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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2012年第2期
收稿日期 : 2011-08-19
基金项目 : 国家自然科学基金项目（30701086）, 河北省自然科学基金项目（C2009001252）
作者简介 : 龙月红 , 女 , 助理实验师 , 研究方向 : 分子生药学 ; E-mail: longyuehongemail@yahoo.com.cn
通讯作者 : 邢朝斌 , E-mail: xingzhaobin@yahoo.com.cn
刺五加鲨烯合酶基因 cDNA 的克隆与序列分析
龙月红 邢朝斌 王明艳 吴鹏 陈龙 梁能松 何闪
（河北联合大学生命科学学院，唐山 063000）
摘 要 : 采用改良的异硫氰酸胍法提取刺五加总 RNA，逆转录为 cDNA，根据已报道的人参鲨烯合酶基因（squalene synthase
gene，SS） cDNA 序列设计引物，利用 RT-PCR 法克隆刺五加 SS 基因的 cDNA 序列。克隆得到长度为 1 258 bp 的刺五加 SS 基因
cDNA 序列，开放阅读框全长 1 248 bp，编码 415 个氨基酸残基，GenBank 登录号为 HQ456918，与人参的 SS1、SS2 和 SS3 氨基酸
序列一致性分别为 91.73%、97.59% 和 96.63%。首次分离并报道了刺五加 SS 基因 cDNA 序列，为刺五加苷生物合成中关键酶的表
达分析及调控机理研究提供参考。
关键词 : 刺五加 鲨烯合酶基因 克隆 RT-PCR
Cloning and Sequence Analysis of Squalene Synthase
Gene in Eleutherococcus senticosus
Long Yuehong Xing Zhaobin Wang Mingyan Wu Peng Chen Long Liang Nengsong He Shan
（College of Life Science，Hebei United University，Tangshan 063000）
Abstract: Totle RNA of E.senticosus was extracted using improved isothiocyanate method, and cDNA was obtained by reverse transcription.
Primers was designed according to cDNA of Panax ginseng SS. SS sequence was colned by RT-PCR. The cloned cDNA sequence of E.senticosus
SS was 1 258 bp, with ORF span 1 248 bp, coding 415 amino acid. Login number of E.senticosus SS for GenBank was HQ456918. The homology
with SS1, SS2 and SS3 of P. ginseng was 91.73%, 97.59% and 96.63%, respectively. We first extracted and reported cDNA sequence of
E.senticosus SS. This study made foundation for key enzyme expression and regulate mechanism analysis in eleutheroside biosynthesis pathway.
Key words: Eleutherococcus senticosus Squalene synthase gene Cloning RT-PCR
刺五加（Eleutherococcus senticosus Harms）是我
国传统的珍贵药用植物［1］，其根、茎、叶均可入药，
有增强免疫功能、抗疲劳、抗衰老、抗菌、抗病毒、
抗辐射、抗应激及抗肿瘤等药理活性［2］。从刺五加
中分离出的刺五加苷属于三萜类化合物，是刺五加
的主要药效成分。三萜类化合物在植物中显示出众
多的结构多样性和生物活性，具有重要的经济价值，
被广泛应用于药物、去垢剂、增甜剂和化妆品等领
域［3］。三萜类化合物均通过依赖甲羟戊酸的类异戊
二烯途径合成，鲨烯和 2,3-氧化鲨烯是其共同的前
体 物 质［4］。 鲨 烯 合 酶（squalene synthase，SS） 催
化类异戊二烯途径的第一步酶促反应，是三萜类化
合物生物合成的关键酶，定位于内质网膜，催化两
分子的法呢酰基二磷酸（farnesyl diphosphate，FPP）
缩合成为一分子鲨烯［5］。SS 基因的过量表达能促进
甾醇和三萜类化合物的大量合成［3］。
克隆 SS 基因是研究三萜类化合物代谢与调控的
基础，目前已从拟南芥［6］、青蒿［7］、人参［5］、甘草［8］
