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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2014年第10期
纳 豆 激 酶（nattokinase，NK） 是 Sumi 等［1］ 于
1987 年首先在日本传统发酵食品纳豆中发现并命
名。 该 酶 是 由 纳 豆 枯 草 杆 菌（Bacillus subtilis var.
natto）产生的一种碱性丝氨酸蛋白酶，具有非常高
的溶栓活性。1992 年，Nadamura 等［2］首次克隆了
纳豆激酶基因并测定了全基因序列，使得利用基因
收稿日期 ：2014-03-03
基金项目 ：内蒙古自治区“草原英才”工程资助项目（内组通字［2013］17 号）
作者简介 ：刘靓蕾，女，硕士，研究方向 ：植物分子生物学及基因工程 ；E-mail ：472304231@qq.com
通讯作者 ：哈斯阿古拉，男，博士，教授，研究方向 ：植物分子生物学及基因工程 ；E-mail ：hasind@sina.com
人工合成的纳豆激酶基因转化烟草的研究
刘靓蕾  张妍  孙晓蕾  韩岚  满达呼斯琴  哈斯阿古拉
（内蒙古大学生命科学学院 内蒙古自治区牧草与特色作物生物技术重点实验室，呼和浩特 010021）
摘 要 ： 根据植物偏爱密码子人工合成的纳豆激酶基因 sNK 和其中插入番茄果实特异表达基因 E8 第一内含子的纳豆激酶基
因 sNK-E8i，通过农杆菌侵染的方法转化到烟草 NC89 中。经 PCR 检测，得到 12 株转 sNK 基因烟草植株和 10 株转 sNK-E8i 基因烟
草植株，初步证明目的基因已整合到烟草基因组中；RT-PCR 检测有 9 株转 sNK 基因烟草植株和 10 株转 sNK-E8i 基因烟草植株为阳性；
通过 RT-qPCR 将两种基因在烟草中的表达量进行比较，结果表明转 sNK-E8i 基因的植株中纳豆激酶的表达量比转 sNK 基因的植株
中高 ；通过纤维蛋白平板法检测其活性，共有 5 株转 sNK 基因烟草植株和 3 株转 sNK-E8i 基因烟草植株检测到溶圈，说明目的基
因在部分转基因烟草中可正常转录和翻译并表现出溶栓活性。经加代培养已得到 T1 代转基因植株。
关键词 ： 纳豆激酶 人工合成 植物偏爱密码子 烟草 纤维蛋白平板法
Research of Transferred Synthetic Nattokinase Gene in
Tobacco Genome
Liu Jinglei Zhang Yan Sun Xiaolei Han Lan Kh.Mandakhtsetsen Hasi Agula
（Inner Mongolia Key Laboratory of Herbage ＆ Endemic Crop Biotechnology，College of Life Sciences，Inner Mongolia University，
Huhhot 010021）
Abstract: The nattokinase gene sNK which was artificially synthesized according to plant preferential codons, and the nattokinase gene
sNK-E8i which has been got by inserting the first intron of tomato specifically expressed gene E8 into sNK, were transformed into tobacco NC89
through Agrobacterium-mediated method. 12 strains of sNK transgenic tobacco plants and 10 strains of sNK-E8i transgenic tobacco plants were
acquired through PCR test. It preliminarily demonstrated that the target genes were integrated into tobacco genomes. It was found that 9 strains
of sNK transgenic tobacco plants and 10 strains of sNK-E8i transgenic tobacco plants were positive by using RT-PCR. The result showed that the
expression level of sNK-E8i transgenic tobacco plants was higher compared with that of sNK transgenic tobacco plants by RT-qPCR. Besides,
the enzyme activity was tested through agarose-fibrin plate analysis, and the dissolving circles of 5 strains of sNK transgenic tobacco plants and 3
strains of sNK-E8i transgenic tobacco plants were detected. The result showed that target genes could be transcribed and translated normally in a
part of transgenic tobacco and presented the activity of thrombolysis. The T1 transgenic straints were obtained by generation-adding cultivation.
