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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2013年第4期
高效、低毒、低残留的微生物农药已取得显著
的生态和社会效益，在农业生产中具有巨大的经济
价值。已有研究报道，众多生防细菌在其生长发育
过程中会产生许多拮抗性或者竞争性的代谢产物（包
括多种抗生素类，酶类，挥发类成分），具有阻碍或
者杀死病原菌的效果，生防效果极佳［1，2］。因此，
从生防细菌中寻找农用活性的抗菌物质有着极为广
阔的应用前景。
溶杆菌属（Lysobacter）细菌首次于 1973 年报道，
收稿日期 ：2012-10-16
基金项目 ： 国家自然科学基金项目（31101481），中央高校基本科研业务费专项资金（GK200902032），2012 年度陕西师范大学实验技术研
究立项项目（SYJS201213），陕西师范大学青年项目（201001005），陕西师范大学 2011 年校级大学生创新实验计划项目（cx11072）
作者简介 ：王斐斐，女，硕士，研究方向 ：微生物蛋白质组学 ；E-mail ：wangfeifei488@163.com
通讯作者 ：崔浪军，男，副教授，硕士生导师，研究方向 ：药用植物内生菌的开发与利用 ；E-mail ：ljcui@snnu.edu.cn
溶杆菌属 Lysobacter yanansis sp. nov. 胞内外蛋白
双向电泳条件优化及图谱建立
王斐斐  武坤毅  郭玲  崔浪军  任靖
（陕西师范大学生命科学学院 陕西师范大学药用植物资源与天然药物化学教育部重点实验室，西安 710062）
摘 要： 通过对溶杆菌属细菌 Lysobacter yanansis sp. nov. 胞外蛋白上样量和聚焦程序两个方面进行双向凝胶电泳条件的优化，
分析了其对溶杆菌 Lysobacter yanansis sp. nov. 胞外分泌蛋白的双向凝胶电泳图谱的影响。结果表明，150 μg 的上样量和聚焦程序Ⅱ
获得的双向电泳图谱蛋白点数较多且清晰。同时，建立了溶杆菌属细菌 Lysobacter yanansis sp. nov. 胞外和胞内蛋白双向电泳图谱，
经过硝酸银染色和 PDQuest 图像分析检测到了 100 种胞外蛋白和 204 种胞内蛋白。
关键词 ： 溶杆菌属 双向电泳 生物防治
Optimization and Construction of the Intracellular and Extracellular
Proteomic Map of Lysobacter yanansis sp. nov.
Wang Feifei Wu Kunyi Guo Ling Cui Langjun Ren Jing
（Key Laboratory of Medicinal Plant Resources and Natural Pharmaceutical Chemistry（Ministry of Education），School of Life Sciences，
Shaanxi Normal University，Xi’an 710062）
Abstract:  In this study, we separated the extracellular protein excreted by Lysobacter yanansis sp. nov. through the two-dimensional
（2-D）electrophoresis, and analyzed the effect of isoelectric focusing programs and loading volumes on 2-D proteomic maps. The results showed
that a clearly 2-DE map was obtained when the 150 μg loading volumes and isoelectric focusing programs Ⅱ were used. Furthermore, 2-D
proteomic maps of extract intracellular and extracellular protein from Lysobacter yanansis sp. nov. were constructed. The separated protein spots
in gels were analyzed by PDQuest. 100 spots of extracellular proteins and about 204 spots of intracellular proteins had been separated by 2-DE.
