全 文 ：第 8? 卷 第 ? 期
4 A 2 5 年 ? 月
林 业 科 学
7;QRS6QL 7Q!ILR 7QSQ;LR
I.(T8?"S.T?
7-H3" 4 A 2 5
D."!2A322=A=UV32AA2F=8>>34A25A?A?
收稿日期! 4A24 W24 W48# 修回日期!4A25 WA8 W28’
基金项目!国家林业局林业公益性行业科研专项$4A2AA8A4A% ’
#陈晓阳为通讯作者’
团花树 (扩展蛋白基因的克隆及表达分析#
欧阳昆唏\李俊成\黄\浩\刘明骞\陈晓阳
$广东省森林植物种质创新与利用重点实验室\华南农业大学林学院\广州 92A:84%
摘\要!\采用扩增保守区域&基因组步移及 5(XL;R技术"在团花树中克隆到 29 个 (F-cH%&+"& 基因的 ,aSL序
列"命名为&,>X8&b R\a $‘-&N%&b 注册号 [Z?44:>: W[Z?44=AA %"其相对应的基因组序列 ‘-&N%&b 注册号为
[Z?44=A2 W[Z?44=29’ 包括已知的 L,Rj1L2"这 2: 个 Rj1L蛋白的大小及序列高度保守"包括 S端的信号肽&5 个
外显子和 4 个内含子’ 通过氨基酸序列比对和系统进化树分析"L,Rj1L2 W2:分为 8 个亚族"分别为 L&N&;和 a
亚族’ 定量 1;X分析显示 &,>X8&\ R\a 基因在同一组织中的表达存在冗余现象"而单个基因在不同的组织中又
存在特异表达"尤其 &,>X8&e 在形成层中的表达水平极高’ 这表明 &,>X8&e 在木质部发生的过程中可能起到重
要的作用’ 研究结果为在团花树中研究 (F-cH%&+"& 基因与木质部的生长和材质的关系提供信息"并最终为林木分
子育种提供潜在的候选基因’
关键词!\团花树# (扩展蛋白# 基因克隆# 定量 1;X
中图分类号!7=2>T8:\\\文献标识码!L\\\文章编号!2AA2 W=8>>"4A25#A? WAA:4 W2A
2")/,+)&*-)"#(#= PJ%*/00("#@#&):0(0"1’RPJ%�(#W/#/0(#
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=)$!’!)<3)6!-"67" ?)A"/ =/+1# &’6+,A$"A6#$41+5!6-+"7\GA#1’H/)A 92A:84%
@50’*&,’!\Z"/)--& ,aSL+" D-+"C&%)-D %+&,>X8&b ).&,>X8&\a $‘-&N%&b %,,-++".& S.3[Z?44:>: W[Z?44=AA% J")0
)0-,.**-+H.&D"&CC-&.B",aSL+-P#-&,-+$‘-&N%&b %,,-++".& S.3[Z?44=A2 W[Z?44=29%" J-*-"+.(%)-D EG%BH("/G"&C
,.&+-*K-D D.B%"& E"&D"&CJ")0 C-&.B",J%(b"&C%&D 5(XL;R)-,0&"P#-+/*.B/.#*D"/-*-&)"%()"++#-+"& &1"/),!K/#$A-
,/+1!1-+-%60-+"r-%&D +-P#-&,-./)0-+-(F-cH%&+"& 0.B.(.C#-+"&,(#D"&Cb&.J& L,Rj1L2 J-*-0"C0(G,.&+-*K-D" %&D
0%D )0-+%B-+-P#-&,-+)*#,)#*-+%+%& SF)-*B"&%(+"C&%(H-H)"D-" )0*---c.&+%&D )J."&)*.&+360-"*%B"&.%,"D
%("C&B-&)%&D H0G(.C-&-)",%&%(G+"++0.J-D )0%)&%,/+1!1-+-(F-cH%&+"& C-&-+J-*-D"K"D-D "&)./.#*+#EC*.#H+! L" N" ;
%&D a3L*-%(F)"B-P#%&)")%)"K-1;X%&%(G+"++0.J-D )0%))0-)*%&+,*"H)(-K-(./&,>X8&\ R\a J%+*-D#&D%&)"& )0-+%B-
)"++#-%&D )"++#-F+H-,"/",J")0 -%,0 C-&-"& D"/-*-&))"++#-" -+H-,"%(G" )0-)*%&+,*"H)(-K-(./&,>X8&e -c)*-B-(G0"C0 "&
)0-,%BE"#B *-C".&360-+-*-+#()++#CC-+))0%)&,>X8&e B%GH(%G%& "BH.*)%&)*.(-"& cG(.C-&-+"+360"++)#DG.&
(F-cH%&+"& C-&-+/*.B&%,/+1!1-+-J"((%G)0-/.#&D%)".& /.*+)#DG"&C)0-*-(%)".&+0"H E-)J--& (F-cH%&+"& C-&-+%&D
C*.J)0 *%)-%&D J..D P#%(")G./)0-cG(-B"& )0"+/%+)FC*.J"&C)*--" %&D /"&%(GH*.K"D-H.)-&)"%(,%&D"D%)-C-&-+/.*)*--
B.(-,#(%*E*--D"&C3
A/: B"*70!\&1"/),!K/#$A-,/+1!1-+-# (F-cH%&+"&# C-&-,(.&"&C# X6FP1;X
\\作为一类细胞壁蛋白"扩展蛋白 $RcH%&+"&+"
Rj1%以独特方式诱导依赖 H<的细胞壁的伸展和
膨压的松弛$;.+C*.K-!"#$3" 4AA4%’ 尽管扩展蛋白
作用于细胞壁的真正机制模式还不清楚"但有许多
证据表明这类蛋白是通过打断细胞壁多糖类物质之
间的非共价键$氢键%"允许细胞壁多聚物在细胞膨
压作用下蠕动"导致细胞快速伸展"从而促进植物生
长 $;.+C*.K-" 4AAA# ;.+C*.K-!"#$3" 4AA4# ‘*%GF
$")+#B#&-!"#$3" 4AA># 4AA8# <#),0"+.& !"#$3"
2???# !--!"#$3" 4AA4# $,M#--&F$%+.& !"#$3" 2??8#
h%&C!"#$3" 4A22%’
自从 $,M#--&F$%+.& 等 $2??4%第 2 次从黄瓜
\第 ? 期 欧阳昆唏等! 团花树 (扩展蛋白基因的克隆及表达分析
$=A,A*+--#"+5A-%下胚轴中发现 4 个扩展蛋白以来"
在各种不同植物中"克隆到越来越多的扩展蛋白基
因"如!拟南芥 $&6#;+()K-+-"/#$+#1#%&水稻 $N67H#
-#"+5#%&毛果杨 $8)KA$A-"6+,/),#6K#%&木瓜 $=#6+,#
K#K#7#%&玉米$.!# *#7-%和烟草$D+,)"+#1# "#;#,A*%
$0)H!UU0.B-+3E".3H+#3-D#U-cH%&+"&+UC-&-+30)B%’
根据系统发育关系"扩展蛋白分为 8 类"分别是!