等多种植物中克隆出编码 SS 的 cDNA 序列。为了深
入研究鲨烯合酶在刺五加苷生物合成过程中的作用，
本研究采用 RT-PCR 法克隆刺五加 SS 的 cDNA 序列，
并进行序列分析，为揭示鲨烯合酶在刺五加苷生物
合成中的作用奠定基础。
2012年第2期 113龙月红等 ：刺五加鲨烯合酶基因 cDNA 的克隆与序列分析
1 材料与方法
1.1 材料
供试刺五加采自黑龙江省鸡西市，经河北联合
大学生命科学学院邢朝斌副教授鉴定为五加科植物
刺五加（Eleutherococcus senticosus Harms）。以清水冲
洗杂质，滤纸吸干水分后的叶片为刺五加总 RNA 提
取材料。
RevertAidTM First strand cDNA synthesis Kit（Fer-
mentas）、IPTG、X-gal、异硫氰酸胍、LA Taq DNA 聚
合酶、dNTPs、质粒小提试剂盒购自北京拜尔迪生
物技术有限公司。琼脂糖凝胶 DNA 回收试剂盒、
pGM-T 克隆试剂盒、TOP10 感受态细胞购自天根
生化科技（北京）有限公司，其他试剂均为国产
分析纯。
1.2 方法
1.2.1 总 RNA 的提取 采用改良的异硫氰酸胍法
提取刺五加叶片总 RNA。①称取 0.1 g 叶片和 3 mg
PVP 置于液氮预冷的研钵中，加入液氮研磨成粉末。
②将粉末转移至加入 600 μL 异硫氰酸胍提取缓冲液
（4 mol/L 异硫氰酸胍，25 mmol/L 柠檬酸钠 pH7.0，0.5%
十二烷基肌胺酸钠，用前加 β-巯基乙醇至终浓度
2%）冰上预冷的 1.5 mL 离心管中，震荡混匀。③依
次加入 60 μL 2 mol/L NaAc （pH4.0），600 μL 饱和酚，
120 μL 氯仿 / 异戊醇（24 1），涡旋震荡混匀 3 min，
冰浴 15 min， 4℃，13 000 r/min 离心 30 min。将上清
转移入另一离心管。④加入等体积氯仿 / 异戊醇（24
1）涡旋震荡混匀，4℃，13 000 r/min 离心 10 min。
重复 2 次。⑤吸取上清加入 1/3 体积的 5 mol/L KAc,
混匀，冰浴 15 min，4℃，13 000 r/min 离心 15 min，
取上清。⑥加入 1/10 体积的 3 mol/L NaAc（pH5.2）
和等体积的异丙醇，缓慢混匀。-20℃ 放置 30 min。
4℃，13 000 r/min 离心 15 min。弃上清。⑦沉淀用
70% 乙醇漂洗 2 次，晾干。⑧加入 10 μL DEPC 水溶
解沉淀。-70℃保存。
1.2.2 刺五加 SS 基因的克隆
1.2.2.1 总 RNA 的逆转录 逆转录反应按照 Revert-
AidTM First strand cDNA synthesis Kit（Fermentas） 说
明书进行，逆转录体系 20 μL，其中总 RNA 3 μL，
Oligo（dT）18 引物 1 μL，5 × Buffer 4 μL ；RibolockTM
RNase Inhibitor 1 μL ；10 mmol/L dNTP 2 μL ；Revert-
Aid M-MuLV Reverse Transcriptase 1 μL ；DEPC H2O
8 μL，反应产物保存于 -20℃。
1.2.2.2 PCR 扩 增 据 GenBank 登 录 与 刺 五 加 同
科的人参、三七的 SS 基因序列设计引物，上游引
物 ES1 ：5-TAGAGAGAAAATGGGAAG-3， 下 游 引
物 ES4 ：5-TCACAGGCTATTTGGTAG-3。反应体系
25 μL，其中上下游引物各 1 μL，10×Taq Buffer（含
15 mmol/L MgCl2） 2.5 μL，2.5 mmol/L dNTP 2 μL，模
板 cDNA 1.5 μL，LA Taq 酶 1 μL，补 ddH2O 至 25 μL。
反应程序 ：预变性 94℃，5 min ；变性 94℃ 1 min，
退火 51.5℃ 30 s，延伸 72℃ 1 min，35 个循环 ；72℃
延伸 10 min。取 10 μL 扩增产物在 1.2% 琼脂糖凝胶
上电泳鉴定。
1.2.2.3 PCR 产物回收、克隆及序列测定 PCR 产
物经 1.2% 琼脂糖凝胶电泳后，紫外光下切下目的
条带，按照胶回收试剂盒说明书进行胶的回收纯化
后与 pGM-T Vector 16℃连接过夜，将重组质粒转化
TOP10 感受态细胞。涂布在含 IPTG、X-gal 和 Amp
的 LB 平板上。37℃培养 14 h 左右，随机挑选 10 个
白斑，摇菌培养 10-12 h，用质粒小提试剂盒提取质
粒，PCR 扩增验证为阳性的质粒送 TaKaRa 公司测序，
PCR 条件同上。
1.2.2.4 序列分析的方法 将测序获得的序列通过
DNAMAN6.0 翻译成氨基酸序列，利用 BLAST 搜索
NCBI 上的核苷酸数据库和氨基酸数据库中近缘物种
的 SS 基因序列信息，并进行系统进化分析。通过
DNAMAN6.0 和 ExPASy ProtParam（http://www.expasy.