Key words:  Lysobacter Two-dimensional electrophoresis（2-DE） Biodefence
1978 年命名［3］，广泛存在于水体、土壤和海绵中，
具有良好的定殖活性，对许多植物病原菌、水藻以
及线虫等都有很强的拮抗作用，是一类具有极大生
防潜力的生防菌［4］。目前已知的溶杆菌属细菌共 23
种，其中一些菌株如 3.1T8、C3 和 SB-K88 等已在防
治小麦赤霉病、水稻白叶枯病等多种病害上取得良
好效果。但目前溶杆菌属细菌已知的胞外抗菌物质
只有几丁质酶、热稳定抗真菌因子（HSAF）等少数
几种，其他的尚不清楚［3-6］。
2013年第4期 141王斐斐等 ：溶杆菌属 Lysobacter yanansis sp. nov. 胞内外蛋白双向电泳条件优化及图谱建立
本实验室从药用植物远志根部筛选获得一株
具有广谱抗菌活性的细菌，经鉴定为溶杆菌属细菌
新 菌 株， 命 名 为 Lysobacter yanansis sp. nov.（NCBI
JF445288.1），菌株类型为 SNNU 513T。研究表明该
菌株胞外抗菌物主要是蛋白类物质，其胞外分泌蛋
白对核果炭疽杆菌、烟草灰霉菌等多种植物病原菌
的生长均有强烈的抑制作用［7］。在蛋白质组学研究
领域，双向电泳技术以其高溶解度、灵敏度和重复
性成为了一种蛋白复合物模式化分离并可视化的有
力工具［8］。
本研究以该菌株为材料，在优化双向电泳条件
的基础上，建立胞内、胞外蛋白双向电泳图谱，旨
在为进一步明确该菌株胞外抑菌蛋白，寻找具有巨
大应用潜力的生防因子奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌种 本实验室低温冰箱保存溶杆菌菌种
Lysobacter yanansis sp. nov.。
1.1.2 试剂 丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、十二烷
基硫酸钠、三羟甲基氨基乙烷、四甲基乙二胺、过
硫酸胺、二硫苏糖醇、二甲氨基丙磺酸、碘代乙酰胺、
硫脲、尿素均为 GE 公司产品。乙醇、冰醋酸、甘
氨酸均为国产分析纯。矿物油、固相 pH 梯度线性
干胶条（IPG dry strip pH3-10 L，17 cm）及 Bio-Lyte
3/10 均 购 自 Bio-Rad 公 司。 所 有 缓 冲 溶 液 均 采 用
Milli-Q 水配制。
1.1.3 仪 器 Bio-Rad 公 司 凝 胶 双 向 电 泳 配 套
系 统 ：等 电 仪（Protean IEF cell）， 垂 直 电 泳 仪
（Protean II）；UMAX 投射扫描仪，图像分析软件为
PDQuest7.0，Eppendorf 低温高速离心机，BioTek 超
微量微孔板分光光度计。
1.2 方法
1.2.1 细菌培养及胞外蛋白提取时间的确定 将
Lysobacter yanansis sp. nov. 单菌落接种于 250 mL LB
液体培养基中，180 r/min，30℃摇床震荡培养，每
隔 12 h 测定培养液的吸光值，绘制细菌生长曲线图。
1.2.2 胞外分泌蛋白的抑菌试验 12 000 r/min，4℃
离心细菌悬液 20 min，收集上清液，按 1∶5 的比
例加入预冷丙酮，摇匀后置于 -20℃冰箱保存 4 h，
10 000 r/min 4 ℃ 离 心 20 min， 收 集 沉 淀 蛋 白， 用
GENEray 公司的 BCA 法蛋白定量试剂盒对蛋白进行
定量测定。采用 PDA 平板对峙打孔法，测定该蛋白
类物质对核果炭疽杆菌、烟草灰霉菌等多种植物病
原菌的生长抑制作用。
1.2.3 聚丙烯酰胺凝胶垂直电泳制备分离以及产物