(F-cH%&+"&$Rj1L%")F-cH%&+"&$Rj1N%"-cH%&+"&F("b-
L$Rj1!L%和 -cH%&+"&F("b-N$Rj1!N%$Y-&D-!"#$3"
4AA8%’ 已有的研究主要集中于 Rj1L和 Rj1N$!--
!"#$3" 4AA2# 7%BH-D*.!"#$3" 4AA9%"而且表明扩展蛋
白参与植物生长的许多过程"包括根和叶片的生长
$1"-& !"#$3" 4AA2%&纤维伸长$X#%& !"#$3" 4AA2%&果
实成熟 $ 7%&-!"#$3" 4AA9%&种子萌发 $;0-& !"#$3"
4AAA%&组织脱落$;0.!"#$3" 4AAA%以及柱头的花粉管
侵入$a%"!"#$3" 4AA=%等’
团花 树 $ &1"/),!K/#$A-,/+1!1-+-% 是 茜 草 科
$X#E"%,-%-%团花属植物"常绿大乔木"广泛分布于
南亚和东南亚 $罗献瑞等" 2???%’ 由于其生长迅
速"在菲律宾被称颂为.宝石树/ $Z.c" 2?=2%"并在
2?=4 年的世界林业大会上被称为.奇迹树/’ 在团
花树中"扩展蛋白基因的克隆已有报道 $欧阳昆唏
等" 4A2A%"但对其整个家族的了解知之甚少’ 本文
应用基因组步移"在线基因全长分析及 5(XL;R技
术克隆到扩展蛋白基因的其他成员"并对其在幼嫩
的不同组织的表达模式进行分析"为研究扩展蛋白
在团花树生长过程中的不同作用奠定基础’
2\材料与方法
EDEF材料
团花树生长于华南农业大学科研基地"5 f9 年
生"取处于生长旺盛的幼嫩组织"侧芽&嫩叶及胸径
处的形成层"液氮速冻" W>A o保存备用’ 形成层
组织取样按照 ‘*%GF$")+#B#&-等 $ 4AA8 %的方法’
而幼嫩的根采自温室中培养至 2 B高的实生苗’
E#@aSL聚合酶&!LE#@聚合酶& DS61&1$a2?F6
载体&5(XL;R试剂盒&第 2 条链 ,aSL合成试剂
盒&限制性内切酶和 7 N^X1*-B"cRcE#@"购自
6%Y%X%公司# 68 aSL!"C%+-与 aS%+-!购自 SRN
公司# 植物 aSL&总 XSL提取试剂购自 1*.B-C%#
aSL凝胶回收试剂盒&感受态大肠杆菌菌株 a<9(
购于天根生物技术有限公司# 用 1*"B-*9 设计的所
有引物$表 2%由上海生工生物公司合成# 测序由深
圳华大生物技术有限公司完成’
表 EF引物名称和序列!
H&5IEF>*(4/*#&4/F/V+/#,/
引物名称 1*"B-*&%B- 引物序列 1*"B-*+-P#-&,-+$9( W5( % 用途 ’+%C-
!.&CLD%H).* ‘6LL6L;‘L;6;L;6L6L‘‘‘;L;‘;‘6‘‘6;‘L;‘‘;;;‘‘‘;6‘‘6 制备平末端接头
70.*)LD%H).* 1@8FL;;L‘;;;‘‘‘;;FS<4 1*-H%*%)".& .//(%)-&D %D%H).*
LD%H).*1*"B-*2 $L12% ‘6LL6L;‘L;6;L;6L6L‘‘‘; 基因组步移
S-+)-D LD%H).*1*"B-*4 $L14% L;6L6L‘‘‘;L;‘;‘6‘‘6 ‘-&.B",J%(b"&C
4F9% 6;6;6LLL6‘6;LLL6L‘‘6;;E U666‘‘;LL6‘;‘‘L‘66L‘‘,
4F5 L‘‘‘L‘‘6;66L‘‘666L;LL6U66;‘‘666;LL6;LLL‘‘‘6;
5F9 66L6L;;66;6‘LLL‘;;L;ULLL‘;‘‘‘;6;L‘;LL‘‘6;
5F5 ;L;6;66L;66;LL;66‘‘6;;U‘;L‘6‘6;LL6;LLL‘‘‘6;
8F9 ;L;;L6;;L;;L66L6;L66U;L‘‘‘666‘‘L‘‘‘;L‘LL‘
8F5 6‘6L‘‘LL‘LL‘‘‘L‘‘L‘6U;6;6‘6L6;LL6;LL‘‘‘‘6;6
9F9 6‘L‘‘LL;L6‘‘‘;L6L‘;‘UL‘;L‘6LL6LLL‘L6‘‘LL‘‘‘6
9F5 LL6‘6;L6;;‘6‘;;L‘;‘6U;‘;L;;;L‘6‘‘66‘;;666‘
:F9 L;;L6;;L;;L66L6;L66L‘U;L‘‘‘66L‘‘L‘‘‘;L‘LL‘
:F5 ;;6L;66;LL;66‘‘6;;6‘U‘‘;6L‘LL;L‘‘‘6‘‘;L‘6;
=F9 6;LLLL6‘L6‘6L‘L‘‘6‘‘L6U;;6;66‘‘‘6;L66;L;L;L66
=F5 66;L6‘‘6L‘66LLLL‘L666‘UL‘LL‘‘‘L‘‘;L6;L‘L666L;
>F9 66‘‘66LL666;L;L6‘‘LL‘6UL‘‘LLL;L‘‘‘L‘‘‘L6LL‘‘6
>F5 66‘‘66LL666;L;L6‘‘LL‘6UL‘‘LLL;L‘‘‘L‘‘‘L6LL‘‘6
?F9 ‘6LL6L;‘‘LLL‘L;‘‘LL‘‘;U‘66;L66‘‘;L;L666‘L666;
?F5 ‘;‘‘L6L6L‘L6;L6;L‘L;;;U‘6‘L‘‘‘66666‘6‘LLL‘‘;6
2AF9 ;LLLL6‘L6‘L66‘‘‘L‘‘‘6U;‘;L;L;LL6;6‘‘6L‘;L6