Key words: Nattokinase Synthetic Plant preferential codon Tobacco Agarose-fibrin plate analysis
工程技术生产纳豆激酶成为可能。2004 年，张淑梅
等［3］使纳豆激酶基因在 E. coli DH5α 中实现了分泌
型表达，表达的目的蛋白占菌体总蛋白的 21.5%，
经分离纯化得到的纳豆激酶蛋白干粉活性高达 2 000
U/mg。2007 年，黄磊等［4］在蛋白缺陷型枯草芽孢
杆菌中表达了纳豆激酶原基因和只编码纳豆激酶成
2014年第10期 95刘靓蕾等：人工合成的纳豆激酶基因转化烟草的研究
熟肽的纳豆激酶基因，两者的表达产物均具有溶栓
活性。2010 年，蔡立涛等［5］实现纳豆激酶在巴斯
德毕赤酵母中的分泌表达，并以纯化产物为抗原制
备兔抗纳豆激酶血清，经检测表达产物具有较好的
溶栓活性和免疫原性。
由于当前的纳豆激酶表达系统多以微生物表达
系统为主，因此纳豆激酶的生产一般使用的是通过
液体发酵罐分离提取纳豆激酶菌株的方法。但是此
种生产方式在下游加工工艺方面，如工程菌的发酵、
表达产物的分离纯化等仍需较高成本。而植物生物
反应器同其相比，具有品质高、安全性好等优势，
且其成本仅为微生物培养的 2%-10%。因此，有部
分学者开始将方向转向了以植物生物反应器为载体
生产纳豆激酶的研究。2005 年，张锋等［6］构建获
得了纳豆激酶基因植物表达载体并将其整合到番茄
基因组中，但没有对转基因植株中纳豆激酶的活性
和含量进行测定。2009 年，张静等［7］将编码纳豆
激酶基因成熟肽序列转化到烟草及番茄中，得到的
转基因植株中纳豆激酶基因可正常表达并具有溶栓
活性。
但是，以植物生物反应器生产药用蛋白经常出
现外源基因表达量低的问题，因此针对这一问题，
本实验室根据植物偏爱密码子［8-10］人工设计合成纳
豆 激 酶 基 因（GenBank 登 录 号 ：KJ495732）， 并 在
其 ORF 第 519 和第 520 个碱基之间插入番茄果实
特异表达基因 E8 的第一内含子（GenBank 登录号 ：
X13437.1），分别构建了植物双元表达载体 pPZP221
（35s-sNK-nos） 和 pPZP221（35s-sNK-E8i-nos）， 通
过根癌农杆菌介导的转化方法，分别将人工合成的
纳豆激酶基因 sNK 和插入番茄果实特异表达基因 E8
第一内含子的纳豆激酶基因 sNK-E8i 转化到模式植
物烟草中，并对转基因植株中纳豆激酶基因表达及
酶活性进行测定，以期提高纳豆激酶在烟叶中的表
达水平。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 植物材料 烟草（Nicotiana tabacum L.）品种
NC89 原种，由中国农业科学院烟草研究所贾兴华研
究员提供。
1.1.2 菌种和质粒 pPZP221（35s-nos）质粒、农
杆菌 LBA4404 均为本实验室保存。以植物偏爱密码
子进行序列优化的纳豆激酶全长基因 sNK、在 sNK
中间插入番茄果实特异表达基因 E8 的第一内含子的
纳豆激酶基因 sNK-E8i 及其植物表达载体 pPZP221
（35s-sNK-nos）、pPZP221（35s-sNK-E8i-nos）由本实
验室构建。
1.1.3 培养基 萌发培养基 ：MS+0.7% 琼脂粉 ；芽
诱导（共）培养基（YN）：MS+0.1 mg/L IAA+1 mg/L
6-BA+0.7% 琼脂粉 ；选择培养基（YN++）：MS+0.2
mg/L IAA+2 mg/L 6-BA+40 mg/L 庆 大 霉 素（Gen）
+200 mg/L 头孢霉素（Cef）+0.7% 琼脂粉 ；生根培
养 基（GN++）：MS+0.5 mg/L IAA+40 mg/L Gen+100
mg/L Cef+0.7% 琼脂粉。
1.2 方法
1.2.1 无菌苗的培养 用 70% 的无水乙醇处理种子
1 min 后，放入 1% 的 NaClO 中浸泡 10 min，用无菌
水冲洗 5-6 次后接种于萌发培养基上。
1.2.2 转 化 菌 的 活 化 及 扩 培 将 含 有 pPZP221