的活性检测 分离胶浓度为 12%，浓缩胶浓度为 4%，
将 30 mg/mL 部分纯化的抑菌活性物质与变性上样缓
冲液等体积混合后上样，用 Tris-Gly 电泳缓冲液电泳，
浓缩胶 10 mA，分离胶 20 mA。电泳完毕后取出胶板，
用考马斯亮蓝 R-250 染色后，进行脱色至出现清晰
蓝色电泳蛋白质条带。分离胶浓度为 12%，浓缩胶
浓度为 4%，300 mg/mL 的上样量。在相应的位点切
去条带，在离心管中破碎处理，加入 100 μL 的 PBS
缓冲液，按分子量从高到低依次加入到孔中，培养
24 h，观察其抑菌活性。
1.2.4 双向电泳蛋白样品的制备及定量
1.2.4.1 胞外分泌蛋白 12 000 r/min，4℃离心细菌
悬液 20 min，收集上清液，用 10% TCA 低温处理上
清液 1 h 后，10 000 r/min 4℃离心 20 min，用预冷的
丙酮反复数次洗去残留 TCA，待丙酮挥发掉后，溶
解于水化上样缓冲液（7 mol/L 尿素，2 mol/L 硫脲，
4% CHAPS，1% DTT，0.5% Bio-Lyte 3/10， 痕 量 溴
酚蓝），-80℃冰箱保存。用 GENEray 公司的 BCA 法
蛋白定量试剂盒对蛋白进行定量测定。
1.2.4.2 胞内蛋白 将离心收集到得溶杆菌细胞用
PBS 缓冲液清洗 3 次，后重悬浮于 1 mL 的 SDS 缓冲
液 中（1% SDS，0.1 mol/L Tris-HCl，pH7.0），600 w
超声处理 6 min，然后沸水浴加热 5 min，等温度降
下来后加入增溶剂（7 mol/L 尿素，2 mol/L 硫脲，4%
CHAPS，1% DTT，0.5% Bio-Lyte），充分震荡溶解，
12 000 r/min，4℃离心 20 min，取上清 -80℃冰箱保
存［10］。用 GENEray 公司的 BCA 法蛋白定量试剂盒
对蛋白进行定量测定。
1.2.5 双向凝胶电泳 操作过程按照 Bio-Rad 双向
凝胶电泳仪操作手册进行。
1.2.5.1 上样量的优化 取 3 份胞外分泌蛋白样品
（蛋白含量分别为 100、150 和 200 μg）与一定量的
水化上样液充分混合，使得最终上样总体积为 500
μL，均匀加样于聚焦槽内，撕掉 IPG 胶条的一端，
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第4期142
轻轻覆盖胶条胶面在水化液上，清除气泡，在每个
胶条上覆盖 2 mL 的矿物油。
1.2.5.2 聚焦程序的优化 聚焦结束后，将 IPG 胶条
转移到溶胀盘中，加入胶条平衡缓冲液Ⅰ（6 mol/L
表 1 等电聚焦程序
尿素，2% SDS，0.375 mol/L pH8.8 Tris-HCl，20% 甘
油，0.02 g/mL DTT）充分平衡 15 min，再转移胶条
至新的溶胀盘，加入平衡缓冲液Ⅱ（6 mol/L 尿素，2%
SDS，0.375 mol/L pH8.8 Tris-HCl，20% 甘 油，0.025
g/mL 碘乙酰胺）平衡 15 min。将平衡好的 IPG 胶条
置于聚丙烯酰胺凝胶（凝胶浓度分别为 10%）顶端，
加入封胶液（琼脂糖 0.5%，Tris 25 mmol/L，甘氨酸
192 mmol/L，SDS 0.1%，微量溴酚蓝），进行第二向
SDS-PAGE 电 泳， 电 泳 程 序 为 5 mA/gel 30 min，20
mA/gel 5 h。
在相同试验条件及参数设置情况下 3 次重复双
向电泳图谱非常相近。
1.2.6 凝胶染色与图像扫描软件分析 采用 Bio-Rad
公司的硝酸银染色试剂盒进行凝胶染色，用扫描仪
扫描获取染色后凝胶图像，TIF 文件格式保存，采