2AF5 ‘6L‘66L6‘;6;L;L;‘LLL6;UL‘LL‘L‘‘L‘‘LL66L‘‘66;L
22F9 LL6LL‘66;L;LL;6L;6;;L;6U;L66;‘;LL‘LLL‘;L‘‘66
22F5 ‘6LL;‘6‘‘‘;6;L;;L6;L6ULL‘‘L‘‘LL6LL‘‘66;L‘;L6
24F9 6‘‘;66LL6LL;L‘6‘6;LL6U6‘666‘‘L‘‘‘;L‘LL‘666‘6
5:
林 业 科 学 8? 卷续表 -"#’(#+/7
引物名称 1*"B-*&%B- 引物序列 1*"B-*+-P#-&,-+$9(F5( % 用途 ’+%C-
24F5 ‘6LLL‘‘L‘LLLL‘‘‘LLL6;UL‘LLL‘LL;‘‘6‘‘LL6;L‘L
25F9 L6‘LL;‘‘LLL‘LLL6‘LL‘L‘U6‘‘LLLL;L‘‘;6‘L‘LLL‘‘6
25F5 ;6;‘6L6;6‘L‘6;6‘‘6‘‘6;U‘6;LLLL‘L‘‘‘‘L‘‘;L6;L‘
28F9 ;66;6L6LL‘;LL;L‘‘‘L;LLULL;L‘‘;6‘L‘L‘L‘‘6;LLL‘6
28F5 ;6L‘6;6L‘6‘;6‘LL6‘‘LL;U‘‘‘L‘‘LL6LL‘‘66;L;LL6;
29F9 LL‘;L‘;L6LL;;666‘‘L;6U;‘66‘66L‘‘6L‘‘‘;L66‘666
29F5 LL‘‘;66‘6L666;6;6;6;6LU6‘‘;;6‘6‘‘6LLLL;666;‘L6
2:F9 ‘L‘LL;6‘‘LL;LL66;;66;U6‘6‘‘666‘‘L‘‘‘;L‘LL‘
2:F5 ‘L666L;;66LLL‘‘‘L;LL6U‘6‘‘;‘L;L6LLL‘LL;‘6L6
4DF5(XL;R ‘6‘LLLLL‘‘‘L‘‘6;66L‘‘66-U‘;LL‘6‘L;‘‘6L‘LL;6‘6‘L/ 5(XL;R
8F5(XL;R 6‘‘;LL;;LL6‘6;LL‘LLL;U;L;;L‘6L‘6‘L6‘‘LL‘LL;L
:F5(XL;R L;6;;6L;66;LL;66‘‘6;;6‘U‘‘‘;6L‘LL;L‘‘‘6‘‘;L‘6;
=F5(XL;R ‘LL‘‘‘L‘‘;L6;L‘L666L;U;;L6;LLL‘‘‘6;LL‘‘L‘6‘
>F5(XL;R 6‘L‘‘‘6666;‘6‘LL‘‘‘;6U;6;6;L666L‘‘‘6;L;L‘;;L‘6
?F5(XL;R ‘66666‘6‘LLL‘‘;6;;L‘‘U‘‘L;66;L‘L‘666LL;;;;LL‘
2AF5(XL;R L;;;6‘6L‘LL‘LL‘L‘‘L‘‘LU;‘‘6‘‘;LL;LLL6‘6;LL‘‘L
22F5(XL;R ;LL6;6L6;;;6LL;L‘‘;L6;U;;‘6‘‘LLL‘L6L666L66L6‘
25F5(XL;R ‘‘‘L‘‘;L6;L‘L666L;;L6U‘‘;6;LL‘‘L‘6LL;6‘‘;LL;;
28F5(XL;R 6;;6L6LL6‘66‘;;;;6‘;6U;‘;6‘LL‘;6;L6‘6;;6‘
29F5(XL;R 6‘‘6LL;;;‘6‘‘6LLLL‘L‘6U;‘6‘L‘66‘6L;;;66‘6;66‘
L,Rj1L4C ;6;LL6;;;L;‘L6‘L;LL;;0 ULL‘‘‘6‘LLLL6;6L‘LL66‘L;;L" @XZ扩增\@XZ%BH("/",%)".&
L,Rj1L5 6;6;LL;;;;L;‘L6‘‘;LL;U‘6L;L;6L‘L6L6L‘L;‘;;LLL;6
L,Rj1L8 L;6;L‘;LL6;L‘‘;L;6;LU‘;6666;6;6‘LLL666L‘LL;6
L,Rj1L9 ;‘;L‘L‘6‘;6‘‘6L‘‘LL;6U;;‘;66;L‘;;;;6L;L;L;
L,Rj1L: L6‘‘;6L6‘LL6;;L‘;‘6;;6ULL666L‘LL;6‘‘;;;;;;6;L
L,Rj1L= L‘‘‘LLL6‘‘LL;66;66‘66U66LL66‘LL66‘‘‘;L;;L‘6
L,Rj1L> L‘L‘LLLL6‘‘;6L66‘6‘‘66U‘‘;‘‘66L‘L;6;6‘LL‘66;6
L,Rj1L? LL6‘‘;L‘66‘6‘‘‘6;6‘‘6;6U;66;;;;;;;6L;666L‘6;L6L
L,Rj1L2A L6‘;L6L6;;6;‘‘L66;66;66U6;L‘6L‘LL;6‘‘;‘L;;‘;6‘6
L,Rj1L22 L6‘;L6L‘;6‘6L6;;‘L666U666L‘L666;6;L‘;L‘L;L‘6
L,Rj1L24 66;L‘;L‘LLLLL6‘‘LLL‘;;6U6‘L6LLL66‘66‘;L;6;‘6L;;6
L,Rj1L25 ‘‘LLLL6‘‘LL‘66;66‘‘66U;6;LL‘6‘LL66‘6;;L;;L‘6‘
L,Rj1L28 ‘LLL6‘‘;6L6;‘66‘‘L66L6U‘L;L6‘L‘;66;L‘;‘‘LL
L,Rj1L29 ‘LLL6‘‘;6L6;‘66‘‘‘;UL6;66;66;6‘;;;;L6LL;L
L,Rj1L2: ‘;6L;6;LL666L‘6;L‘;L6U‘;L‘;LL6‘L‘L‘66‘LL;;6
