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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2014年第3期
磷脂酰肌醇蛋白聚糖是硫酸乙酰肝素糖蛋白中
的一个家族，参与调控个体发育、细胞增殖和分化
等过程。其中，磷脂酰肌醇蛋白聚糖 3（Glypican-3，
GPC3）是 1996 年 Pillia 等［1］在研究 Simpson-Golabi-
Behmel 综合症（SGBS）时，从人胚胎 cDNA 文库中
首次克隆。GPC3 基因定位于人染色体 Xq26［2，3］，
结构全长大于 900 kb，是人类最大的基因之一。其 5
端朝向端粒区，3 端朝向中心粒区，由 8 个外显子
和 7 个内含子组成。启动子区有许多转录因子结合
位点。 cDNA 序列全长为 2 263 bp，1 740 bp 的开放
阅读框编码 580 个氨基酸，分子量为 66 kD 左右。
Glypican-3 的结构具有 Glypican 家族的共同特
收稿日期 ： 2013-08-29
基金项目 ：河北省科学院科技攻关项目（13335）
作者简介 ：程华，男，副研究员，硕士，研究方向 ：肿瘤早期诊断 ；E-mail ：cheng_hua@sina.com
磷脂酰肌醇蛋白聚糖 3 的原核表达及单克隆抗体制备
程华1  方向东2  吴萌1  史蕾3  崔硕1
（1. 河北省科学院生物研究所，石家庄 050081 ；2. 中国科学院北京基因组研究所，北京 100101 ；
3. 河北师范大学生命科学学院，石家庄 050000）
摘 要 ： 人磷脂酰肌醇蛋白聚糖 3（GPC3）是一个肝癌潜在的诊断标志物和治疗靶点。为获得抗 GPC3 单克隆抗体，用
PCR 方法克隆 GPC3 基因，利用酶切位点将该序列插入 pGEX-2T 载体，构建了 pGEX-2T-gpc3 表达载体。转化大肠杆菌 BL21（DE3）
菌株，经 IPTG 诱导，获得高效表达。经纯化后获得分子量为 58 kD 的蛋白。以该重组蛋白为免疫原，通过免疫 BALB/c 小鼠，经
过细胞融合和筛选获得 1 株抗该重组蛋白的单克隆抗体 1F3。Western blot 分析显示，该抗体具有较好的特性，可用于 GPC3 蛋白
的功能和应用研究。
关键词 ： 磷脂酰肌醇蛋白聚糖 3 蛋白表达 单克隆抗体
Expression and Antibody Preparation of Glypican3
Cheng Hua1 Fang Xiangdong2 Wu Meng1 Shi Lei3 Cui Shuo1
（1. Hebei Institue of Biology，Shijiazhuang 050081 ；2. Beijing Institute of Genomics，Chinese Academy of Sciences，Beijing 100101 ；
3. College of Life Science，Hebei Normal University，Shijiazhuang 050000）
Abstract:  Human glypican3 protein is a potential cancer therapeutic targets and diagnostic markers. In order to obtain anti-GPC3
monoclonal antibody, GPC3 gene was cloned into an expression vector pGEX-2T, which was transformed into E. coli BL21（DE3）. Induced
by IPTG, a molecular weight of 58 kD protein was obtained. After immunizing BALB/c mice, cell fusion and screening, one monoclonal antibody
was generated. Western blot analysis revealed that the antibody has a strong specificity and high titer can be used for GPC3 protein function and
applied research.
