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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2012年第4期
收稿日期 : 2011-11-09
基金项目 : 国家自然科学基金项目（30901969）
作者简介 : 臧亚超 , 女 , 硕士研究生 , 研究方向 : 特种植物科学与技术 ; E-mail: zangyachao111@126.com
通讯作者 : 杨太新 , 教授 , 研究方向 : 药用植物规范化栽培 ; E-mail: yangtaixin@126.com
李先恩 , 研究员 , 研究方向 : 药用植物种质资源与栽培技术 ; E-mail: xeli@implad.ac.cn
地黄扩展蛋白基因 RgExpA1的克隆与表达分析
臧亚超1,2 孙鹏2 杨太新1 李先恩2
（1 河北农业大学农学院，保定 071000 ；2 中国医学科学院 北京协和医学院 药用植物研究所，北京 100193）
摘 要： 采用 RT-PCR方法对 9个地黄扩展蛋白基因在地黄不同组织器官、不同发育时期的表达特点进行了分析，在此基
础上用 RACE方法克隆了主要在根中表达的 RgExpA1基因的全长，并对该基因编码氨基酸的功能位点、拼接方式以及与同源基因
的进化关系作了初步分析。
关键词： 扩展蛋白 地黄（Rehmannia glutinousa） 基因克隆 表达分析
Cloning and Expression Analysis RgExpA1 in Rehmannia glutinosa
Zang Yachao1, 2 Sun Peng2 Yang Taixin1 Li Xianen2
（1College of Agronomy Agricultural University of Hebei, Baoding 071000；2Chinese Academy of Medical Sciences, Peking Union Medical
College, Institute of Medicinal Plant, Beijing 100193）
Abstract: The expression of nine expansin genes in different organs of Rehmannia glutinosa and different developmental stages of
Rehmannia root was analyzed by RT-PCR. The RT-PCR result showed that the expression of RgExpA1 was root-specific and RgExpA1 expressed
strongly in developing tuberous root. It implied that RgExpA1 was involved in tuberous root development. Based on the cDNA fragment sequence,
the full length cDNA of RgExpA1 was cloned using RACE （rapid amplification of cDNA ends） technology. We also studied the splicing sites of
RgExpA1 and the active sites of its product. The homologous relationship of RgExpA1 with other α-expansins and its putative function were also
analyzed in this research.
Key words: Expansin Rehmannia glutinosa Gene cloning Expression analysis
扩展蛋白（expansin）是一类细胞壁蛋白，它
能快速缓冲植物细胞壁结构网的张力并使其松
驰［1］。在酸性条件下，它能够诱导热失活的离体细
胞壁恢复伸展活性。扩展蛋白为多基因家族，包括
α-expansin（EXPA），β-expansin（EXPB），expansin-
like A （EXPLA） 和 expansin-like B （EXPLB）4 个亚
家族。目前已经从众多植物中发现了扩展蛋白，其