org/tools/protparam. html）分析推测蛋白质的信息。
系 统 进 化 树 使 用 MEGA 5.05 软 件 中 的 Neighbor-
Joining（邻位相连法，NJ）法建树。
2 结果
2.1 刺五加SS基因的克隆与鉴定
RT-PCR 扩增刺五加各样本的 cDNA 均获得长
度约 1200 bp 的片段（图 1），与预期片段长度相符。
将扩增片段重组入 pGM-T 载体后，PCR 扩增，经琼
脂糖凝胶电泳检测到与刺五加总 RNA 的 RT-PCR 产
物大小相等的片段，说明上述片段已经与载体连接，
SS 基因的 cDNA 已被克隆。
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第2期114
2.2 刺五加SS基因的核苷酸及编码蛋白的分析
测序结果表明，所获得的刺五加 SS 基因 cDNA
长度为 1 258 bp，开放阅读框（ORF）全长 1 248 bp，
推测其共编码 415 个氨基酸残基组成的蛋白质。利
用 Clustal W 进行比对，该片段的氨基酸序列与人
参 的 SS1（AB010148）、SS2（GQ468527） 和 SS3
（GU183406）3 个 SS 的 氨 基 酸 序 列 一 致 性 分 别 为
91.73%、97.59% 和 96.63%。其中与 SS2 仅存在 10
处氨基酸的差异。而与西洋参的 SQS1（AM182456）、
SQS2（AM182457） 和 SQS（GU997681） 的 序 列 一
致性分别为 97.35%、96.39% 和 93.19%，与 SQS1 存
在 11 个氨基酸的不同。说明成功克隆了刺五加 SS
基因的开放阅读框，GenBank 登录号为 HQ456918。
同时在 GenBank 中未查询到刺五加的 SS 基因，因此
本试验首次分离并报道了刺五加的 SS cDNA 克隆。
SS 基因编码蛋白的分子量为 47.0624 kD，理
论等电点为 6.19。该基因编码的氨基酸序列含有
Trans_IPPS_HH 的保守区域，二级结构以 α-螺旋和
无规则卷曲为主。通过 ExPASy 的 Prosite 在线分析
（http://prosite.expasy.org/）发现，该蛋白的 168-183
位和 201-229 位氨基酸为鲨烯合酶和八氢番茄红素
合成酶特异性识别区域。鲨烯合酶具有 3 个保守的
区域，分别为 168-183 位的 YCHYVAGLVGLGLSKL、
202-223 位 的 GLFLQKTNIIRDYLEDINEIPK 和 280-
298 位的 PAIFRFCAIPQIMAIGTLA，这些结构域中
的氨基酸是该酶催化反应所必须的［5］。而其 C 端区
域为疏水序列，具有广泛的多样性，用于锚定在内
质网上［9］。这些区域也同样存在于刺五加的鲨烯合
酶中，而 168-183 和 201-229 区域也是位于鲨烯合
酶的酶活性中心的 2 个保守结构域。
2.3 刺五加SS基因编码蛋白的系统分析
根 据 核 苷 酸 序 列 推 导 出 的 氨 基 酸 与 人 参
Panax ginseng（GQ468527.2），西洋参 P. quinquefolius
（AM182456.1），积雪草 Centella asiatica（AY787628.1），
龙牙楤木 Aralia elata（GU354313.1），三七 P. notoginseng
（DQ186630.1），柴胡 Bupleurum chinense（GQ889268.1），
大 豆 Glycine max（AB007503.1）， 甘 草 Glycyrrhiza
uralensis（HM012844.1），青蒿 Artemisia annua（AY445
506.1），黄芪 Astragalus membranaceus（HQ829974.1），
辣椒 Capsicum annuum（AF124842.1），烟草 Nicotiana