L,Rj1L2FMV L‘L‘6‘‘‘6LL6‘‘‘L‘LLL‘66b U66;‘;;;6666L‘;L6;LL6( 荧光定量\X6FP1;X
L,Rj1L4FM ‘66LL‘6;;LL‘LL;;L;LL‘UL‘;L;L6L;L;LLLL6L‘LLL‘6
L,Rj1L5FM ;L6LL‘66;LL‘L‘;6L‘L6‘‘‘66UL;‘;;LLL;6;L6666;66;6;
L,Rj1L8FM ‘L66‘66‘‘666;;L;;‘6;LU;66;;LLL;;6L;‘;L;;;66L
L,Rj1L9FM ;‘‘‘LL;L6L‘;L6L‘‘L6L‘6LU;;L;6‘6;;L6LL;6;;LLL6LL;
L,Rj1L:FM L66‘6L6L6‘‘;L666LL‘‘‘6‘6U‘;;6LL‘;‘‘‘6‘;6LL;6L
L,Rj1L=FM ‘6L‘LL‘L6L6‘‘‘;L‘‘‘;6U6L66‘‘;‘‘‘6‘‘6LL‘LL;
L,Rj1L>FM LLL6‘6‘6666‘;6LLL6L‘66‘‘U;L;L;666L;6666L;L;66;;;6
L,Rj1L?FM ‘‘L66‘‘‘6;L666‘6‘66‘66U66;;;;;;;6L;666L‘6;L6L
L,Rj1L2AFM 66‘LLL‘‘‘L‘LL‘‘‘LL‘‘U6;L6L;LL‘;LLL6;‘6‘L‘6L
L,Rj1L22FM L;L‘‘;L6;‘;6‘L‘‘6L‘U‘6‘‘L;;L66;L;;LL‘6‘6L
L,Rj1L24FM ‘;6LL;;LLL;L;LL;6‘;6LL6U‘;L;6;‘6L;;66‘;;6;L
L,Rj1L25FM ‘;L‘;‘‘6L‘‘66LL‘‘66;U666L;LLL6L;L66L‘;66;L6;;L
L,Rj1L28FM 66L6‘‘‘‘;L‘LL‘LL‘L6‘‘UL66LL;;L;6L;LL;‘6‘;LL;6;
L,Rj1L29FM ;‘6‘L‘66‘6L;;;66‘6;66‘U6L‘6;;L;;6;6‘;;L6;66;
L,Rj1L2:FM LLL‘‘LLLLLL6‘L6‘;;6‘L‘6U6;;‘6L6‘;‘6‘6LL‘;6L;6L6
L,;G1FM ‘L;L‘‘L‘‘L‘LL6;6L6;6L6‘‘ULL;;6‘;;;LLL;L;;L;L6
\\%%! .4/表示 >X8&基因号".9/表示向上游步移# E! 基因组步移巢式第 2 次 1;X所用引物# ,! 基因组步移巢式第 4 次 1;X所用引物#
D! 5(XL;R的 >X8&基因号# -! 5(XL;R巢式第 2 次 1;X所用引物# /! 5(XL;R巢式第 4 次 1;X所用引物# C! 扩增 @XZ的基因名# 0! @XZ
扩增所用正向引物# "! @XZ扩增所用反向引物# V! 定量分析的基因名# b! 定量分析所用正向引物# (! 定量分析所用反向引物’
%! .4/ "&D",%)-+>X8&C-&-&#BE-*" %&D .9/ "&D",%)-+C-&.B",J%(b"&C#H+)*-%B# E! 60-H*"B-*#+-D "& /"*+)&-+)-D 1;X"& C-&.B",J%(b"&C# ,!
60-H*"B-*#+-D "& +-,.&D &-+)-D 1;X"& C-&.B",J%(b"&C# D! >X8&C-&-&#BE-*"& 5(XL;R# -! 60-H*"B-*#+-D "& /"*+)&-+)-D 1;X"& 5(XL;R# /!
60-H*"B-*#+-D "& +-,.&D &-+)-D 1;X"& 5(XL;R# C! ‘-&-&%B-J")0 @XZ%BH("/",%)".&# 0! Z.*J%*D H*"B-*"& @XZ%BH("/",%)".&# "! X-K-*+-H*"B-*
"& @XZ%BH("/",%)".&# V! ‘-&-&%B-"& P#%&)")%)"K-%&%(G+"+# b! Z.*J%*D H*"B-*"& P#%&)")%)"K-%&%(G+"+# (! X-K-*+-H*"B-*"& P#%&)")%)"K-%&%(G+"+3
8:
\第 ? 期 欧阳昆唏等! 团花树 (扩展蛋白基因的克隆及表达分析
EDGF方法
2T4T2\aSL#总 XSL的提取及 ,aSL的合成\以
团花树形成层为材料"提取基因组 aSL’ 以生长旺盛
的 8个组织"侧芽&嫩叶&形成层及嫩根为材料"分别提
取总XSL"经aS%+-!处理"分别按照1*"B-7,*"H)("2+)
+)*%&D ,aSL7G&)0-+"+Y")合成,aSL第 2条链"用于基
因全长的克隆# 按照1*"B-7,*"H)( X6$%+)-*$"c合成
用于荧光定量的,aSL及根据 5(XL;R试剂盒合成用
于 5(XL;R的,aSL’
2T4T4\基因组步移文库的构建\用限制性内切酶
&$A!&S6#!&>,)X’&M#!#&B-#!&?-K!和 ?"A!
对提取的 aSL进行酶切&回收"用于构建不同的基
因组步移文库’ 制备文库所用平末端接头的 9A *!
反应体系!9 *!!.&CLD%H).*$2AA *B.(*!W2%"9 *!