中以 α-expansin 成员最多，功能也最为广泛。α 扩
展蛋白除了具有扩展伸长细胞的功能外，在种子萌
发［2］，果实成熟［3］，花的发育［4］，以及根毛形成［5］
等多种植物器官生长发育事件中起到重要作用。因
此，对扩展蛋白基因及其编码产物的功能的深入研
究，有助于进一步阐明植物组织器官发生、发育的
机理。
研究表明扩展蛋白基因的表达具有器官、组
织，甚至细胞特异性。例如，Im 等［6］分离得到
的 ZelExp1 基因主要在木质部维管束附近细胞表
达 ；而山杨的 PttExp1 基因［7］则主要在茎的形成
层和木质部形成区域特异表达。目前国外学者对多
种植物的扩展蛋白基因的功能进行了研究，如草
莓［8］、棉花［9］和大豆［10］等 ；国内也陆续报道了柿
子树［11］，平邑甜茶［12］和萝卜［13］等植物扩展蛋白
基因的克隆和研究报告，但地黄扩展蛋白基因的克
隆还未见报道。本研究从地黄块根 EST 文库中筛选
到 9 个扩展蛋白基因，通过 RT-PCR 检测到在地黄
块根内高度表达的基因 RgExpA1 和 RgExpA7，并将
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第4期70
RgExpA1 分离克隆。本研究对于明确 RgExpA1 的功
能和地黄块根膨大机理以及植物品种改良具有重要
意义。
1 材料与方法
1.1 材料
地黄材料为中国医学科学院药用植物研究所实
验基地栽培的地黄品种 85-5。
宿主菌大肠杆菌（E.coli）DH5α 由本实验室保存，
载 体 pMD-T19、LATaq、 反 转 录 酶 PrimeScript RT
reagent Kit 购自宝生物公司，SMART RACE KIT 购
自 Clontech 公司，RNA 提取试剂盒 Plant Total RNA
Rapid Extraction Kit 购自 BioTeke 公司。
1.2 方法
1.2.1 总 RNA 提取与反转录 取地黄的茎（ST）、
叶（LE）、花（FL）、不定根（AR）、出苗后 45 d（45dR）
和 80 d（80dR）的根以及成熟期的根（WR）7 个部分，
用 Plant Total RNA Rapid Extraction Kit 提取各部分的
总 RNA，用 PrimeScript RT Reagent Kit 进行反转录。
1.2.2 地黄扩展蛋白基因的 RT-PCR 分析 从本课
题组地黄转录组测序文库中检测到 9 个 α 扩展蛋白
基因（表 1），已提交至 GenBank 数据库。将这 9 个
基因分别设计引物（表 2）。分别以地黄 7 个组织器
官的 cDNA 为模版，以 GAPDH 为内参基因，用 RT-
PCR 对 9 个扩展蛋白基因在地黄不同组织器官和根
的不同发育阶段的表达情况进行分析。
表 1 本研究的 9个扩展蛋白基因
基因 同源基因 GenBank 登录号 E值 物种
RgExpA1 EXP1 AY390358 6e-67 Actinidia deliciosa
RgExpA2 Exp3 AF291659 9e-47 Striga asiatica
RgExpA3 TvEXP2 AF230277 1e-96 Triphysaria versicolor
RgExpA4 TvEXP2 AF230277 4e-145 Triphysaria versicolor
RgExpA5 PtrEXLA2 XM_002313646 9e-43 Populus trichocarpa
RgExpA6 α-expansin 13 EU960208 1e-10 Zea mays
RgExpA7 PtrEXPA6 XM_002306001 3e-74 Populus trichocarpa
RgExpA8 PtrEXPA20 XM_002329061 1e-108 Populus trichocarpa
RgExpA9 EXPA3 AF059487 2e-109 Solanumly copersicum
表 2 地黄扩展蛋白基因引物和 RT-PCR的扩增条件
基因 引物序列 退火温度（℃） 循环次数
RgExpA1 S:AACAGCCATTAAAGATGTCTGGAAACGA:CCCCATTGTGCCCGAAGC 53 35
RgExpA2 S:TGGTGCTTGTGGGTACGGAAATA:GCATGGCGAGATCGAAATGTG 56 31