tabacum （U60057.1），番茄 Solanum lycopersicum （GU
075687.1）棉花 Gossypium hirsutum（EF688567.1），拟
南芥 Arabidopsis thaliana（NM_119630.3），玉米 Zea
mays（NM_001111369.1），人 Homo sapiens（NP_004453.3），
褐家鼠 Rattus norvegicus（AAA42179.1），酵母 Schizo
saccharomyces pombe（NP_595363.1）的 SS 氨基酸序
列进行对比分析，建立系统进化树（图 2）。刺五加
的 SS 首先与同为五加科的人参、西洋参聚为同一分
枝，进化距离最近，次之是伞形目的积雪草，再次
之是伞形目的柴胡、龙牙楤木和三七。与其他植物、
动物和人的进化距离依次变远，与传统的分类结果
基本一致。
3 讨论
本试验所克隆出的刺五加 SS 基因与人参、西洋
参、三七、龙牙楤木等植物的 SS 基因序列一致性在
90% 以上，他们均属于三萜类和植物甾醇类化合物
形成的重要调控酶——鲨烯合成酶家族。不同物种
中含有的 SS 基因拷贝数不同，不同植物 SS 基因表
达的组织特性也存在差异［10］。在拟南芥中发现了 6
个 SS 基因的异构型，其中异构型 1-3 编码有功能的
鲨烯合酶，4-6 无催化活性［6］；异构型 SQS1 在所有
组织均有表达，SQS2 主要在叶脉中表达［11］。人参
的 SS 基因存在 3 个异构型，且均具有催化鲨烯合成
的作用，茉莉酸甲酯处理后 SS 基因的 3 个异构型均
不同程度的提高了表达量，但其转录模式不同，异
构 型 PgSS2、PgSS3 的 转 录 物 积 累 位 点 无 变 化，
PgSS1 却由全部器官高表达变为叶柄维管束专一性
高表达［5］。北柴胡中也克隆到了两个氨基酸一致性
为 96% 的 SS 基因［12］。本试验中得到的刺五加 SS
1-3. 刺五加 SS 基因 RT-PCR 产物 ；M.DL2000 Marker
图 1 刺五加 SS 基因 RT-PCR 产物电泳结果
2012年第2期 115龙月红等 ：刺五加鲨烯合酶基因 cDNA 的克隆与序列分析
基因的氨基酸序列与人参 SS2 仅存在 10 个氨基酸
的差别，一致性高达 97.59%。因此初步推断，所
克隆的刺五加 SS 基因应和在人参中偏好于叶、叶
柄中转录的 SS2 为同类的可能性较大，同时本试验
中 mRNA 的取材部位同样也是刺五加的叶片。绿
玉 树［10］（Euphorbia tirucalli L.） 和 北 柴 胡［12］（B.
chinense DC） 的 SS 基 因 中 发 现 在 第 280-298 位 的
PAIFRFCAIPQIMAIGTLA 这个保守的结构域中，有
个别碱基与其他来源的 SS 基因不同，而刺五加 SS
氨基酸的一致性虽然与人参 SS2 最高，但人参 SS2
的第 293 位点氨基酸为丝氨酸，刺五加在该位点与
人参的 SS1、SS3 相同，均为丙氨酸。这些保守位点
存在的差异与催化活性间的关系还有待于进一步研
究。
在植物三萜类化合物生物合成过程中，由于 SS
是竞争利用 FPP 来合成三萜，影响半帖类、二帖类
等物质合成的关键酶［13］，因此 SS 的含量和活性决
定了相关物质的产量。刺五加鲨烯合酶基因的成功
克隆，为后续研究刺五加 SS 基因表达与刺五加苷生
物合成的相互关系和利用生物技术手段提高刺五加
苷含量等研究奠定了基础。
4 结论
首次分离并报道了刺五加的 SS 基因 cDNA 序列。
该基因编码的蛋白中具有鲨烯合酶和八氢番茄红素
合成酶特异性识别区域。刺五加 SS 与五加科其他植
物的 SS 基因序列一致性最高。研究结果为刺五加苷
生物合成中关键酶的表达分析及调控机理研究奠定
了基础。
参 考 文 献
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（责任编辑 李楠）