70.*)LD%H).*$ 2AA *B.(*!W2 %" 2T= *! S%;(
$5 B.(*!W2%"5>T5 *!DD<4@# 其反应条件为!?9 o
9 B"&" 室温下自然冷却’ > *!步移文库构建的反
应体系为!8T= *!酶切产物" 4 *!上述已制备好的
平末端接头"AT9 *!68 aSL!"C%+-"AT> *!2A e
!"C%)".& N#/-*# 其反应条件为!2: o连接过夜"于
:9 o灭活 2A B"&"加入 54 *!DD<4@稀释’
2T4T5\扩展蛋白基因保守区的克隆#上游和下游基
因组步移#开放阅读框!@XZ"的在线预测及 5$XL;R
扩展蛋白保守区的扩增按照欧阳昆唏等$4A2A%方
法"以 aSL为模板"=4 o延伸由 2 B"& 改为 2T9
B"&"其他都一致’ 根据扩增到的保守区设计向上
游和下游步移的巢式 1;X所需引物’ 将扩增到的
保守区&上游和下游序列在 aSL$LS:TA 软件中
进行 拼 接"利 用 在 线 分 析 工 具 $ 0)H!UU("&#c23
+./)E-**G3,.BUE-**G3H0)B(1 ).H",k/C-&-+0sC*.#H k
H*.C*%B+s+#EC*.#H kC/"&D" 0)H!UUJJJ3,E+3D)#3
DbU+-*K",-+US-)‘-&-4% "对拼接到的 aSL序列的
@XZ&内含子与外显子进行预测’ 因为在不同物种
之间"Rj1L的相似性极高$ 7%BH-D*.!"#$3" 4AA9%"
所以将预测得到的 @XZ编码的氨基酸序列在 S;NQ
中进行比对以进一步确认 @XZ的准确性"并设计引
物扩增 @XZ’ 用扩增到的 @XZ序列与基因组进行
比较"分析在 @XZ中的内含子和外显子’ 在此基础
上"按照 5(XL;R试剂盒的说明"获得各个 Rj1L基
因的 5 ( 端 非 编 码 区 $ 5 ( ’&)*%&+(%)-D X-C".&"
5(’6X%’ 所有扩增所用引物见表 2’
2T4T8\基因 &,>X8&\ R\a 所编码的氨基酸序列的
信号肽预测# 比 对及 系统 进化树分 析 \ 基 因
&,>X8&\ R\a 所编码的氨基酸序列的信号肽由在线
分析工具 7"C&%(1软件 $ 0)H!UUJJJ3,E+3D)#3DbU
+-*K",-+U7"C&%(1U%进行预测’
采用在线工具 R$N!FRNQh-E +-*K-*$ 0)H!UU
JJJ3-E"3%,3#bU6..(+UB+%U,(#+)%(J4U%的设定参数
$ h-"C0)$%)*"c" ‘.&&-)# ‘%H @H-&"&C 1-&%()G"
2ATA# ‘%H Rc)-&+".& 1-&%()G" AT4# X-+"D#-F+H-,"/",
1-&%()G" @S# 蛋白基因所编码的氨基酸序列进行比对"再用在线
工 具 N@j7+./)J%*-UN@jt/.*B30)B(%观察比对结果’
利用在线工具 R$N!FRNQh-E +-*K-*对团花树
的 2: 个 >X8&基因和其他植物的 >X8&基因所编
码的氨基酸序列进行多重比较"然后按照 ‘*%GF
$")+#B#&-等 $ 4AA8 % 的方法"采用 $R‘L9 软件
$6%B#*%!"#$3" 4A22%对比对结果构建系统进化树’
2T4T9\基因 &,>X8&\ R\a 的 X6FP1;X分析\以团
花树中的环孢素 L受体基因 &,=78$‘-&N%&b 注册号
[j?A49>=%为内参"对扩展蛋白基因 &,>X8&\ R\a 在
侧芽&嫩叶&形成层及嫩根中的表达量进行X6FP1;X
分析’ X6FP1;X分析在 ;Zj?: $NQ@FXLa% 定量
1;X仪上运行’ 为了确保扩增子的特异性"基因
&,>X8&\ R\a 所用的定量引物都设计在 5(’6X上"
并对扩增子进行测序’ 定量所用引物见表 2’
4\结果与分析
GDEF基因组步移文库的构建
由于团花树基因组 aSL比较复杂且未见报道"
所以本试验采用 = 种平末端限制性内切酶 &$A!&
S6#!&>,)X’&M#!#&B-#!&?-K!和 ?"A!进行酶
切’ 根据图 2 的电泳分析结果可以看出"在所使用
的限制性内切酶中"&$A!&M#!#&B-#!和 ?-K!所
产生的 aSL片段弥散均匀"S6#!和 >,)X’次之"
而 ?"A!最差"而且基因组条带清晰可见’ 这也说明
在团花树的基因组 aSL中"?"A!酶切位点很少"而
前 : 种酶切位点较多且均匀分布’ 因此采用 aSL
凝胶回收试剂盒对前 : 种酶切产物进行过柱回收并
与平末端接头连接构建 : 种步移文库’
GDGF团花树 ?@7=基因系列的获得
以 aSL为模板"按照欧阳昆唏等$4A2A%的方法"
1;X产物电泳结果见图 4’ 对图 4 中的 5 个不同大小
的条带分别进行凝胶回收&克隆并转化感受态细胞
a<9("各自筛选 5A 个阳性克隆送去测序’ 排除重复
序列"找到 2: 条不同的保守区序列"包括已知的
&,>X8&\$‘-&N%&b 注册号Z[82=>8=%"并经N!L76比
对进一步确认’ 根据获得的 29 条保守序列"设计向
上游和下游步移的引物扩增两端未知序列’ 拼接这
9:
林 业 科 学 8? 卷图 2\基因组 aSL的酶切结果
Z"C32\60-*-+#()+./C-&.B",aSL,(-%K%C-
5 段序列并在线分析是否已获得基因的 @XZ"并用引
物扩增 @XZ"再按照 5(XL;R试剂盒方法获得 5(
’6X序列’ 根据 Y-&D-等$4AA8%的命名法则"把这
新获得的 29 个 >X8&基因命名为 &,>X8&b R\a"
‘-&N%&b 的注册号为[Z?44:>: W[Z?44=AA"其相对应的
基因组aSL序列的注册号为[Z?44=A2 W[Z?44=29’
图 4\兼并引物的扩增产物
Z"C34\1;XH*.D#,)+%BH("/"-D EG)0-D-C-&-*%)-D H*"B-*+
GDCF序列分析
表 4 显示了基因 &,>X8&\ R\a 的序列的具体
信息"包括 ,aSL长度&编码的氨基酸长度及所预测
的信号肽氨基酸长度’ 基因 &,>X8&\ R\a 所编码
的氨基酸长度从 48ALL到 49>LL不等"而预测的信
号肽的氨基酸长度有 2?LL到 4>LL’
表 GF=+?@7=< AH&5I4\H./7/’&()/7(#1"*4&’("#"1=+?@7=< A基因
‘-&-
,aSL长度
,aSL(-&C)0UEH
预测蛋白长度
1*-D",)-D H*.)-"&
(-&C)0$%B"&.%,"D+" LL%
预测信号肽长度
1*-D",)-D +"C&%(H-H)"D-(-&C)0$%B"&.%,"D+" LL%
$ 0)H!UUJJJ3,E+3D)#3DbU+-*K",-+U7"C&%(1U%
&,>X8&\ 2 49: 49> 42
&,>X8&b 2 24> 499 4>
&,>X8&] ??A 499 4>
&,>X8&^ 2 2?= 494 49
&,>X8&_ 2 5A2 49> 42
&,>X8&a 2 A5> 495 4:
&,>X8&f 2 2:> 48> 4A
&,>X8&e 2 24= 49: 2?