RgExpA3 S:GCAATCCAACGCCGTCCTAA:CAGCCGCTTCAGCATCCA 58 29
RgExpA4 S:AGTAACTCTGTTTCTTGCTTCCTCTGA:CACTCACTAATACTGTTGTCCCTTCTT 54 31
RgExpA5 S:GCGACATACGACGCCACCA:CTCAATCGGGAGAACGAAATAC 55 31
RgExpA6 S:GTGGGGCTTGTGGGTATGA:AAATGGTGGTTGGGTGGAT 56 31
RgExpA7 S:AAAATGGCTTTACTAGCTGTTATCGA:TGTCGTTCGGCAGAGCATAG 58 29
RgExpA8 S:CAACTTCTGCCCGTCCAACAA:TATCACCACCTCCGCCCAC 53 35
RgExpA9 S:ACTCGCATTTCGTTCTCCCA:AACTCCATCGCTGCTCGTA 55 31
GAPDH S:GCTGCCGCACATCTGAAGGA:TGCTGCTGGGGATAATGTTGAA 56 31
2012年第4期 71臧亚超等 ：地黄扩展蛋白基因 RgExpA1 的克隆与表达分析
1.2.3 RgExpA1 基因的全长克隆 用 RACE 扩增方
法克隆 RgExpA1 基因的全长，操作步骤参照试剂
盒说明书进行。RgExpA1 5RACE 基因特异引物为
（5 -CATCCATCCCGTCCTAGACCCTTTG -3 ）；
RgExpA1 3RACE 基因特异引物为（5-GACCGTC-
GCACCTCCACCTCAT-3）。扩增程序为：95℃ 3 min；
94℃ 20 s， 68℃ 30 s（每个循环下降0.5）， 72℃ 1 min，
16 个循环 ；94℃ 20 s， 60℃ 30 s， 72℃ 1 min， 24 个
循环。根据 5RACE 和 3RACE 的结果，设计 Rg-
ExpA1 基因特异引物（RgExp5: 5-ATCCCACACCTT-
TCACACACCTCT-3；RgExp3: 5-AAATAAGCTGCG-
GGC TACAA TG-3），扩增 expansin 基因全长。扩
增程序为 ：95℃ 3 min ；94℃ 20 s，60℃ 30 s，72℃
1.5 min，35 个循环。1.2％琼脂糖凝胶电泳检测 PCR
产物并回收。
将 RgExpA1 连 接 到 pMD19-T Vector DNA， 取
5-10 μL 转化至 DH5α 感受态细胞（100 μL）中，在
含有 X-gal、IPTG、Amp 的 LB- 琼脂平板培养基上培
养。挑白斑经 PCR 检验后送上海生工测序。
1.2.4 RgExpA1 基因的序列分析和同源进化分析
根据 expansin 基因家族命名法，将得到的 cDNA 全
长命名为 RgExpA1。用 exPASy 网站提供的序列翻译
工具对 RgExpA1 基因的开放阅读框进行推测，获得
RgExpA1 基因编码蛋白序列。通过 DNAMAN 软件
对 RgExpA1 蛋白质序列进行比对分析，并根据比对
结果构建同源进化树。
1.2.5 RgExpA1基因组序列分析 采用CTAB法提取
地黄基因组 DNA。根据 RACE 试验的结果，设计 Rg-
ExpA1 基因组 DNA 扩展引物（RgExp5: 5-ATCCCA-
CACCTTTCACACACCTCT-3；RgExp3:5-AAATAAG-
CTGCGGGCTACAATG-3），扩增对应的基因组 DNA
序列。根据 RgExpA1cDNA 序列与基因组序列分析
的情况，用 lalnview 软件分析地黄 RgExpA1 基因的
内含子与外显子结构。
2 结果
2.1 扩展蛋白基因在地黄中的表达特点
从 RT-PCR 结果（图 1）来看，9 个扩展蛋白基
因在地黄中的表达情况各异。其中以 RgExpA9 表达
量最低，在各器官中表达都较弱。RgExpA5 在各部
位的表达量几乎一致 ；RgExpA2 和 6、8 在地黄各器
官和时期都有表达，但表达差异不明显 ；RgExpA1
和 3、7 基因在地黄不同器官、时期的表达差异明
显，但只有 RgExpA1 和 RgExpA7 在块根中的表达量
明显高于其他部位。RgExpA1 在出苗后 45 d 和 80 d
的块根中表达最高，除花器官外，在其他时期、部
位的表达量极低。45 d 和 80 d 的块根正处于迅速膨
大的时期，细胞生长旺盛，因此推测 RgExpA1 与块
根的膨大密切相关。综合分析 9 个基因表达结果，