用 PDquest 7.0（Bio-Rad）进行图像分析。每个处理
条件下 3 次重复试验的凝胶图像经自动采点和匹配。
2 结果
2.1 胞外分泌蛋白提取时间的确定
细菌生长曲线（图 1）显示，经过 4 d 的震荡培
养，此时菌处于稳定生长期后期，适于提取胞外的
蛋白。
2.2 胞外分泌蛋白的抑菌试验
通过丙酮沉淀得到的蛋白浓度为 2.1 mg/mL，每
个孔中加入 100 μL 蛋白液，结果（图 2）显示，核
果炭疽菌与烟草灰霉菌的生长受到了明显抑制，说
明该菌分泌的蛋白类物质有比较显著的抑菌作用。
2.5
1.5
0.5
1.0
2.0
0
0 20 40 60 80 100 120 140
ᰦ䰤K
O
D
60
0
图 1 Lysobacter yanansis sp. nov. 在生长过程中
菌液浓度变化曲线
A B
A ：胞外分泌蛋白对核果炭疽的抑菌图 ；B ：胞外分泌蛋白对
烟草灰霉菌的抑菌图
图 2 胞外分泌蛋白对植物病原菌的抑菌图
2.3 聚丙烯酰胺凝胶垂直电泳制备分离以及产物
的活性检测
检测结果（图 3-A）表明，胞外蛋白质的分子
量主要在 10-116 kD 范围内，属于低分子量的蛋白
质。在 14 kD 以下出现了高丰度的低分子量蛋白质。
经 SDS-PAGE 分离后，将其中的活性成分按分子量
从高到低依次进行抑菌活性检测，结果（图 3-B）
显示，有 3 个条带的蛋白质有很强的活性，活性最
等点聚焦程序 I 等点聚焦程序 II
步骤 电压（V） 升压模式 时间（h） 步骤 电压（V） 升压模式 时间（h）
S1 50 16 S1 50 16
S2 250 线性 0.5 S2 150 线性 0.5
S3 1000 快速 4 S3 500 快速 2
S4 10000 线性 5 S4 1000 快速 2
S5 10000 快速 60000 V·h S5 10000 线性 5
S6 500 快速 任意时间 S6 10000 快速 60000 V·h
S7 500 快速 任意时间
2013年第4期 143王斐斐等 ：溶杆菌属 Lysobacter yanansis sp. nov. 胞内外蛋白双向电泳条件优化及图谱建立
高的成分主要为 14 kD 的低分子量蛋白质。 点横向拖尾比较严重，部分蛋白质点分布集中。而
在聚焦程序Ⅱ可以达到最终预设的 10 000 V 的电压，
使蛋白质被充分聚焦，得到的电泳图谱点数较多，
且分辨率很高。经 PDQuest7.0 软件分析，程序Ⅰ得
到的凝胶图谱中蛋白点数为 76，程序Ⅱ得到的凝胶
图谱中的蛋白点数为 100 个，调整程序后的图谱中
蛋白点聚焦更完全，得到有效的分离，图谱清晰无
明显横纵条纹（图 5）。
kD
M
116.0
66.2
45.0
35.0
25.0
18.4
14.4
BA
图 3 分离活性物质的聚丙烯酰胺凝胶垂直电泳检测（A）
及其琼脂扩散检测（B）
2.4 胞外蛋白上样量的优化
图 4 为不同上样量条件下得到的凝胶图谱。经
PDQuest 7.0 软件分析得知，上样量为 100 μg 的凝胶
图谱蛋白点有 35 个，低丰度蛋白检出较少，上样量
为 150 μg 的凝胶图谱检出蛋白较多且图谱清晰，点
数为 79 个，上样量为 200 μg 的凝胶图谱蛋白点有
85 个，有明显的拖尾现象，且分辨率较上样量为
150 μg 的更低，综合考虑 150 μg 是最佳上样量。
SD
S-
PA
G
E
3 10pH
a b c
a：胞外蛋白上样量为 100 μg 的图谱；b：胞外蛋白上样量为 150 μg 的图谱；
c ：胞外蛋白上样量为 200 μg 的图谱
图 4 不同上样量得到的胞外蛋白图谱
SD
S-
PA
G
E
3 10pH
a b
a ：聚焦程序Ⅰ下的电泳图谱 ；b ：为聚焦程序Ⅱ下的电泳图谱
