底物。司静等(2012)研究
表明，东方栓孔菌 ( Trametes orientalis)菌株Cui 6300
的菌体加漆酶粗酶液对结晶紫、刚果红、铬天青、中
性红和亚甲基蓝 5 种染料都有脱色作用，在24 h时
其粗漆酶液对 5 种染料的脱色率在 15% ～ 35% 之
间，96 h 后粗漆酶液对结晶紫脱色效果最好，达到
90. 36%，对刚果红的脱色率次之，为 86. 57%，对铬
天青和中性红的脱色率都在 60%以上，对亚甲基蓝
的脱色率超过 40%。糙皮侧耳(Pleurotus ostreatus)
纯化后的漆酶在添加小分子介体物质 2，2 －连氮 －
双(3 －乙基苯并噻唑 － 6 －磺酸)(ABTS)、对 －甲氧
基酚、黎芦醇条件下，提高了对蒽醌染料活性亮蓝
SN4R 的脱色率(侯红漫，2003)。韩国民等(2011)
研究表明，冷杉附毛孔菌(Trichaptum abietinum)菌株
1302BG 对苯胺蓝、橙黄 G、刚果红、甲基橙、酸性品
红、甲基紫、结晶紫、碱性品红、番红花红 9 种染料都
具有脱色能力，优化后的液体培养基在经高压灭菌
处理后的培养液、非灭菌敞开式摇动培养及外加微
生物污染条件下的 3 种培养液的脱色能力都很相
似，在 24 h 对酸性品红的脱色率超过 96%，对刚果
红的脱色率超过 90%，在 48 h 对 2 种染料的脱色率
均接近 100%。章燕芳等(2002)研究了黄孢原毛平
革菌 (Phanerochaete chrysosporium)含有菌体、LiP 和
MnP 的培养液对 6 种染料的脱色，其中对甲基橙、橙
I、次甲基蓝脱色率为 90%，对刚果红和直接湖蓝的
脱色率为 80%，对结晶紫的脱色率为 60%。连小英
(2009)采用细胞固定化技术以提高 P． chrysosporium
对 MnP 的合成水平，并利用菌体及所产 MnP 对蒽醌
染料酸性蓝 45 脱色降解，当染料浓度在 200 ～ 600
mg·L － 1时，该体系的脱色率在98. 26% ～ 94. 96% 之
间。程晓滨(2007)对裂褶菌 F17( Schizophyllum sp．
F17)所产的 MnP 进行了纯化，纯化后的 MnP 能够有
08
第 4 期 孙世娜等: 构巢曲霉转化子菌株产 MnP 条件优化及对 3 种染料的脱色
效对 3 种偶氮染料刚果红、金橙 G 和橙黄Ⅳ进行脱
色，用明胶制成的固定化酶对 3 种染料的脱色能力
与游离酶接近。李旭东等 (2008)采用稻壳作为基
质，对 Schizophyllum sp． F17 进行固态发酵产 MnP，
优化后的发酵体系对 5 种不同结构类型的染料结晶
紫、Poly R-478、刚果红、茜素红、中性红于 24 h 脱色
率分 别 高 达 95. 6%，93. 1%，92. 6%，90. 3 % 和
87. 3%。Asgher 等(2013)对 P． ostreatus 菌株 IBL-02
在麦草上产生的 MnP，纯化后用液胶 －凝胶固定化，
其对 4 种纺织工业废水具有高效的脱色作用。与上
述研究比较，无论在脱色速度还是脱色率上，本试验
2 个构巢曲霉转化子菌株对中性红和刚果红的脱色
都有较明显的优势。
白腐菌所产漆酶对多种染料都有脱色能力，如
漆酶对酸性橙(卢蓉等，2005)、依利尼尔兰、尼龙山
红、溴酚蓝和中性黑(张玉等，2006)、结晶紫、靛红、
活性黑 KN-B(赵丽艳等，2011)等在特定条件下都
能脱色。但是，这些结果有的是菌体加上粗酶液的
脱色效果，除了菌体的吸附脱色功效外，粗酶液很可
能是漆酶和 MnP 混合酶液的效果，而不单单只是漆
酶的功效。
参 考 文 献
曹进玲 ． 2011． 钙离子通道蛋白 MidA 在构巢曲霉中的功能特征研
究 ．南京: 南京师范大学硕士学位论文 ．
(Cao J L． 2011． Study on the functional characters of stretch-activated
Ca2 + channel protein MidA in Aspergillus nidulans． Nanjing: MS
thesis of Nanjing Normal University． ［in Chinese］)
程晓滨 ． 2007． 裂褶菌 F17 锰过氧化物酶的分离纯化及其对偶氮染
料脱色的研究 ．合肥: 安徽大学硕士学位论文 ．
(Cheng X B． 2007． Purification of a new manganese peroxidase of the
white-rot fungus Schizophyllum sp． F17 and decolorization of azo dyes
by the enzyme． Hefei:MS thesis of Anhui University． ［in Chinese］)
池玉杰，闫洪波 ． 2009． 红平菇木质素降解酶系统漆酶、锰过氧化物酶
及木质素过氧化物酶的检测 ．林业科学，45(12) : 154 － 158．
(Chi Y J，Yan H B． 2009． Detection on laccase，manganese peroxidase
and lignin peroxidase in ligninolytic enzymes of Pleurotus djamor．
Scientia Silvae Sinicae，45(12) : 154 － 158． ［in Chinese］)
韩国民，何兴兵，张 鹏，等 ． 2011． 多孔菌 Trichaptum abietinum
1302BG 自然条件下对合成染料刚果红和酸性品红的高效降解 ．
微生物学通报，38(4) : 603 － 614．
(Han G M，He X B，Zhang P，et al． 2011． Efficient degradation of
polyporus fungus Trichaptum abietinum 1302BG on the synthetic dyes
congo red and fuchsin acid under non-sterile condition． Microbiology