（35s-sNK-nos）和 pPZP221（35s-sNK-E8i-nos）的农
杆菌 LBA4404 分别接种于含 100 mg/L 利福平（Rif）
+100 mg/L 壮 观 霉 素（Spec） 的 YEB 固 体 培 养 基
上，28℃划线培养 48 h ；挑取单菌落于含有相同抗
生素的 YEB 液体培养基中，28℃ 180 r/min 振荡培
养 24 h ；至 OD600=0.3-0.4 时，取 2 mL 活化菌接种
到 50 mL 相同抗生素的 YEB 液体培养基中，28℃
180 r/min 培 养 5-8 h ；取 出 菌 液，5 000 r/min 离 心
10 min，弃去 YEB 上清液 ；用 10 mL 0.01 mol/L 的
MgSO4 悬浮菌体，5 000 r/min 离心 10 min，弃上清，
收集菌体 ；用不含蔗糖的 MS 液体培养基稀释至
OD600=0.3-0.4，即可用于转化。
1.2.3 农杆菌侵染烟草叶盘外植体 取无菌苗幼叶，
切成 0.5 cm2 的外植体，叶背朝上，放置于 YN 培养
基上 ；2 d 后将其放入制备好的菌液中侵染 20 min ；
将侵染后的外植体接种在 YN 培养基上，25℃共培
养 2 d ；无菌水冲洗 2 次后放入含 Cef 250 mg/L 的
无菌水中浸泡 10 min，将外植体于无菌滤纸上吸干
水分，接种于 YN++ 培养基上，叶背向上，25℃黑
暗条件下培养 10 d 后，16 h/8 h 明暗交替光照培养，
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第10期96
待芽长到 2 cm 时转入 GN++ 培养基。
1.2.4 转基因烟草植株鉴定 采用 SDS 法提取烟草
植 株 总 DNA， 设 计 sNK 基 因 特 异 性 引 物 sNK-F/R
（表 1）进行 PCR 特异性扩增。PCR 反应体系为 25
μL，包含模板 100 ng，引物 sNK-F/R（5 μmol/L）各
2 μL，4×dNTP（2.5 mmol/L）2 μL，10×PCR 反 应
缓冲液 2.5 μL，rTaq 酶（5 U/μL）0.125 μL，灭菌水
补 足 25 μL。 反 应 条 件 为 ：95℃ 5 min ；95℃ 30 s，
60℃ 30 s，72℃ 30 s，40 个循环 ；72℃保温 5 min。
反应完毕后取 10 μL PCR 产物在 1.2% 琼脂糖凝胶上
电泳检测。
表 1 引物序列
引物名称 序列（5-3） 作用
sNK-F TCCGCCTCTCTGTATGCTGT PCR 鉴定引物 /
RT-PCR 引物sNK-R CTCTAACTTGTGCGTTGGTCC
sNKQ-F CACATTACCAGGAGGGACTTACG RT-qPCR 引物
sNKQ-R GCAGTGCTTTCCAACCTATCTCT
Actin-F GATTTGCTGGTGATGATGCTCC 内参基因 RT-qPCR
引物Actin-R TTCTCCATATCGTCCCAGTTGC
1.2.5 转基因烟草植株纳豆激酶基因表达量检测
用 TaKaRa RNA 提取试剂盒提取 PCR 阳性烟草植
株 总 RNA。 用 TaKaRa 反 转 录 试 剂 盒 反 转 录 合 成
cDNA ：以 500 ng 总 RNA 为 模 板， 加 入 2 μL 试 剂
盒中所带有的 5×PrimeScript RT Master Mix，再加
RNase Free dH2O 至 10 μL；混匀后，进行反转录反应。
反应条件为 ：37℃ 15 min，85℃ 5 s，4℃ 10 min。
以 cDNA 为模板，进行 RT-PCR，引物、预期
产物长度、反应体系及反应条件与鉴定转基因植株
PCR 检测相同。
1.2.6 sNK 与 sNK-E8i 基 因 在 烟 草 中 表 达 量 的 比
较 以 cDNA 为模板，随机选取 RT-PCR 呈阳性的
转 sNK 烟草植株和转 sNK-E8i 烟草植株各 3 株，以
Actin 基因作为定量的内参基因，以 sNKQ-F/R 为目
的基因引物，用 TaKaRa 公司 SYBR Premix Ex TaqII