RgExpA1 最有可能是与地黄块根形成有关的基因，
为了研究该基因的功能，同时了解地黄块根的膨大
机理，作者克隆了该基因全长。
ST. 茎 ；LE. 叶 ；FL. 花 ；AR. 不定根 ；45dR 和 80dR. 出苗后 45 d 和
80 d 的块根 ；WR. 成熟期块根
图 1 扩展蛋白基因在地黄不同部位的差异表达
2.2 RgExpA1基因和编码氨基酸的序列分析
将 5与 3端扩增序列拼接后得到了 RgExpA1
基因的全长序列（图 2）。根据 Cosgrove 推荐的扩展
蛋白基因命名方法，作者将该基因命名为 RgExpA1。
该基因全长 1 262 个核苷酸，编码 259 个氨基酸（图
2）。RgExpA1 编码的氨基酸序列与其他物种扩展蛋
白氨基酸序列同源性很高，均具有典型的保守结构
域，即 N 端有富含 8 个半胱氨酸的保守结构域，C
端有富含 5 个色氨酸的保守结构域和 1 个组氨酸
（His-Phe-Asp）功能域。
2.3 RgExpA1基因剪切位点分析
通过将 RgExpA1 与基因组 DNA 序列比对，发
现编码区基因组 DNA 序列含 3 个外显子和 2 个内含
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第4期72
子，其中内含子 1 只有 82 个核苷酸，内含子 2 区域
跨度较大，长达 2 kb，如图 3 所示。
2.4 同源进化分析
对分析并构建了同源进化树。结果（图 4）显示，
RgExpA1 与其他 7 个基因的同源性都比较高，其中
与 ZelExpA1 的亲缘关系最近，同源性达到 91% ；而
与 PhExp1 的同源性最低，为 76% ；与其他 5 个扩
展蛋白基因的同源性均不小于 83%，进一步证实了
RgExpA1 与扩展蛋白 Clad IV 亚群的关系，并且可能
有相近的功能。
3 讨论
本研究通过 RT-PCR 技术鉴定到主要在地黄根
内表达的地黄扩展蛋白基因 RgExpA1 和 7，并首次
克隆到地黄扩展蛋白基因 RgExpA1，为进一步研究
其功能奠定了基础。序列分析发现 RgExpA1 推测的
氨基酸序列包括扩展蛋白典型保守的结构 ：N 端富
含 8 个半胱氨酸、C 端富含 5 个色氨酸和中间 1 个
组氨酸功能域。系统进化分析发现 RgExpA1 归属于
双下划线的为 8 个保守的半胱氨酸残基；单下划线的为 C 端有 5 个保守的色氨酸残基；
方框的为组氨酸（His-Phe-Asp, HFD）功能域
图 2 地黄 RgExpA1基因序列及对应的氨基酸序列
图 3 地黄 RgExpA1基因序列剪接情况
根据 Sampedro 等［14］分类方法，氨基酸序列
比对分析发现 RgExpA1 在系统发育上被归为 EXPA
家族成员下的第 4 个分类群 Clad IV。通过研究文
献选取该亚群内有代表性的氨基酸序列进一步比
2012年第4期 73臧亚超等 ：地黄扩展蛋白基因 RgExpA1 的克隆与表达分析
EXPA 家族的 ；该基因与 EXPA 家族 Clad IV 代表性
基因的序列同源性都不小于 76%，证实了 RgExpA1
与 α 扩展蛋白 Clad IV 亚群的关系。
扩展蛋白作为细胞壁松弛蛋白对细胞伸长生长
起着重要作用，目前文献表明扩展蛋白参与植物发
育过程的许多事件，而且表现出组织、细胞等时空表
达特异性。半定量 RT-PCR 方法表明 RgExpA1 和
RgExpA7 主要在地黄块根内表达，这说明 RgExpA1
和 RgExpA7 基因在地黄块根发育过程中起着某种特
定作用，因此克隆了 RgExpA1 的全长序列做了进
一步分析。系统进化分析发现 RgExpA1 与百日草
ZelExp1 和山杨扩展蛋白 PttExp1 氨基酸序列具有较
高的同源性，而两者都报道和木质部形成发育有关。
例如，Madoka ［7］ 经 Northern 杂交和原位 PCR 分析
发现 PttExp1 主要在山杨次生生长的韧皮部细胞和
靠近韧皮部正在分化形成的木质部细胞表达。鉴于
RgExpA1 与 PttExp1 和 ZelExp1 较高的同源性，作者
推测 RgExpA1 有可能在地黄块根的发育过程中参与
了木质部的形成发育，但 RgExpA1 在块根发育中的
具体功能有待进一步研究。
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（责任编辑 狄艳红）
图 4 RgExpA1与其他代表性物种的氨基酸同源进化树