图 5 不同聚焦程序得到的胞外蛋白图谱
对凝胶图谱上有代表性的区域进行放大分析，
三维图谱分析（图 6）显示，聚焦程序Ⅰ下得到的
凝胶图谱，一些高丰度蛋白点过大，交叉重叠，掩
盖了一些低丰度蛋白的显示，部分蛋白质点模糊，
斑点弥散，形态较差，甚至还有一些纹理聚集形成
斑点串，出现横纹或纵纹及图谱扭曲等影响图谱质
量的问题。此为聚焦时间过长或者不足而产生的现
象。而在程序Ⅱ下分离得到的图谱，蛋白峰较多且
清晰，且峰形较好，分布均匀，背景干扰较小，分
辨率较高，且经过多次重复试验比较，蛋白峰不
仅形状比较规则，而且没有明显的横纹现象，表
明聚焦时间比较合适，解决了蛋白密集难分开等
问题。
2.6 胞内蛋白和胞外蛋白图谱建立
分别取胞内和胞外蛋白 150 μg，采用等点聚
焦程序Ⅱ进行双向电泳。图 7 显示，与单向 SDS-
PAGE 电泳无法实现蛋白的分离相比，双向凝胶电
泳能达到较好的分离效果，得到较多的蛋白，且蛋
白点清晰，无明显拖尾。凝胶图谱经 PDQuest7.0 软
件分析，胞内蛋白图谱检测出 204 个点，胞外蛋白
2.5 胞外蛋白聚焦程序的优化
在 150 μg 上样量的前提下，程序 I 中聚集电压
无法最终达到预设值，且得到的凝胶图谱中蛋白质
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第4期144
图谱检测出 100 个点，经过背景消减处理后，将胞
内蛋白丙烯酰胺胶作为参考进行匹配，匹配点数为
21 个，匹配率为 10%。从图 7 看出，胞内与胞外蛋
白点都比较集中，主要分布在胶条的酸性端，且在
胞内蛋白的电泳图谱中，酸性端有横向条带的产生，
说明胞内存在极端酸性蛋白。
3 讨论
样品制备和溶解是双向电泳高分辨率和高重复
性的基础步骤。由于不同生物、甚至同一生物不同
组织细胞的蛋白质组在构成上差异极大，迄今为止
没有一套有效的能适应于不同生物的蛋白质样品制
备方法。蛋白质的种类众多，数量巨大，任何一种
方法都不可能将某种生物组织或者细胞的所有蛋白
质全部提取出来［10］。我们采用 TCA 丙酮法提取沉
淀胞外蛋白，虽然会丢失一些蛋白点，但是该方法
得到的蛋白纯度较高，能够很好地除去核酸、脂类
等大分子，关键是能够有效除去严重影响等点聚焦
的一些盐离子，从而获得高分辨率的电泳图谱［10］。
蛋白质裂解液的组成主要有变性剂、去垢剂、
还原剂和两性电解质。这些成分促进蛋白质变性、
解聚、还原、溶解，因此样品缓冲液中这些组分和
含量的变化会显著影响 2-DE 的结果。尿素是最常用
的非离子变性剂，但是高浓度的尿素会引起 pH 的
A E C G
a e c g
B F D H
b f d h
A-D ：在程序Ⅰ下的有代表性的点的放大图，a-d ：相对应的三维图 ；E-H ：相对应的点在程序Ⅱ下的放大图，e-h ：对应的三维图
图 6 不同聚焦程序下图谱的局部图
SD
S-
PA
G
E
3 10pH
SD
S-
PA
G
E
3 10pH
a b
a ：胞内蛋白图谱 ；b ：胞外分泌蛋白图谱
图 7 胞内蛋白和胞外蛋白的电泳图谱
2013年第4期 145王斐斐等 ：溶杆菌属 Lysobacter yanansis sp. nov. 胞内外蛋白双向电泳条件优化及图谱建立
变化，进而影响聚焦的等电点［10］。硫脲能够提升疏
水膜蛋白的溶解性［11，12］，硫脲的 pH 值在 8.5-9.0，
这与平衡液的 pH 值（8.8）相近，硫脲的硫原子与
半胱氨酸的 -SH 基会发生还原反应。因此，在完成
蛋白的烷基化（烷基化有效抑制蛋白的氨甲酰化）
后，硫脲可以较好地清除平衡液中的碘乙酰胺［13］。
通常多采用 2 mol/L 硫脲与 5-7 mol/L 的尿素结合使
用。已有的报道表明，蛋白溶解度的降低和硫脲浓
