全 文 ：第 24 卷 第 1 期
2011 年 2 月
山 东 科 学
SHANDONG SCIENCE
Vol． 24 No． 1
Feb． 2011
收稿日期:2010-10-13
基金项目:山东省科技发展计划项目(2008GG10002025)
作者简介:张新建(1978 －) ，男，博士，助理研究员，研究方向为微生物的遗传改造，Email:zhxjemail@ gmail． com
通讯作者:杨合同(1966 －) ，男，研究员，研究方向为植物病害生物防治，Email:yanght@ keylab． net
文章编号:1002-4026(2011)01-0022-06
新月菱形藻的紫外诱变及优化培养
张新建，任艳，黄玉杰，宋莉璐，李红梅，赵晓燕，张广志，杨合同*
(山东省科学院中日友好生物技术研究中心，山东省应用微生物重点实验室，山东 济南 250014)
摘要:本实验室通过紫外诱变得到一株富含油脂的新月菱形藻 BC6，在实验室条件下研究了不同温度、光照强
度、pH值、N源含量、NaCl含量等培养条件对 BC6 生长的影响。研究结果表明:最适培养温度在 20 ℃，pH值
为 7． 5，最适光照强度为 54 μE /(m2·s) ，NaNO3 的最适添加量为 105 mg /L，NaCl最适添加量为 27 g /L。在优
化培养条件下，最高细胞密度可达 1． 69 × 106 /mL，比优化前增大了 2． 2 倍。
关键词:新月菱形藻;紫外诱变;培养条件;优化培养
中图分类号:Q949． 2;S216． 2 文献标识码:A
UV-Induction and culture optimization for Nitzschia closterium
ZHANG Xin-jian，REN Yan，HUANG Yu-jie，SONG Li-lu，
LI Hong-mei，ZHAO Xiao-yan，ZHANG Guang-zhi，YANG He-tong
(Shandong Provincial Key Laboratory of Applied Microbiology，Biotechnology
Cener，Shandong Academy of Sciences，Jinan 250014，China)
Abstract:We obtained a strain of oil-rich Nitzschia closterium (BC6)through UV-induction． We
further investigated the effects of different culture conditions such as temperature，irradiance，pH
value，salinity and nitrogen concentration on its growth． The OD680 and growth rate were determined
every two days． Experimental results show that the optimum culture conditions are temperature of
20 ℃，pH value of 7． 5，irradiance of 54 μmol·m-2·s-1，NaNO3 concentration of 105 mg·L
-1
and NaCl concentration of 27 g·L-1 ． Its highest cell density can reach 1． 69 × 106 /mL，2． 2 times
higher than that of non-optimization，under these optimal conditions．
Key words:Nitzschia closterium;UV-induction;culture conditions;culture optimization
新月菱形藻(Nitzschia closterium)属于硅藻门、羽纹纲、双菱形目，是海洋生态系统初级生产力之一，可
以作为甲壳类、双壳类和仔鱼的饵料，在海水养殖业中占有重要地位［1］。据报道，新月菱形藻的总脂肪含量
