全 文 ：刺五加叶中黄酮类化合物的分析
陈貌连 宋凤瑞 郭明全 刘志强 刘淑莹＊
(中国科学院长春应用化学研究所 , 长春 130022)
摘 要 利用电喷雾多级串联质谱(ESI-MSn)技术 , 分析了刺五加叶中黄酮类化合物 , 并根据黄酮类化合物的
特征显色反应 ,采用紫外-可见分光光度法 , 对刺五加叶中总黄酮的含量进行了测定。分析结果表明:刺五加
叶含有槲皮素及其相关的黄酮甙类化合物 ,其含量达37.25%。
关键词 刺五加 ,总黄酮 , 电喷雾多级串联质谱
2001-07-20收稿;2002-01-14接受
1 引 言
刺五加(Acanthopanax senticocus(Rupr et Maxim.)Harms)[ 1 ～ 3]系五加科植物 ,是我国北方地区特产常
用药材之一。其根 、根茎(五加参)、叶 、花及果均可入药 。刺五加的各部位均含有黄酮类化合物 ,其叶含
量最高[ 4] 。但对叶中具体组分研究较少 。目前 ,见于文献报道的刺五加叶中黄酮类化合物仅有金丝桃
甙 ,即槲皮素-3-0-半乳糖甙[ 5] 。刺五加中的黄酮类物质具有广泛的药理活性 ,能扩张血管 ,增加冠状动
脉血流量 ,降低心肌耗氧量 ,抗心肌缺血 ,改善心电图 ,抗异位心律 ,降低血压 ,镇静安神[ 6 ,7] 。
本工作利用电喷雾质谱直接监测刺五加叶粗提物经聚酰胺柱层析所得到的各馏份 ,根据质谱信息
确定了总黄酮所在部位 ,并对该部位进行了定性和定量分析 ,得到了总黄酮的组成和纯度 。
2 实验部分
2.1 仪器和设备
美国 Finnigan MAT LCQ 电喷雾质谱仪(Finnigan 公司);瑞士 Sartorius百万分之一电子天平;6010紫
外可见分光光度计(安捷伦上海分析仪器公司);TDL-40D离心机 。
2.2 试剂和材料
芦丁标准溶液:精确称取美国化学公司生产的芦丁标准品 11.63 mg ,用 60%的乙醇溶解后 ,定容于
25 mL 容量瓶中 。5%NaNO2溶液:称取分析纯NaNO2 5 g ,用蒸馏水溶解后定容至 100 mL。10%Al(NO3)3
溶液:称取分析纯Al(NO3)3 10 g ,用蒸馏水溶解后定容至100mL。4%NaOH溶液:称取分析纯NaOH 4 g ,
用蒸馏水溶解后定容至 100 mL。聚酰胺粉的粒径为 0.60 ～ 0.30 mm ,依次用 95%乙醇 ,5%NaOH溶液 ,
蒸馏水 ,10%CH3COOH 溶液 ,蒸馏水洗涤处理至中性 。干燥的刺五加叶:于九月份在吉林省白山地区收
集。
2.3 提取与分离
将干燥的刺五加叶 1 kg研碎 ,用工业乙醇于室温下浸泡一周 ,共提取 3次 ,将提取液合并 ,减压浓
缩 ,离心沉降除去沉淀物 ,然后用石油醚萃取除去色素和其它亲脂性物质。将收集的下层萃取液通过聚
酰胺柱层析 ,依此用 10%、30%、50%、70%和 90%的乙醇梯度洗脱 ,得到相应的 Ⅰ ～ Ⅴ部分。各馏份的
接收均由电喷雾质谱监测 。 Ⅲ部分为待分析的总黄酮部分 。
3 结果与讨论
3.1 质谱分析
电喷雾质谱(electrospray mass spectrometry ,即 ESI-MS)是一种软电离质谱技术 ,它能快速 、直接 、准确
地分析混合物 ,确证已知化合物 ,同时预测新化合物 ,并且所需样品量少。这为分析刺五加叶中的总黄
第 30卷
2002年 6 月
分析化学(FENXI HUAXUE) 研究简报
Chinese Journal of Analytical Chemistry
第 6 期
690～ 694
酮提供了一种可靠且节省人力 、物力的快捷方法。在电喷雾质谱条件下 ,从刺五加叶中分离的黄酮成分
在负离子谱中丰度较大 ,这可能是因为这类化合物羟基较多 ,电负性较大的缘故 。从聚酰胺柱上得到的
30%、50%和 70%乙醇梯度馏份的电喷雾全扫描负离子谱图分别示于图 1 、图 2和图 3。图 2中标有 A 、
B 、C 、D的 4种化合物为从刺五加叶中发现的黄酮类化合物。其中化合物 C 为人们已知的金丝桃甙(分
子量为464 , m/z 463为[M-H] -离子)。该化合物脱去一个半乳糖基后 ,生成 m/z 301离子 ,证明其甙
元为槲皮素(分子量为 302 , m/z 301为[M-H] -离子)。图 1和图 2中没有出现 A 、B 、C和 D这 4个化
合物。这说明 50%乙醇能有效地将刺五加叶中总黄酮从聚酰胺柱上洗脱下来 。对化合物A 、B 、C 和 D
进行多级串联质谱分析 ,得到的结果如表1所示 。发现 4种化合物的甙元均是以分子量为 302的槲皮
素(该 4种化合物的具体结构在另一篇文章中报道)。
图 1 30%乙醇梯度馏份的全扫描电喷雾质谱负谱图
Fig.1 Negative full scan electrospray(ESI)mass spectra of eluate obtained at 30% EtOH-H2O gradient
图 2 50%乙醇梯度馏份的全扫描电喷雾质谱负谱图
Fig.2 Negative full scan ESI mass spectra of eluate obtained at 50% EtOH-H2O gradient
该总黄酮部分酸性水解(见 3.2)产物经萃取后所测得的电喷雾质谱图如图 4所示。由于槲皮素及