度的增加相关，蛋白分辨率的降低有可能与蛋白由
一向至二向转移时，硫脲抑制了 SDS 蛋白的结合或
者提升了脂类的溶解性［14］，所以使用硫脲后胶条
一定要充分平衡才可以进行二向电泳［15］。本试验
采用 7 mol/L 尿素和 2 mol/L 硫脲组成的上样缓冲液
来溶解蛋白质，得到了比较清晰、分辨率较高的双
向凝胶电泳图谱，证实了尿素和硫脲的结合是比较
理想的缓冲液组合。SDS 是阴离子去污剂，难与强
酸性蛋白结合，因此这种蛋白最好选用阳离子去污
剂［14］，非离子去污剂，如 Tween80，Triton X-100，
Zwitterionic 去污剂，CHAPS 已经被证实能够非常有
效地提高溶解性［10］，被广泛使用于 2-DE 中。
在进行等点聚焦电泳时，蛋白的上样量至关重
要，蛋白上样量不足时，会导致低丰度蛋白的丢失，
而上样量过多会导致高丰度蛋白聚集产生的横条纹，
降低分辨率［20］。制约上样量的因素有两个 ：一是染
色方法，银染法上样量通常在 100-300 μg（硝酸银
染色能够检测到 120-300 pg/mm2 的蛋白）［16］；二是
IPG 胶条，IPG 胶条的 pH 值范围越大，上样量越少，
pH3-10 的 IPG 胶条上样量往往在 100-200 μg［17-19］。
本试验选取 100、150 和 200 μg 三个上样量，综合
考虑结果中分辨率和凝胶图谱上蛋白点的数量，选
定 150 μg 上样量为最佳上样量。一般来说，凝胶的
承载量跟蛋白的组成数量有关，蛋白越少，凝胶的
溶解性越好，但是检测要求增加蛋白的上样量，使
达到最低可见度，蛋白点的丢失（特别是疏水性蛋
白和分子量大于 100 kD 的蛋白）是限制双向电泳的
一个重要因素［19］。提高样品的上样量有助于低丰度
蛋白的检出。随着蛋白量的加大，高丰度蛋白点过
大，蛋白质聚集或沉淀，导致点的变形，位置变化，
甚至是选择性的丢失，这对于分离的影响不是很大，
但是会使得难以确认正确的蛋白点位置，正确的蛋
白点位置的确认需要更加精确的凝胶匹配方法和准
确的分子定量［19］。
第一向等电聚焦直接影响到 2-DE 图谱的质量，
在聚焦过程中发现，等电聚焦时间不够时，蛋白质
没有被完全聚焦，双向电泳图谱呈现水平条带状，
而过度聚焦会因为活性水转运而导致过多的水在
IPG 胶表面渗出而引起蛋白图谱变性，同样产生水
平拖尾并且可能会导致部分蛋白质点丢失。蛋白样
品和提取缓冲液中的盐离子与杂质会负载电流，阻
碍聚焦电压的上升，导致聚焦的失败［21，22］。因此，
本试验采用延长低压除盐的方法，其中 S3 的除盐
时间延长为 4 h，并且降低聚焦起始电压以减少盐离
子对等电聚焦的影响，使得电压在设定时间内达到
10 000 V，聚焦充分，改进程序后的图谱蛋白点清晰，
分辨率较高。
电泳图谱显示，胞外蛋白点数目和种类比较丰
富，并且有 10% 的胞外蛋白的等电点与分子量很接
近 于 一 些 胞 内 蛋 白，Nandakumar 等［23］ 在 2006 年
曾经提出的胞外蛋白不仅仅包括细胞分泌的蛋白质，
还有可能包括细胞壁的脱落物［24］。相比单向电泳图
谱，双向电泳分离出来的蛋白质远远地高出了单向
图谱，这表明了双向电泳在蛋白质分离方面的巨大
优势［25-27］。
4 结论
本研究从样品上样量和聚焦程序两个方面分析
了其对溶杆菌 Lysobacter yanansis sp. nov. 胞外分泌蛋
白的双向凝胶电泳的影响，结果表明，150 μg 的上
样量和聚焦程序Ⅱ获得的双向电泳图谱蛋白点数较
多且清晰，在建立胞外分泌蛋白电泳图谱的同时建
立了胞内蛋白的电泳图谱。
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（责任编辑 马鑫）