为 28% ～ 50%［2］，而且富含多种不饱和脂肪酸，尤其是藻体中含有的二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯
酸(DHA)［3］，是开发生物质能源和保健食品的理想材料。做为一种新型能源型生物，新月菱形藻在天然海
水中的密度很低，远不能满足社会对其资源开发及利用的需要。实现新月菱形藻的高密度培养将会产生巨
大的经济及社会效益。因此新月菱形藻的优良藻种选育、大规模养殖以及胞内、外物质的开发应用成为当今
第 1 期 张新建，等:新月菱形藻的紫外诱变及优化培养
海洋微藻生物技术中急需解决的重大课题。
本实验室利用微藻分离技术由海水中分离得到一株油脂含量占细胞干重 47%的微藻，经形态观察和分
子鉴定，确定为新月菱形藻(Nitzschia closterium)。本文以含油量 47%的新月菱形藻为出发藻株，利用紫外线
诱变的方法，进行诱变育种，筛选突变体。并且从理化条件、营养条件对获得的突变藻株 BC6 进行单因子条
件的优化，确立优化配方和最佳培养条件，以提高细胞生物量，为其规模化高密度培养奠定基础。
1 材料与方法
1． 1 材料
1． 1． 1 藻种
新月菱形藻(Nitzschia closterium)及其突变株 BC6 由本实验室筛选获得，其中突变株 BC6 通过紫外诱变
方法选育获得，藻种保藏号:CGMCC No． 3747。采用 f /2 培养基进行藻体的纯化及保存。
1． 1． 2 培养基
f /2 培养基:见参考文献［4］。
1． 2 方法
1． 2． 1 新月菱形藻的培养
按照新月菱形藻与培养基体积比为 1:5 的接种比例接种藻体到含培养基的三角瓶中。采用 f /2 培养
基，温度为 23 ℃，光照强度为 108 μE /(m2·s) ，光暗比为 12 h /12 h，不充气，每天摇动 3 次，每 2 d 取样一
次，连续观测 10 d。
1． 2． 2 新月菱形藻的紫外诱变及筛选
取对数生长期的新月菱形藻置于培养皿中(直径 9 cm) ，使藻体在平皿底部铺为薄层，用 30 W的紫外灯
于 15 cm处照射 8 min。避光培养 24 h 后将各处理组藻液转移到 100 mL 三角瓶中置于正常条件下培养。
以藻株的比生长速率和油脂含量为指标，筛选出较出发藻株更优良的突变体。
1． 2． 3 培养条件优化
1． 2． 3． 1 理化条件
根据新月菱形藻的培养条件，在其他条件不变的前提下，测定不同温度、光强及初始 pH 值对新月菱形
藻的影响。其中设定温度为 15 ℃，20 ℃，23 ℃，26 ℃，30 ℃;设光照强度为 27 μE /(m2·s) ，54 μE /(m2·
s) ，108 μE /(m2·s) ，162 μE /(m2·s) ，216 μE /(m2·s) ;用 0． 1 mol /L 的 HCl 和 NaOH 调节培养基的初始
pH值为 5． 0，6． 0，7． 0，8． 0，9． 0。上述各组，每组分设 2 个平行组。
1． 2． 3． 2 营养条件
根据获得的新月菱形藻的最佳培养条件，以 f /2 培养基为基础，以 NaNO3 为氮源，分别测定不同浓度的
NaNO3 和 NaCl对新月菱形藻的影响。其中 NaNO3 含量分别为 0，45，74． 8，105，120 mg /L;NaCl 含量分别为
0，10，23． 4，27，30 g /L。上述各组，每组分设 2 个平行组。
1． 2． 4 吸光值的测定
取新鲜培养液，3500 r /min 离心 15 min，弃上清液，以无菌 f /2 悬浮，再次离心，定容到一定的体积，用
721 型分光光度计在 OD680nm波长下测定新月菱形藻的吸光值，每个实验重复 3 次，取平均值。
1． 2． 5 细胞计数
取 1 mL藻液稀释适当倍数，加入 2 滴 0． 1%的碘液，杀死藻细胞，于显微镜下用血球计数板计数。
1． 2． 6 油脂含量的测定
采用溶剂浸提法进行总脂含量的检测。将冷冻干燥的藻粉充分研磨，称重，根据藻粉重量，以体积比
1 ︰ 10加入石油醚︰乙醚混合液，10000 r /min 匀浆 10 min，再置于 40℃下，浸提 5h，期间定时振荡混匀。
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山 东 科 学 2011 年