其甙类化合物在酸性环境中发生了质子化 ,所以出现在正离子谱中 。比较图 2和图 4 ,很容易发现化合
物B和 D的谱峰消失了 ,化合物 C(分子量为464 , m/z 465为[M+H] +离子)的丰度明显降低 ,而化合物
A(分子量为 302 , m/z 303为[ M+H] +离子)的丰度明显增大。综合以上串联质谱分析结果 ,说明化合
691第 6期 陈貌连等:刺五加叶中黄酮类化合物的分析
图 3 70%乙醇梯度馏份的全扫描电喷雾质谱负谱图
Fig.3 Negative full scan ESI mass spectra of eluate obtained at 70% EtOH-H2O gradient
物A为槲皮素 ,化合物 B 、C 、D为以槲皮素为甙元的黄酮甙类 ,它们经酸水解生成槲皮素甙元。图 4中 ,
我们还观察到 m/ z 383.1和 m/z 263.3 ,它们可能是杂质峰。
表 1 化合物 A、B 、C 和 D的 ESI-MSn数据
Table 1 Elecrospray tandem-mass spectrometric data of compounds A , B , C and D
化合物
Compound
[ M-H] - MSn 数据
MSn data of compound
化合物
Compound
[M-H] - MSn 数据
MS n data of compound
化合物 A Compound A 301 MS2 272 、257、179 、151 化合物 C Compound C 463
MS2
-162 301
MS3
273 , 257 、179 、151
化合物 B Compound B 447 MS2-146 301
MS3
273 、257、179 、151 化合物 D Compound D 609 MS2-308 301
MS3
273、257 、179 、151
图 4 刺五加叶中总黄酮酸水解产物的电喷雾质谱图
Fig.4 ESI mass spectra of the products of acid hydrolysis of total flavonoids obtained from leaves of
Acanthopanax Senticosus Harms
3.2 定性分析
50%乙醇洗脱的馏份 III经浓缩并烘干 ,得到深黄色固体 。该固体在水中溶解度很小 。为了进一步
证实该部分为黄酮类化合物 ,我们进行了如下定性分析实验:
(1)取少量样品溶于 60%乙醇 ,加入几滴0.1 mol/L NaOH ,溶液立即呈现黄色;久置于空气中 ,溶液
变为棕色 。
(2)取少量样品溶于 60%乙醇 ,滴入几滴浓盐酸 ,再加入少量镁粉 ,置水浴上加热数分钟 ,呈樱红
色。
(3)取少量样品溶于 60%乙醇 ,加入 1滴 10%Al(NO3)3溶液 ,溶液呈黄色;但当 NaNO2 和Al(NO3)3
存在 ,在NaOH 碱性溶液中 ,则呈红色。该溶液在 500 nm处有最大吸收 。
692 分 析 化 学 第 30卷
(4)取少量样品溶于 60%乙醇 ,在紫外区全波长扫描 ,观察到两个吸收带 ,带 I 位于 300 ～ 400 nm ,
带Ⅱ位于 254 ～ 334 nm。
(5)酸水解实验:取样品溶于适量 60%乙醇中 ,加入 5%H2SO4后于沸水浴上加热 15 min ,然后用乙
酸乙酯萃取 ,再用电喷雾质谱检测萃取液 ,所得到的电喷雾质谱图如图4所示。
所得到的以上定性分析实验结果与黄酮醇类性质相符合 ,进一步证明从聚酰胺柱上得到的 50%乙
醇梯度馏份为总黄酮部分 。
3.3 定量分析
3.3.1 标准曲线的绘制 取芦丁标准液0.00 、0.20 、0.40 、0.60 、0.80和 1.00 mL分别放入 1 ～ 6号容量
瓶中 ,分别加入 0.2 mL 5%NaNO2 ,摇匀 ,静置 6min;再分别加入0.2 mL 10%Al(NO3)3 ,摇匀 ,静置 6min ,
再分别加入 1mL 4%NaOH ,用60%乙醇定容至刻度 ,摇匀 ,静置15 min ,然后于 500 nm下测吸光度 ,得到
标准曲线 A=10.507992C+0.0227 ,相关系数 r=0.9998 ,在 0.0093 ～ 0.0465 g/L 范围内呈良好的线性
关系 。
3.3.2 样品的测定 精确称取馏份Ⅲ样品 21.55 mg ,用 60%乙醇溶解后 ,定容于 100 mL容量瓶中 。精
确移取该样品液1 mL ,按绘制标准曲线的方法 ,并以试剂空白为参照 ,在 500 nm处测其吸光度为 0.403。
根据标准曲线查得浓度为 0.0161 g/L;计算得总黄酮含量为 37.25%。
3.3.3 显色稳定性实验 取样品液按前述操作测其在一定时间间隔下的吸光度 ,结果(见表 2)表明:显
色在半小时内较稳定 ,但随着时间的延长 ,所测吸光度偏差越来越大 。
表 2 显色稳定性试验结果(单位:吸光值)
Table 2 The stability test by the colorimetry(unit:absorbance)
5 min 10 min 20min 30 min 40 min 50 min 60min 70 min 80 min