China，38(4) : 603 － 614． ［in Chinese］)
侯红漫 ． 2003． 白腐菌 Pleurotus ostreatus 漆酶及对蒽醌染料和碱木素
脱色的研究 ． 大连: 大连理工大学博士学位论文 ．
(Hou H M． 2003． Study on the laccase from white-rot fungus Pleurotus
ostreatus and its decolorization for anthraquinone dye and alkali
lignin． Dalian: PhD thesis of Dalian University of Technology． ［in
Chinese］)
李旭东，荚 荣，程晓滨，等 ． 2008． 锰过氧化物酶的固态发酵及其对
染料的脱色作用 ． 环境科学学报，28(3) : 490 － 495．
(Li X D，Jia R，Cheng X B，et al． 2008． Solid-state fermentation of
MnP and decolorization of dyes． Acta Scientiae Circumstantiae，
28(3) : 490 － 495．［in Chinese］)
连小英 ． 2009． 黄孢原毛平革菌产锰酶及其对酸性蓝 45 的脱色研
究 ．西安: 长安大学硕士学位论文 ．
(Lian X Y． 2009． Study on Decolorization of Acid Blue 45 by MnP
peroxidase of Phanerochaete chrysosporium． Xi’an: MS thesis of
Chang’an University． ［in Chinese］)
卢 蓉，沈雪亮，夏黎明 ． 2005． 彩绒革盖菌产漆酶及其对染料脱色
的研究 ． 林产化学与工业，25(1) : 73 － 76．
(Lu R，Shen X L，Xia L M． 2005． Studieson on laccase prodution by
Coriolus versicolor and enzymatic decoloration of dey． Chemistry and
Industry of Forest Products，25(1) : 73 － 76． ［in Chinese］)
任随周，郭 俊，王亚丽，等 ． 2006． 细菌脱色酶 TpmD 对三苯基甲烷
类染料脱色的酶学特性研究 ． 微生物学报，46(3) :385 － 389．
( Ren S Z， Guo J， Wang Y L， et al． 2006． Properties of a
triphenylmethane dyes decolorization enzyme TpmD from Aeromonas
hydrophila strain DN322． Acta Microbiologica Sinica， 46 ( 3 ) :
385 － 389．［in Chinese］)
司 静，崔宝凯，戴玉成 ． 2011． 东方栓孔菌在染料脱色中的应用及
其脱色条件的优化 ． 基因组学与应用生物学，30(3) : 364 － 371．
( Si J，Cui B K，Dai Y C． 2011． Application in dye decolorization and
optimization of conditions in discoloration by Trametes orierctalis．
Genomics and Applied Biology，30(3) : 364 － 371． ［in Chinese］)
王 慧，郑小伟，王宾香，等 ． 2009． 真菌对染料的脱色研究进展 ．
应用与环境生物学报，15(1) : 147 － 151．
(Wang H， Zheng X W， Wang Y B， et al． 2009． Advance in
decolorization of dye by fungi． Chin J Appl Environ Biol，15 (1 ) :
147 － 151．［in Chinese］)
尹立伟，池玉杰 ． 2013． 猴头菌锰过氧化物酶 1 基因在构巢曲霉的异
源转化与表达 ．林业科学研究，26(4) : 480 － 487．
(Yin L W，Chi Y J． 2013． Heterologous transformation and expression of
Hericium erinaceum manganese peroxidase 1 gene in Aspergillus
nidulans． Forest Research，26(4) : 480 － 487． ［in Chinese］)
尹立伟 ． 2013． 猴头菌锰过氧化物酶基因克隆及在构巢曲霉中的表
达 ． 哈尔滨: 东北林业大学博士学位论文 ．
(Yin L W． 2013． Cloning and heterologous expression in Aspergillus
nidulans of genes encoding manganese peroxidase from Hericium
erinaceum． Harbin: PhD thesis of Northeast Forestry University． ［in
Chinese］)
章燕芳，李华钟，华兆哲，等 2002． 黄孢原毛平革菌合成的木质素过
氧化物酶、锰过氧化物酶及其菌球在染料脱色过程中的作用 ． 过
程工程学报，2(3) : 247 － 249．
(Zhang Y F，Li H Z，Hua Z Z，et al． 2002． Roles of lignin peroxidase，
manganese peroxidase and pellet of Phanerochaete chrysosporium in