10%的 KOH溶液以沉淀藻细胞，摇匀静止一段时间后，将混合溶液在 6000 r /min，离心 15 min，离心 2 次，收
集上清液于离心管中。60℃水浴迅速蒸去上清液中多余溶剂，称重，计算油脂得率。
1． 2． 7 分析方法
用比色法测定生物量，建立细胞个数与吸光度关系曲线。
1． 2． 8 比生长速率的测定
利用下式计算比生长速率:
μ =(lnNt － lnN0)/ t 式中:μ为比生长速率，t为培养天数(d) ，N0 为培养开始时藻体的吸光值，Nt 为培养
t天后藻体的吸光值。
1． 2． 9 数据处理
结果分析取各相应数据的平均值，用 SPSS统计软件进行数据分析，采用 Excel软件绘制出曲线图。
2 结果与分析
2． 1 新月菱形藻的紫外诱变
利用紫外诱变技术共获得 12 株生长良好的藻种。对这 12 株藻种进行进一步的筛选，根据比生长速率
和油脂含量的测定，最终获得 1 株生长较好的藻种 BC6。本研究中主要对该藻种进行优化培养，以获得最佳
优化条件。
图 1 新月菱形藻的细胞数
与 OD值之间的标准曲线
Fig． 1 The standard curve between cell population
and OD value from N． closterium
2． 2 新月菱形藻生长标准曲线
根据细胞计数及 OD值，建立了新月菱形藻的细胞数与 OD
值之间的标准曲线，见图 1。
2． 3 不同培养条件对新月菱形藻 BC6 生长的影响
其他条件不变的前提下，测定不同温度、光强、不同浓度的
NaNO3 和 NaCl对新月菱形藻的影响，结果见图 2。
新月菱形藻在 15 ～ 26 ℃均能正常生长，培养温度在 20 ℃
时，其生长密度明显高于其他温度，在前 5 d 就表现出较高的生
长速度，比生长速率均保持在 0． 1 d －1以上，第 6 d 时可获得最
高比生长速率 0． 1127 d －1，此后仍能以较快速度生长，到第 10 d
时比生长速率还可高达 0． 07 d －1。当培养温度达到 30 ℃时，前
5 d藻细胞能够正常生长，但此后并没有明显的对数生长期，而且比生长速率随培养时间的延长而逐渐下
降;藻体下沉，凝聚成片状，镜检可见大量死亡藻体。由此可以认为这种新月菱形藻在低温范围有利于生长，
在培养温度为 20℃时可获得最大的比生长速率和最高的吸光值，而高温(30 ℃)最终对生长不利(图 2A)。
图 2B为不同初始 pH值对新月菱形藻的生长影响。藻细胞在生长过程中，由于自身的光合作用使培养
基中 CO2 浓度降低，从而导致培养液的 pH值随之逐渐升高
［5］。培养过程中，在第 5 d 培养结束时 pH 值上
升到 5． 5 ～ 9． 5，因此在第 5 d需再次调节 pH值，直到培养结束。本实验中初始 pH值在 6． 0 ～ 8． 0 范围内
藻细胞生长旺盛，最适 pH值为 7． 0 ～ 7． 5，比生长速率最大可达 0． 125 d －1;而当 pH 值低于 6． 0，高于 8． 0
时，藻细胞的生长速度降低，基本处于抑制状态。
不同光照强度对藻体生长的影响见图 2C。在 54 ～ 108 μE /(m2·s)光强范围内，新月菱形藻均能保持
正常生长。在光照强度为 54 μE /(m2·s)时，藻细胞生长最旺盛，细胞生物量达到最大 1． 31 × 106 /m，比生
长速率达到最高 0． 1 d －1。当光照强度达到 162 μE /(m2·s) ，216 μE /(m2·s)时，接种后前 4 d的生长速度
未有显著变化，但在 5 d后即表现出明显的受抑状态，比生长率随光照强度的增加呈下降趋势，说明新月菱
形藻对强光耐受力较弱，因此培养时取 54 μE /(m2·s)为宜。
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第 1 期 张新建，等:新月菱形藻的紫外诱变及优化培养
A ～ E分别是培养温度、初始 pH值、光照强度、NaNO3 浓度和 Nacl浓度对新月菱形藻生长的影响
图 2 不同培养条件对新月菱形藻生长的影响
Fig． 2 Effects of different cultivation factors on the growth of Nitzschia closterium
图 2D，2E分别是不同浓度的 NaNO3 和 NaCl对新月菱形藻的生长影响。由图 2D可见，N源浓度对藻体