样品 Sample 0.403 0.403 0.402 0.402 0.401 0.400 0.396 0.398 0.302
3.3.4 回收实验 取样品液 5份 ,分别添加适量芦丁标准品 ,按前述方法操作 ,测得结果列于表 3。
表 3 标准加入回收实验
Table 3 Recovery of standard addition
样 品
Sample
总黄酮含量
Content(μg)
加标量
Added(μg)
测得加标后总黄酮量
Found(μg)
回收率
Recovery(%)
平均回收率
Average recovery(%)
1 16.1 18.6 34.8 100.5
2 16.1 18.6 35.0 101.6
3 16.1 18.6 34.9 101.1 100.8
4 16.1 18.6 34.6 99.5
5 16.1 18.6 34.9 101.1
上述实验和结果表明:聚酰胺树脂分离刺五加叶中总黄酮(含游离酚羟基的黄酮及其甙类)效果好 ,
同时因聚酰胺树脂吸附了干扰比色测定的其它多元酚和色素 ,使利用紫外分光光度法所测得的总黄酮
含量结果是比较真实可靠的。
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Analysis of Flavonoids from Leaves of Acanthopanax Senticosus Harms
ChenMaolian , Song Fengrui , Guo Mingquan , Liu Zhiqiang , Liu Shuying＊
(Changchun Institute of Applied Chemistry , Chinese Academy of Sciences , Changchun 130022)
Abstract Using electrospray tandem mass spectrometry (ESI-MSn), the flavonoids obtained from leaves in
Acanthopanax Senticosus Harms were analyzed.The typical colorimetric method and the ultroviolet
spectrophotometry were also utilized for the determination of the content of total flavonoids.The analytical results
showed that there was quercetin as well as its derivatives in leaves of acanthopanax senticosus harms and their
content was as high as 37.25%.
Keywords Acanthopanax senticosus harm , total flavonoids , electrospray tandem mass spectrometry
(Received 20 July 2001;accepted 14 January 2002)
关于召开第十届全国稀土分析化学学术报告会的征文通知
(第一轮)
为进一步交流稀土分析及其稀土产品分离 、制备等相关领域的工作经验 , 提高学术水平 , 促进稀土元素分析方法及
稀土应用技术 ,更好地为我国市场经济建设服务 , 受中国稀土学会委托 , 江西省分析测试中心将于 2003年秋在江西井冈
山承办第十届全国稀土元素分析化学学术报告会。热忱欢迎中科院 、高教 、地质 、冶金 、机械 、航空 、有色 、电子 、生化 、化
工 、环保 、商检 、医药和农业等领域的科研人员 , 踊跃投稿并参加本次大会。现将具体有关事宜通知如下:
(一)征文范围
凡是有关稀土分析及其稀土产品制备等相关领域的新理论 、新技术 、新方法 、新仪器等方面的论文都可以提交大会 ,
但已在全国性会议交流或已在国内外各种刊物上发表的论文除外。
(二)征文要求
论文应突出工作的创新性 、前詹性和针对性 , 文字表达简练 、准确 ,包括图表在内 , 字数应控制在 1500 字以内。其写
作格式应与《分析化学》投稿须知相吻合。论文以Word文字处理系统编排并以 A4纸方式输出 ,随同 3.5 寸软盘一并寄
给组委会。所寄论文请作者所在单位进行保密审查 ,并加盖单位公章。来信请注明作者姓名 、职务 、职称 、单位及详细通
讯地址(包括 Email地址), 以便后几轮通知的的准确送达。截稿日期:2003年 5 月 1日。
(三)论文投递
请论文作者按以下地址邮寄稿件及软盘(信封注明:会议征文)。
地址:江西省南昌市北京东路 171 号 单位:江西省分析测试中心 邮编:330029
联系人:易永 、姜玉梅 电话:0971-8333761 Email:tongdongl@163.net
本次大会热烈欢迎国内外与稀土元素 、元素分析及应用有关的仪器生产公司和厂家到会介绍和展出产品 , 具体事宜
请与联系人联系。其它有关会议具体事宜 ,详见第二轮通知。
第十届全国稀土分析化学学术报告会筹备组
江西省分析测试中心
694 分 析 化 学 第 30卷