&,>X8&‘ 2 552 49> 44
&,>X8&\c 2 22= 48A 4A
&,>X8&\\ 2 A45 49A 44
&,>X8&\b 2 259 48> 4A
&,>X8&\] 2 5A: 48> 4A
&,>X8&\^ 2 4:> 48: 4A
&,>X8&\_ 2 5AA 48= 4A
&,>X8&\a 2 25A 499 45
\\通过基因 &,>X8&\ R\a 所编码的氨基酸序
列比对"从图 5 可以发现编码的 2: 个团花树
Rj1L蛋白都含有 Rj1L蛋白的主要保守特征"
包括 S端的信号肽&> 个半胱氨酸 $,G+)-"&-";%
残基&2 个组氨酸域 $<"+F10-FL+H"末端的 8 个保守色氨酸 $)*GH).H0%&"h%残基"而
在 L,Rj1L24 的第 2 个 h 被亮氨酸 $(-#,"&-"!%
所取代’
对 &,>X8&\ R\a 基因组序列与 ,aSL序列进
行比较’ 图 8 显示基因 &,>X8&\ R\a 编码序列和
内含子U外显子结构模式极其保守"但内含子长度和
5(’6X序列存在极大差异’ 内含子 2 长度变幅从
&,>X8&f 的 >9 EH 到 &,>X8&e 的 8A8 EH# 而内含子
4 最短的只有 ?> EH"最长为 2 948 EH# 且通过比对
发现内含子之间和 5(’6X之间的序列各自存在很
高的特异性’
::
\第 ? 期 欧阳昆唏等! 团花树 (扩展蛋白基因的克隆及表达分析
图 5\&,>X8&\ R\a 预测的蛋白序列比对结果
Z"C35\L("C&B-&)./)0-H*-D",)-D H*.)-"& +-P#-&,-+./&,>X8&\ R\a
下划线表示 S端的信号肽"字母 ;&h以及 表示成熟蛋白在 S端的 XQ1‘I基序及 ;端的 YSZXI基序’
60-SF)-*B"&%(+"C&%(H-H)"D-+%*-#&D-*("&-D360-,.&+-*K-D ;G+" 6*H *-+"D#-+%&D <"+F10-FL+H B.)"/*-+"D#-+%*-"&D",%)-D EG)0-(-)-*
;" h" %&D =:
林 业 科 学 8? 卷图 8\团花树 >X8&家族的结构示意
Z"C38\7,0-B%)",*-H*-+-&)%)".& ./)0-+)*#,)#*-./)0->X8&/%B"(G"& &%,/+1!1-+-
黑色和灰色框分别表示外显子和 5(’6X# 连接 4 个框之间的线条表示内含子# 并且在图中标出了起始密码子&终止密码子和各
个片段的长度’
Rc.&+%&D ’6X+J-*-"&D",%)-D %+E(%,b %&D C*-GE.c-+" *-+H-,)"K-(G" %&D ("&-+E-)J--& E.c-+"&D",%)-D %+"&)*.&+360-+)%*),.D-" +).H
,.D-%&D (-&C)0 .//*%CB-&)J-*-(%E-(-D "& )0-/"C#*-3
GDLF系统进化树分析
根 据 已 有 的 报 道 $ ;.+C*.K-" 2??># ‘*%GF
$")+#B#&-!"#$3" 4AA8# !"&b !"#$3" 2??>%"Rj1L蛋
白由 8 个亚家族组成’ 对 L,Rj1L2 W2: 与其他植
物的 48 个 Rj1L蛋白进行系统进化树构建$图 9%’
由图可知"在团花树中有 8 个 Rj1L蛋白属于 L亚
家族" 分 别是 L,Rj1L2& L,Rj1L9& L,Rj1L> 和
L,Rj1L?’ 这类亚家族蛋白拥有独特的保守序列"
在成熟蛋白的 S端存在 XQ1‘I氨基酸序列"而在 ;
端存在 YSZXI氨基酸序列’ 由相关报道显示"这 4
个特有的基序是 L亚家族的标志序列并且这类亚
家族在次生木质部大量存在 $高燕" 4A22# ‘*%GF
$")+#B#&- !"#$3" 4AA8# h%&C !"#$3" 4A22 %’
L,Rj1L4& L,Rj1L5& L,Rj1L8& L,Rj1L: 与
L,Rj1L22 属于 N亚家族"L,Rj1L=&L,Rj1L2A&
L,Rj1L24&L,Rj1L25&L,Rj1L28 和 L,Rj1L29 属
于 ;亚 家 族" 而 属 于 a 亚 家 族 的 只 有 2 个
L,Rj1L2:’
GDNFXHRV>-X分析
为筛选到合适的内参引物"从图 :L可以看出"
在 8 个泳道中引物对 L,;G1FM所扩增的产物条带
清晰单一亮度相似"无二聚体# 图 :N显示了其溶解
峰聚拢且无杂峰# 与标准曲线图 :;相比"它的扩增
效率为 2A5T=d’
从图 = 可以看出"&,>X8&\ R\a 在 8 个不同的
组织 中 的 表达 存在 极大 的差 异" 在 形 成 层 中
&,>X8&e 的相对表达量最高"&,>X8&\ 和 &,>X8&\_
次之" 其 余 表 达 很 低 或 不 表 达’ 在 嫩 叶 中"
&,>X8&^&&,>X8&a&&,>X8&e 的相对表达量在 4A 倍
以上’ 在 8 个组织中"&,>X8&] 和 &,>X8&\b 均极
少表达"而 &,>X8&\a 仅在嫩根中表达’
5\讨论
进化树分析显示了 Rj1L被分为的 8 个分支
$图 9%与 !"&b 和 ;.+C*.K-$2??>%报道的结果相似"
并且他们也推测在同一个分支中的 Rj1L在某方面
的 功 能 可 能 相 似’ 在 进 化 树 中" L,Rj1L2&
L,Rj1L9&L,Rj1L> 和 L,Rj1L? 同属于 L亚家族"
而这个亚家族含有多个在初生和次生维管组织中高
表达的 >X8&基因"如 &">X8&^ 和 &">X8&a $ 73
>:
\第 ? 期 欧阳昆唏等! 团花树 (扩展蛋白基因的克隆及表达分析
图 9\(F-cH%&+"& 基因的系统进化树分析
Z"C39\10G(.C-&-)",%&%(G+"+./(F-cH%&+"& C-&-+
团花树 &1"/),!K/#$A-,/+1!1-+-!&,>X8&\$Z[82=>8=% "&,>X8&b R\a
$[Z?44:>: W[Z?44=AA % # 拟 南 芥 &6#;+()K-+-"/#$+#1#! &">X8&$’5A8=: % " &">X8&b $ ’5A8>2 % " &">X8&^ $ 24?94: % " &">X8&_
$’5A8=>% "&">X8&a$’5A8>A% "&">X8&\_ $24:5:2% # 油菜 F6#--+,#
1#KA-! F1>X8&\ $ L[AAA>>9 % # 杉 木 =A11+1’/#*+# $#1,!)$#"#!