的生长影响较大。当 NaNO3 含量在 74． 8 ～ 105 mg /L时，可获得较高藻体浓度，尤其是当含量达到 105 mg /
L时，比生长速率达到最大值 0． 1217·d －1。但藻体浓度并不是随着 N浓度的升高而升高，当 NaNO3 含量达
到 120 mg /L时，藻体生长开始出现抑制作用，比生长速率降低至 0． 088·d －1。当 NaNO3 低于 74． 8 mg /L
时，藻体生长速度降低，当 NaNO3 含量为 0 mg /L时，藻细胞比生长速率下降至 0． 0587 d
－1，三角瓶中藻体颜
色逐渐变白，而且镜检可见藻体细胞稀少，死亡藻体满布视野。由此可见，N 源浓度是影响新月菱形藻生长
的关键因素。对本实验藻株而言，最适合的 NaNO3 添加量为 105 mg /L。而 NaCl浓度在 23． 4 ～ 30 g /L之间
时，新月菱形藻均能正常生长(图 2E)。尤其 NaCl添加量为 27 g /L时，藻体细胞生长最旺盛，最大比生长速
率达到 0． 1164 d －1;偏低盐度条件下，藻体生长受到抑制，细胞生长缓慢，藻体颜色加深，呈片状，并贴在瓶壁
上;当 NaCl添加量为 0 g /L 时，细胞生长完全受到抑制，镜检结果显示，藻细胞结构受到破坏，细胞大量死
亡。以上结果可以看出，这株新月菱形藻具有很强的盐度耐受性，更适宜在较高的盐度环境下生存。
2． 4 优化培养条件下新月菱形藻 BC6的生长
通过上述实验，新月菱形藻的优化培养条件为温度 20 ℃，初始 pH 值 7． 5，光照强度 54 μE /(m2·s) ，
NaNO3 添加量为 105 mg /L，NaCl添加量为 27 g /L。在该优化培养条件下，测定新月菱形藻的生长状况，同时
以新月菱形藻在 f /2 培养基中生长作为对照。
由图 3 中可以看出，在优化培养条件下，藻细胞生长迅速，对数生长期提前并延长，第 2 ～ 5 d的比生长
速率均保持在 0． 1 d －1以上，其最大生长速率出现在第 2 d，达到 0． 117 d －1;6 ～ 10 d，细胞密度持续增长，到
第 10 d时仍未到达平台期。最高细胞密度可达 1． 69 × 106 /mL，比优化前增大了 2． 2 倍。对照中，新月菱形
藻在第 6 d进入对数生长期，第 8 d后达到平稳期，其最大比生长速率为 0． 074 d －1，细胞生长密度最高达到
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山 东 科 学 2011 年
图 3 最佳培养条件下突变体新月菱形藻的生长曲线
Fig． 3 Growth curve of Nitzschia closterium mutant under
optimized cultivation conditions
7． 6 × 105 /mL。
2． 5 新月菱形藻油脂含量的测定
对野生新月菱形藻和紫外诱变后的突变藻株进行油
脂含量的测定，在优化条件下，野生新月菱形藻的油脂含
量为 50%，而突变藻株 BC6 的油脂含量为 57%，经 SPSS
统计软件分析表明，二者具有显著差异性(P ＜ 0． 05) (图
4)。
3 结果与讨论
本实验利用紫外诱变技术获得一株生长较好的突变藻株
图 4 最佳培养条件下藻株的油脂含量
Fig． 4 Lipid contents of Nitzschia closterium under
optimized cultivation conditions
BC6，对该突变藻株进行理化条件(培养温度、初始 pH值、光
照强度)和营养条件(培养基中 NaNO3 和 NaCl含量)优化。
3． 1 培养温度对突变藻株生长的影响
温度是影响藻类生存的最重要的环境因子，因为任何一
种生物，其生命活动中每个生化过程都要有酶系统的参与，
然而每种酶的活性都有它的最低温度、最适温度、最高温度，
形成了生物生长的“三基点”，一旦超过生物的耐受能力，酶
的活性就将受到制约，藻类同样如此［6］。本研究发现突变藻
株的最适温在 20 ℃，这一结果与周洪琪等［7］的报道相一致。
3． 2 pH值对突变藻株生长的影响
研究表明，pH值的高低直接影响着藻细胞的光和作用，
王铭等［8］在对雨生红球藻的研究中发现，当 pH 值在 7． 5 ～