decoloration of dyes． The Chinese Journal of Process Engineering，
2(3) : 247 － 249． ［in Chinese］)
张 玉，洪 枫 ． 2006． 优化彩绒革盖菌产漆酶条件及染料脱色研
究 ． 林产化学与工业，26(3) : 42 － 46．
18
林 业 科 学 52 卷
(Zhang Y，Hong F． 2006． Optimization of culture conditions for laccase
production by Trametes versicolor and dye decolorization by the crude
laccase． Chemistry and Industry of Forest Products，26 ( 3 ) : 42 －
46．［in Chinese］)
张玉龙，池玉杰，闫洪波 ． 2011． 偏肿栓菌产锰过氧化物酶条件优化 ．
林业科学，47(8) : 88 － 94．
(Zhang Y L， Chi Y J， Yan H B． 2011． Optimization of ferment
conditions of manganese peroxidase produced by Trametes gibbosa．
Scientia Silvae Sinicae，47(8) : 88 － 94． ［in Chinese］)
赵丽艳，赵 敏，卢 磊，等 ． 2011． 一色齿毛菌漆酶—介体系统在染
料脱色中的应用 ． 北京林业大学学报，33(4) : 134 － 139．
(Zhao L Y，Zhao M，Lu L，et al． 2011． Application of Cerrena unicolor
laccase-mediator system in dye decolorization． Journal of Beijing
Forestry University，33(4) : 134 － 139． ［in Chinese］)
郑永良，钟玉林，徐 红，等 ． 2008． 染料脱色菌株的筛选及其特性
研究 ． 华中师范大学学报: 自然科学版，42(3) : 444 － 447．
( Zheng Y L，Zhong Y L，Xu H，et al． 2008． Isolation and characteristic
of bacteria on dye decolorization and their characteristics studies．
Journal of Huazhong Normal University: Natural Science，42 ( 3 ) :
444 － 447．［in Chinese］)
Asgher M，Aslam B，Iqbal H M N． 2013． Novel catalytic and effluent
decolorization functionalities of sol-gel immobilized Pleurotus ostreatus
IBL-02 manganese peroxidase produced from bio-processing of wheat
straw． Chinese Journal of Catalysis，34(9) : 1756 － 1761．
Hofrichter M． 2002． Review: lignin conversion by manganese peroxidase
(MnP) ． Enzyme and Microbial Technology，30(4) :454 － 466．
Larrondo L F，Lobos S，Stewart P J，et al． 2001． Isoenzyme multiplicity
and characterization of recombinant manganese peroxidases from
Ceriporiopsis subvermispora and Phanerochaete chrysosporium． Applied
and Environmental Microbiology，67(5) :2070 － 2075．
Modi H A，Rajput G，Ambasana C． 2010． Decolorzation of water soluble
azo dyes by bacterial cultures， isolated from dye house effluent．
Bioresource Technology，101(16) : 6580 － 6583．
Nüske J，Scheibner K，Hofrichter M，et al． 2002． Large scale production
of manganese-peroxidase using agaric white-rot fungi． Enzyme and
Microbial Technology，30(4) :556 － 561．
Scheel T，Hfer M，Ludwig S，et al． 2000． Differential expression of
manganese peroxidase and laccase in white-rot fungi in the presence
of manganese or aromatic compounds． Appl Microbiol Biotechnol，
54(5) :686 － 691．
Shakeri M，Shoda M． 2008． Decolorization of an anthraquinone dye by
the recombinant dye-decolorizing peroxidase( rDyP) immobilized on
mesoporous materials． Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic，
54: 42 － 49．
(责任编辑 石红青)
28