染料法荧光定量试剂盒进行实时荧光定量 PCR（RT-
qPCR），每个处理均重复 3 次，H2O 为空白对照。反
应体系为 25 μL，包含 12.5 μL 2× SYBR® Premix Ex
Taq II（Tli RNaseH Plus）溶液、正向和反向引物各
加入 1 μL（5 μmol/L）、1 μL cDNA（50 ng/μL）和 9.5
μL 灭菌双蒸水。反应条件为 ：95℃ 30 s ；95℃ 5 s，
60℃ 30 s，40 个循环 ；4℃ 10 min。
1.2.7 转基因烟草植株纳豆激酶酶活检测 根据
Astrup 等［11］报道的方法，以纤维蛋白原、凝血酶为
原料，经过改良，用巴比妥那-盐酸缓冲液制作纤维
蛋白平板。以尿激酶为标准品，制作标准曲线，将
尿激酶用生理盐水稀释为 1、2、3、4、5、6、7 和
8 U/mL，每个浓度取 10 μL 点在已制备好的琼脂糖-
纤维蛋白平板上，每个浓度做 3 个重复，加平皿盖
正置于 37℃，保温 20 h。测量溶圈直径，计算溶圈
面积，重复测量 3 次，求得平均值。以测定的溶圈
面积对标准品不同酶活力作标准曲线，得回归方程
和相关系数。取 PCR 及 RT-PCR 检测均为阳性的烟
草植株，用 PBS 法［12］粗提烟草叶片总蛋白 ；取烟
草蛋白粗提液 10 μL 点在纤维蛋白平板上后，置于
37℃培养箱，20 h 后，根据溶圈的面积同标准曲线
相比测定酶活力。
1.2.8 转基因烟草植株的加代培养 由于本试验所
用的表达载体为 pPZP221，其上带有 Gen 植物抗性
基因标记，可对 Gen 产生抗性，因此我们选取 Gen
对转纳豆激酶基因烟草 NC89 T0 代种子进行抗生素
筛选。首先对筛选培养基中抗生素的浓度进行确定，
将野生型烟草 NC89 种子分别接种在 Gen 浓度为
100、200、300 和 400 mg/L 的筛选培养基上光照培养，
每个梯度处理接种 30 个种子，3 组重复，20 d 后观
察出芽率及正常植株所占比例，选取最适浓度范围，
然后用相同的方式缩小梯度范围，最终确定筛选培
养基中抗生素的最适浓度。随后，将转纳豆激酶基
因烟草 NC89 T0 代种子接种于筛选培养基上，30 d
后长出的苗子转到 MS 基本培养基上，待烟叶量足
够时，提取烟草总 DNA，以 sNK-F/R 引物对其进行
PCR 检测，得到的阳性苗进行扦插扩繁移栽组培室。
2 结果
2.1 转基因烟草植株的获得
用 含 质 粒 pPZP221（35s-sNK-nos），pPZP221
（35s-sNK-E8i-nos）的根癌农杆菌 LBA4404 分别侵染
烟草品种 NC89 的幼叶切片，侵染后的烟草叶片经
共培养、脱菌处理后，置于选择培养基上，约 20 d 后，
外植体周围出现愈伤组织并有绿色芽点形成。45 d
2014年第10期 97刘靓蕾等：人工合成的纳豆激酶基因转化烟草的研究
左右时，待芽长到 2 cm 时，切下幼芽转入生根培养
基，其后约 1 个月左右生根成苗（图 1）。以含目的
基因的质粒 pUC57-sNK 为阳性对照，野生型植株叶
片总 DNA 为阴性对照，H2O 为空白对照，以 sNK 基
因特异性引物进行 PCR 检测，结果显示，有 12 株
转 sNK 基因烟草植株和 10 株转 sNK-E8i 基因烟草植
株总 DNA 扩增产物与阳性质粒一致，两者 PCR 产
物相同，均为 484 bp 的特异性条带（图 2），初步证
明目的基因已整合到烟草基因组中。得到的阳性植
株，进行扦插扩繁，移栽至花盆中，组培室室内培养。
和 10 株转 sNK-E8i 基因烟草植株（T010-T019）扩增
产物与阳性质粒一致，表明其在转录水平上有纳豆
激酶基因的表达。
A B
C D
2000
bp
484
bp
M + - 0 1 2 3 4 5 6
1000
750
500
250
100
A ：共培养 ；B ：选择培养 ；C ：生根培养 ；D ：转基因植株
图 1 组织培养各阶段
M ：DNA Marker DL2000 ；+ ：阳性对照 pUC57-sNK ；- ：野生型 NC89 ；
0 ：H2O ；1-6 ：部分阳性植株
图 2 转 sNK 基因、sNK-E8i 基因烟草植株的 PCR 检测