=$>X8&b$RZ29>>25 % # 黄瓜 =A,A*+--#"+5A-!=->X8&\ $’5A5>4 % "
=->X8&b $ ’5A8:A % # 蕃 茄 :7,)K!6-+,)1 !-,A$!1"A*! :!>X8&$’>4245% " :!>X8&_ $LZA9?8>? % " :!>X8&\e $L[AA8??= % # 烟草
D+,)"+#1# "#;#,A*!D">X8&\ $LZA8?59A % "D">X8&b $LZA8?592 % "
D">X8&] $ LZA8?594 % " D">X8&^ $ LZA8?595 % " D">X8&_
$LZA8?598 % # 水稻 N67H# -#"+5#! N->X8&\ $ A^==>4 % " N->X8&b
$’5A8== % "N->X8&^ $’>948: % # 杏 86A1A-#6*!1+#,#!8#>X8&$’?52:=% # 豌豆 8+-A*-#"+5A*!8->X8&\$j>92>=% # 火炬松 8+1A-
"#!(#!K8">X8&b$’:8>?A%3
6#*&-*" D%)%H#E("+0-D .&("&-%)0)H!UU%/GB-)*"c3
%*%E"D.H+"+3"&/.U&%**%G+U-cH-*"B-&)E*.J+-3H(%"以及
:!>X8&\e 基因$X-"&0%*D)!"#$3" 2??>%和 =$>X8&b
基因$高燕" 4A22# h%&C!"#$3" 4A22%’ 这个亚家族
中的所有 Rj1L蛋白都拥有独特的保守序列"在成
熟蛋白的 S端存在XQ1‘I氨基酸序列"而在;端存
在 YSZXI氨基酸序列"并且作为 L亚家族的标志
$图 5%’ L,Rj1L4&L,Rj1L5&L,Rj1L8&L,Rj1L:
图 :\内参引物对 L,;G1FM的鉴定
Z"C3:\QD-&)"/",%)".& ./*-/-*-&,-C-&-H%"*L,;G1FM
L3凝胶电泳检测# N3溶解曲线# ;3标准曲线’ 2" 4" 5" 8"
;YW分别表示以芽&嫩叶&形成层&嫩根 2AA &C,aSL为模板
及阴性对照的 1;X产物泳道’
L3‘-(-(-,)*.H0.*-+"+# N360-B-()"&C,#*K-# ;360-+)%&D%*D
,#*K-32" 4" 5" 8 %&D ;YW *-H*-+-&)(%&-./1;X H*.D#,)
%BH("/"-D J")0 2AA &CE#D" )-&D-*(-%/" ,%BE"#B*-C".&" G.#&C
*..),aSL%+)-BH(%)-%&D &-C%)"K-,.&)*.(*-+H-,)"K-(G3
和 L,Rj1L22 属于 N亚家族’ 而在这个亚家族中
的其他成员在生长的根和下胚轴中表达量很高"如!
火炬松 $8+1A-"#!(# % 在响应吲哚丁酸处理时"
K8">X8&b 在不定根形成的过程中和下胚轴的基部
存在表达 $<#),0"+.& !"#$3" 2??? %# 黄瓜 =->X8&在下 胚 轴 存 在 表 达 $ 70,0-*E%& !"#$3" 2??9 %’
L,Rj1L=& L,Rj1L2A& L,Rj1L24& L,Rj1L25&
L,Rj1L28 和 L,Rj1L29 则属于 ;亚家族"拟南芥
的 L)Rj1L2 与 L)Rj1L9 以及 蕃茄 $ :7,)K!6-+,)1
!-,A$!1"A*%的 !-Rj1L9 同属于这一分支’ 在拟南
芥中"&">X8&\ 基因表达并加速了气孔的开放
$_0%&C!"#$3" 4A22%"而 &">X8&_ 主要在拟南芥的
地上表达$1%*b !"#$3" 4A2A%’ 已知蕃茄的 :!>X8&_
基因在果实膨大期有所表达"并且果实在尺寸最大
?:
林 业 科 学 8? 卷图 =\&,>X8&\ R\a 基因在团花树的芽&嫩叶&
形成层和嫩根 8 个快速生长组织中的表达模式分析
Z"C3=\L&%(G+"+./-cH*-++".& H%)-*& ./2: (F-cH%&+"&
C-&-+"& /.#**%H"D C*.J)0 )"++#-+" E#D" )-&D-*(-%/" ,%BE"#B
*-C".& %&D G.#&C*..)"& &%,/+1!1-+-EG*-%(F)"B-1;X
的绿色期表达量最高"而在此后的果实成熟早期"其
表达 量 又 下 降 $ N*#BB-( !"#$3" 2??? %’ 与
L,Rj1L2: 同属于 a亚家族的 N->X8&\ 基因"在水
稻根的生长区存在很高的表达$;0.!"#$3" 2??=%"
而在本文中"&,>X8&\a 仅在根中特异表达$图 =%’
由于团花树缺乏遗传信息"因此在本试验中"曾选择
与其近源物种的多个常用看家基因为内参"如!&,"+1
$ aM9529:9 %& 4;+@A+"+1 $ LZ4?=A>? %& G&8SM
$‘h895AA= %& EA;A$+1 $ R’AA=858 % 和 >3\d#$K/#
$LZ24AA?5%"但均未找到合适的引物’ 而环孢素 L
受体基因 =7,$)K/+$+1 的引物对 L,;G1FM符合荧光定
量的要求"在缺乏遗传信息的团花树中可作为内参
基因用于分析基因在不同组织的相对表达$图 :%’
>X8基因具有独特表达模式以满足各种不同
的生理活性’ 如"在咖啡$=)育阶段"5 个 >X8&基因在外胚乳&胚乳和果皮的 5
个不同组织中的表达模式各不相同 $N#Dr"&+b"
!"#$3" 4A22%# 在番茄种子的发育和萌发阶段" 4 个
>X8&基因在不同的胚胎组织中存在不同的表达和
定位$;0-& !"#$3" 4AA2%# 在水稻的叶片&茎秆和根
中 8 个 >X8&基因的表达模式也不同 $;0.!"#$3"
2??=%’ 此外">X8基因独特的表达模式受到启动
子的调控$;.+C*.K-" 2??>%’ 在拟南芥中"根据报告
基因分析"许多 >X8基因的启动子表现出各种不同
的组织特异性表达$;0.!"#$3" 4AAA# ;.+C*.K-!"#$3"
2??># 7#& !"#$3" 4A22%"并且在拟南芥根毛细胞中
特异表达的 &">X8&f 和 &">X8&\e 基因的启动子区
含有根毛特异的 ,+-元件 $X4AA:%’ 在本文中"&,>X8&e 在形成层中的表达量
极高" 存在明显的组织特异性 $图 = %’ 表明"
&,>X8&e 拥有一个表达特异的启动子"能在形成层