8． 0 时，雨生红球藻的光和作用表现强烈，净光和速率达到最
高值，此后随 pH值的继续升高，光和速率快速下降，这是因为光和作用对 pH 值的变化极为敏感，一旦超过
其适宜的 pH值范围，藻的光和速率将大幅下降，从而使藻细胞生长速率降低。此外，pH 值的升高改变了水
中氨氮含量和无机碳的形态，王珺等［9］发现水体中氨氮含量的上升对轮业黑藻产生胁迫作用。可见 pH 值
是影响细胞生长的关键因素之一。本实验中最适初始 pH值为 7． 0 ～ 7． 5，比生长速率最大可达 0． 125 d －1。
而当 pH值低于 6． 0，高于 8． 0 时，藻细胞的生长速度降低，基本处于抑制状态。
3． 3 光照强度对突变藻株生长的影响
光是微藻生命活动的能量来源，在适当范围内，增加光照强度可使光合作用速度加快，细胞分裂速率达
到最高值时的光照强度称最适光强或饱和光强，超过饱和光强后光合作用减弱甚至受抑制［4，10］。最适光强
对藻体生长的影响不仅存在于异种之间，而且在同种异体之间也存在着个体差异。马若欣等［11］研究了小新
月菱形藻在 3 种光照条件下的生长情况，结果表明在实验设计的最高光照强度 260 μE /(m2·s)处，获得最
大生长率 0． 6505 d －1。石娟等［12］研究了小新月菱形藻在 4 种光照条件下的生长情况表明，最适光强 70 ～
140 μE /(m2·s) ，在 70 μE /(m2·s)时平均生长速率最大;在 260 μE /(m2·s)光强能导致细胞分裂速率变
慢，指数期缩短。而在本研究中，突变藻株的最适光强范围在 54 ～ 108 μE /(m2·s)之间，其光饱和点为
162 μE /(m2·s) ;当光照强度为 54 μE /(m2·s)时，藻细胞生长最旺盛，比生长速率达到最大 0． 1 d －1。
3． 4 NaNO3 含量对突变藻株生长的影响
N是组成蛋白质、核酸等许多活性物质的主要成分，N浓度的高低会直接影响细胞内多种代谢过程以致
影响到藻细胞的生长。目前，微藻培养基中 N 源的选择及浓度的使用，已有大量的文献报道。普遍认为 N
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第 1 期 张新建，等:新月菱形藻的紫外诱变及优化培养
浓度过低会抑制藻细胞的生长，过高也会对生长不利［11，13 － 14］，与本实验结果类似。
3． 5 NaCl含量对突变藻株生长的影响
海水中含有许多盐类物质，其中 70%为 NaCl，因此 NaCl的浓度很大程度上影响着盐度的变化。对海洋
藻类而言，细胞生长需要一定的渗透压，一定浓度的 NaCl可以维持细胞内渗透压的平衡。藻类对盐度的适
应范围有最高、最低、最适三个水平。在最适范围内生长、繁殖速度最快;过高和过低的盐度对藻类细胞都会
产生伤害作用［15］。在本试验所设置的 0 ～ 30 g /L的 NaCl中，最适浓度为 27 g /L，此时新月菱形藻 BC6 藻
体细胞生长最旺盛;在低盐度下(0 ～ 10 g /L) ，可能会降低某些酶或转运载体的活性使藻体细胞的生存能
力下降［16］，细胞生长受到抑制，甚至死亡。
作为一种新型能源型生物，新月菱形藻在天然海水中的密度很低，远不能满足社会对其资源开发及利用
的需要，实现新月菱形藻的高密度培养将会产生巨大的经济及社会效益。本研究中首先利用紫外诱变获得
一株长势较好的藻株 BC6，通过理化条件和营养条件对该藻株进行单因子优化，该突变藻株的最佳培养条
件:最适培养温度在 20 ℃，pH值为 7． 0 ～ 7． 5，最适光照强度为 54 μE /(m2·s) ，NaNO3 的最适添加量为
105 mg /L，NaCl最适添加量为 27 g /L。在优化培养条件下，与 f /2 培养基相比，各项指标都高于对照组。其
中培养密度，细胞干重约是 f /2 培养基的 2． 2 倍，细胞比生长率约是 f /2 培养基的 2． 13 倍。而且优化后的突
变藻株油脂含量达到了 57%，同野生藻株相比，提高了 7%。用优化培养方法培养新月菱形藻具有生长速度
快，生物产量高等优势，为下一步在光生物反应器中实现大规模高密度培养奠定了良好的基础。
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