2.2 RT-PCR检测
取 PCR 检测呈阳性的烟草植株叶片，提取叶片
总 RNA，反转录为 cDNA 后，进行 RT-PCR。结果（图
3） 显 示， 有 9 株 转 sNK 基 因 烟 草 植 株（T01-T09）
M
2000
bp
bp
1000750
500
250
100
+ 0 T010 T011T012 T013T014 T015 T016T017 T018 T019
484
bp
-
M
2000
1000
750
500
250
100
+ 0 T01 T02 T03
✏㥹ਦ⡷ᙫ51$
T04 T05 T06 T07 T08 T09
484
bp
-
M ：DNA Marker DL2000 ；+ ：pUC57-sNK ；- ：野生型 NC89 ；0 ：H2O ；
T01-T09 ：转 sNK 基因阳性植株 ；T010-T019 ：转 sNK-E8i 基因阳性植株
图 3 转 sNK 基因、sNK-E8i 基因烟草植株的 RT-PCR 检测
2.3 RT-qPCR
随机选取 RT-PCR 呈阳性的转 sNK 基因烟草植
株（T01、T04 和 T09） 和 转 sNK-E8i 基 因 烟 草 植 株
（T010、T013 和 T015）各 3 株，进行 RT-qPCR，对比
其表达量。图 4 显示，转 sNK-E8i 基因的植株中纳
豆激酶的表达量比转 sNK 基因的植株中高。进行统
计学分析表明 P<0.05，两者之间存在显著性差异。
3.5
3.0
2.0
1.0
a
2.5
1.5
0.5
0
T01 T04 T09 T010 T013 T015
⴨ሩ㺘䗮≤ᒣ a a b b b
不同小写字母表示存在显著性差异（P<0.05）
图 4 sNK 基因与 sNK-E8i 基因在烟草中相对表达量
2.4 转基因烟草植株纳豆激酶酶活检测
根据尿激酶标准品纤溶性（图 5）制作标准曲
线，结果（图 6）显示，R2=0.983 8，说明尿激酶酶
活力与溶圈面积具有较高的线性相关性。取 RT-PCR
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第10期98
呈阳性的 30 d 龄烟草植株叶片 0.1 g，用 200 μL PBS
缓冲液提取叶片总蛋白，用纤维蛋白平板法检测酶
活性。结果（图 7）显示，有 5 株转 sNK 基因烟草
植 株（T01、T02、T05、T07 和 T09） 和 3 株 转 sNK-
E8i 基因烟草植株（T011、T012 和 T013）检测到溶圈，
分别占所检测植株的 56% 和 30%。根据溶圈的面积
同标准曲线相比测定酶活力，结果如表 2 所示。
明显降低，且正常苗比例极低。因此，选取 0-100
mg/L Gen 浓度范围内，以 10 mg/L 为一个梯度，再
次以同样的方式进行筛选，最终确定筛选培养基中
Gen 浓度为 50 mg/L（表 4）。
2.5.2 T1 代转 sNK、sNK-E8i 基因烟草植株的获得
取 T01、T02、T05、T07、T09、T011、T012 和 T013 植
株的种子各 50 粒，经无菌处理后，分别接种于 Gen
筛选培养基上，对得到的抗性植株进行 PCR 检测，
获得了 T1 代转基因烟草植株。
3 讨论
自 1986 年，Barta 等［13］首次利用植物表达系
统成功生产人生长激素后，由于利用转基因植物生
产药用蛋白具有经济、安全、副作用小、有些植物
材料可直接食用等优点，日益成为国际上植物基因
工程的一个新的发展趋势。而利用植物生物反应器
生产药用蛋白往往会面临外源基因表达量低的问题。
影响外源蛋白在植物中表达的因素有很多，如表达
系统的选择、启动子的选择、mRNA 的稳定性、转
录和表达的效率等。因此，我们选择从密码子改造
和插入内含子两方面对纳豆激酶基因进行优化。植
8
7
6
5
4
3
2
1
0
0 10 20 30 40ⓦ㧼സ䶒〟mm2ቯ◰䞦⍫U/mL 50 60 70 80y=0.0939x+0.2454R2=0.9838 90 100
9
图 6 尿激酶酶活标准曲线
图 5 尿激酶标准品纤溶活性
1 2 3
4
7
10 + -
8 9
5 6