的特定环境下调控基因表达"包括生长发育信号和
激素’
新形成的叶片需要经历细胞的分裂和增大"从
而长成完全大小的叶片’ 已有记录显示">X8基因
的表达模式和活性与叶片增大相关’ Y-(-*和
;.+C*.K-$2??9%从蕃茄生长叶片中提取的扩展蛋白
能够诱导黄瓜幼苗细胞壁的伸展’ 在拟南芥生长的
叶片中"&">X8&\c 优先表达"而在 ;0.和 ;.+C*.K-
$4AAA%用 &">X8&\c 构建正义和反义载体转化拟南
芥的试验中发现"与对照植株相比"正义转基因植株
拥有较大的叶片"而反义植株的叶片较小’ $#(-*
等$4AA=%也从玉米生长的叶片中鉴定出与叶片生
长相关的 2? 个 >X8基因"而它们又被分为与细胞
分裂&叶片伸展及细胞壁分化相关的 5 组"并认为它
们在叶片的增宽和伸长中扮演着不同的角色’ 在本
文中"&,>X8&^&&,>X8&a&&,>X8&\_&&,>X8&\^ 和
&,>X8&\c 在嫩叶中都有大量表达$图 =%"这些表明
这些 &,>X8&基因可能通过协同作用在团花树叶片
的生长中起着重要的作用’
Rj1L蛋白 L亚家族中其他物种的 >X8&基因
多在初生和次生维管组织中高表达"与这些基因相
似"&,>X8&e 基因在形成层中也存在高表达$图 =%’
这些表明 &,>X8&e 基因在团花树木质部发生的过
程中可能起到重要的作用’ 并且"已有许多研究证
实了 >X8&与纤维素的新陈代谢及纤维素含量的增
加有关 $‘*%GF$")+#B#&-!"#$3" 4AA># h%&C!"#$3"
4A22# _-&.&"!"#$3" 4AA8%’ 这为在团花树中研究
(F-cH%&+"& 基因功能与木质部的生长和材质的关系
提供了基础"并最终为林木分子育种提供潜在的候
选基因’
参 考 文 献
高\燕34A223杉木木材形成过程扩展蛋白基因的克隆与表达分
析3林业科学"8=$22% !88 W923
罗献瑞"高蕴璋"陈伟球"等32???3茜草科UU罗献瑞3中国植物志3
北京! 科学出版社" 4:A W4:43
欧阳昆唏"李\娜"张东方"等34A2A3团花树形成层扩展蛋白基因
,aSL的克隆和序列分析3热带亚热带植物学报" 2> $ 4 % !
292 W29>3
N*#BB-(aL"<%*H+)-*$<"a#&+B#"*132???3a"/-*-&)"%(-cH*-++".&
./-cH%&+"& C-&-/%B"(GB-BE-*+D#*"&CC*.J)0 %&D *"H-&"&C./
).B%)./*#")31(%&)$.(N".("5?$2% !2:2 W2:?3
N#Dr"&+b"Q‘"7%&).+6N"7-*%6"!"#$34A223RcH*-++".& H%)-*&+./
)0*-- %(H0%F-cH%&+"& "+./.*B+ "& =)D-K-(.HB-&)31(%&)N".(.CG" 25$5% !8:4 W8=23
A=
\第 ? 期 欧阳昆唏等! 团花树 (扩展蛋白基因的克隆及表达分析
;0-& Z"a%0%(1"N*%D/.*D Y[34AA236J.).B%).-cH%&+"& C-&-++0.J
D"K-*C-&)-cH*-++".& %&D (.,%("r%)".& "& -BE*G.+ D#*"&C +--D
D-K-(.HB-&)%&D C-*B"&%)".&31(%&)10G+".(" 24=$5% !?4> W?5:3
;0-& Z"N*%D/.*D Y[34AAA3RcH*-++".& ./%& -cH%&+"& "+%++.,"%)-D J")0
-&D.+H-*B J-%b-&"&C D#*"&C ).B%). +--D C-*B"&%)".&3 1(%&)
10G+".(" 248$5% !24:9 W24=83
;0.<6";.+C*.K-a[34AAA3L()-*-D -cH*-++".& ./-cH%&+"& B.D#(%)-+
(-%/C*.J)0 %&D H-D",-(%E+,"++".& "& &6#;+()K-+-"/#$+#1#31*.,S%)(
L,%D 7,"’+%"?=$2=% !?=>5 W?=>>3
;0.<6"Y-&D-<32??=3RcH*-++".& ./-cH%&+"& C-&-+"+,.**-(%)-D
J")0 C*.J)0 "& D--HJ%)-**",-31(%&);-("?$?% !2::2 W2:=23
;.+C*.K-a[32??>3;-(J%((..+-&"&CEG-cH%&+"&+31(%&)10G+".("
22>$4% !555 W55?3
;.+C*.K-a[34AAA3!..+-&"&C./H(%&),-(J%(+EG-cH%&+"&+3S%)#*-"
8A=$:>A4% !542 W54:3
;.+C*.K-a["!"!;";0.< 6"!"#$34AA4360-C*.J"&CJ.*(D ./
-cH%&+"&+31(%&);-(10G+".("85$24% !285: W28883
;.+C*.K-a["6%)G%&%7"a#*%,0b.a$"!"#$32??>3<"C0(G+H-,"/",%&D
D"+)"&,)-cH*-++".& H%)-*&+ /.* )J. %(H0%F-cH%&+"& C-&-+ "&
L6#;+()K-+-3?)0 Q&)-*&%)".&%(;.&/-*-&,-.& L*%E"D.H+"+X-+-%*,0"
$%D"+.&" h"+,.&+"&" ’7L3
a%"7" ;0-& 6" ;0.&CY" !"#$34AA=31*.)-.B",+"D-&)"/",%)".& ./
D"/-*-&)"%(G-cH*-++-D H*.)-"&+%++.,"%)-D J")0 H.(-& C-*B"&%)".&
%&D )#E-C*.J)0 *-K-%(+,0%*%,)-*"+)",+./C-*B"&%)-D N67H# -#"+5#
H.(-&3$.(-,#(%*s;-(#(%*1*.)-.B",+":$4% !4A= W45A3
Z.c[Ra32?=23&1"/),!K/#$A-,/+1!1-+-" )0-(%*%& )*--./+%E%03R,.&
N.)" 49$5% !442 W4553
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