1-10 ：检测样品 ；+ ：尿激酶标准品 ；- ：野生型 NC89
图 7 转基因植株纤溶活性测定
表 2 纤维蛋白平板法测得酶活
株系编号 溶菌圈面积（mm2） 酶活力（U/mL） 比酶活（U/g）
T01 28.35 2.91 5.8
T02 37.59 3.78 7.6
T02 - - -
T03 - - -
T04 - - -
T05 29.31 3.00 6.0
T06 - - -
T07 39.57 3.96 7.9
T08 - - -
T09 47.64 4.72 9.4
T010 - - -
T011 48.37 4.79 9.6
T012 59.69 5.85 11.7
T013 39.35 3.94 7.9
T014 - - -
T015 - - -
T016 - - -
T017 - - -
T018 - - -
T019 - - -
2.5 转纳豆激酶烟草植株的加代培养
2.5.1 烟草 NC89 Gen 本底抗性水平测定试验 表 3
显示，当培养基 Gen 浓度高于 100 mg/L 时，出芽率
2014年第10期 99刘靓蕾等：人工合成的纳豆激酶基因转化烟草的研究
物中遗传密码子的使用频率与动物、微生物不同，
适当地将外源基因的密码子替换成为植物偏爱的密
码子，能显著提高该基因在植物中的表达水平。而
根据文献报道，内含子在增加 mRNA 的稳定性和增
加基因表达量方面起到正调节作用［14-16］。
本研究将人工合成的纳豆激酶基因 sNK 和 sNK-
E8i 转化到模式植物烟草中，共得到了 22 株含有目
的基因的 T0 代转基因烟草植株。RT-PCR 结果显示，
构建的两个基因均在 mRNA 水平上有表达，表明我
们所合成的基因可在植物中正常转录。并且由 RT-
qPCR 结果可知，转 sNK-E8i 基因的植株中纳豆激酶
的表达量比转 sNK 基因的植株中高。由于本研究构
建的两个植物表达载体除 E8 内含子外没有任何差
异，农杆菌侵染的受体材料完全相同，纳豆激酶表
达量的提高应该是由于 E8 内含子介导的增强效应的
结果，说明内含子在克服植物生物反应器中外源基
因表达量低［17-20］的问题中可以起到增强子的作用。
另外，纤维蛋白平板法测定酶活试验结果证明，本
研究已获得有纳豆激酶活性的转 sNK 基因和转 sNK-
E8i 基因 T0 代烟草转基因植株，证明以烟草为生物
反应器生产纳豆激酶是可行的。为下一步得到稳定
遗传的纯合植株，我们通过 Gen 筛选和 PCR 鉴定，
进行了加代得到了 T1 代转基因烟草植株。
4 结论
根据植物偏爱密码子人工合成的纳豆激酶基因
和其中插入番茄果实特异表达基因 E8 第一内含子
的纳豆激酶基因在转基因烟草中可表现出较高活性，
经加代培养已得到 T1 代转化基因植株。
参 考 文 献
［1］Sumi H, Hamada H, Tsushima H, et al. A novel fibrinolytic enzyme
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［2］Nakamura T, Yamagata Y, Ichishima E. Nucleotide sequence of
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表 3 不同质量浓度 Gen 对烟草植株生长的影响
Gen 浓度（mg/L） 出芽率（%） 正常叶色叶片比例（%）
0 92 100
100 48 27
200 45 10
300 32 3
400 20 2
表 4 低质量浓度 Gen 对烟草植株生长的影响
Gen 浓度（mg/L） 出芽率（%） 正常叶色叶片比例（%）
0 98 100
10 77 80
20 75 83
30 66 78
40 67 60
50 51 52
60 57 33
70 55 34
80 46 26
90 44 31
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第10期100
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（责任编辑 马鑫）