Key words:  Glypican-3 Protein expression Monoclonal antibody
点，如中央球状空间结构、C 端通过糖基磷脂酰肌
醇（Glycosyl-phosphatidylinositol，GPI）锚定于细胞
膜上等［4，5］。近期的相关研究表明，Glypican-3 与
多种肿瘤的发生发展关系密切，特别是在肝细胞癌
中特异性高表达，是一种潜在的肝癌血清学和组织
学重要诊断标志物［6-10］。
本研究以大肠杆菌为宿主，通过原核表达、提
取和纯化，获得了高纯度的重组 GPC3 蛋白。以该
蛋白为抗原，通过免疫及筛选等过程，获得了 1 株
特异性好、效价高的单克隆抗体。该抗体的获得将
为进一步研究 GPC3 的分子生物学特性和功能提供
帮助。
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第3期178
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 试验动物 雌性 BALB/c 小鼠，6-8 周龄，购
自河北省实验动物中心。
1.1.2 菌 株 与 质 粒 含 GPC3 基 因 的 质 粒 由 德 国
Lage 博士惠赠，克隆菌株 E.coli DH5α，表达菌株 E.coli
BL21（DE3）由本室保存 ；人肝癌细胞株 HepG2 由
本室保存；克隆载体 pMD18-T 购自 TaKaRa（宝生物）
公司，表达载体 pGEX-2T 购自 GE 公司。
1.1.3 主要试剂 限制性内切酶 EcoR Ι 和 BamH
Ι、T4 连接酶、Taq DNA 聚合酶、DNA 分子质量标
准和蛋白质分子量标准均购自 TaKaRa（宝生物）公
司 ；凝胶回收试剂盒均购自天根（TIANGEN）公司 ；
Recombinant Human GPC3 蛋白购自 Sino 公司 ；抗人
GPC3 蛋白抗体购自美国 Santa 公司 ；小鼠抗 GST 抗
体由第四军医大学金伯泉教授惠赠 ；辣根过氧化物
酶（HRP）标记羊抗鼠 IgG 抗体购自北京中杉公司 ；
细胞培养板、DMEM 培养基，胎牛血清，均购自美
国 GIBCO 公司 ；Glutathione sepharose 4 fast flow 纯化
试剂盒购自 GE 公司 ；丙烯酰胺、N，N-亚甲双丙
烯酰胺、异丙基 -β-D-硫代半乳糖苷（isopropyl--β-D-
thiogalactoside，IPTG）、X-gal 等生化试剂均为进口。
1.2 方法
1.2.1 目的基因的克隆 根据 GPC3 的基因阅读框
序列设计扩增引物，上游引物 ：5-CGGGATCCTAC-
CAACTAACAGCACGAT-3（下划线部分为 BamH Ι
酶切位点）；下游引物 ：5-CGGAATTCTGGTCAGCT-
TTCCTGCATTC-3（下划线部分为 EcoR Ι 酶切位
点）。使用上述引物，以含 GPC3 基因的质粒为模板
进行 PCR 扩增。
1.2.2 重组质粒 pGEX-2T-gpc3 的构建及鉴定 将
目的基因连入 pMD18-T 载体并进行验证。将扩增
的目的基因片段和质粒 pGEX-2T 分别用 EcoR Ι 和
BamH Ι 双酶切，产物经琼脂糖凝胶电泳后切胶回
收。用 T4 连接酶在 16℃水浴中连接。将连接产物
转化至 E.coli DH5α 菌株，筛选阳性克隆，获得重组
表达质粒 pGEX-2T-gpc3。
1.2.3 融合蛋白的表达和纯化 分别将 pGEX-2T 质
粒和重组质粒 pGEX-2T-gpc3 转化 E.coli BL21（DE3）
中， 得 到 表 达 菌 株。 挑 取 单 菌 落 至 3 mL LB 中，
37℃、250 r/min 摇菌过夜 ；将该菌株按 1∶100 接种
于含有氨苄青霉素的 LB 培养基中，37℃、250 r/min
摇菌至 OD600 到 0.6 ；菌液于冰上放置 15 min 后，加
入 100 mg/mL 的 IPTG 至终浓度为 0.5 mmol/L，继续
培养 4 h，低温离心收集菌体，在冰浴中进行超声波
破碎，以 4℃、8 000 r/min 离心 20 min，收集上清，
按 Glutathione sepharose 4 fast flow 纯化试剂盒的说
明，经上柱结合、洗涤和洗脱几个步骤，纯化重组
蛋白。然后进行 SDS-PAGE 电泳分析。
1.2.4 GPC3 单克隆抗体的制备
1.2.4.1 免疫小鼠 以重组蛋白作为抗原，按照标
准免疫程序进行免疫［11］，即第一次免疫为等体积重
组蛋白和完全弗氏佐剂混合，小鼠腹腔注射，剂量
为 100 μL/ 只，其中含重组蛋白 50 μg。从第二次免
疫开始，用等体积重组蛋白和不完全弗氏佐剂混合，
重组蛋白免疫剂量同第一次免疫，每两周免疫一次。
取小鼠尾静脉血检测抗体滴度，当达到 1 ∶ 1×105
后，取小鼠脾细胞进行细胞融合。
1.2.4.2 杂交瘤细胞的建立及 mAb 腹水的制备 无
菌条件下取小鼠脾脏，分离脾细胞，与 Sp2/0 细胞
以 10 ∶ 1 比例进行融合。以重组蛋白为检测原，利
用间接 ELISA 方法检测杂交瘤细胞效价。通过多
轮得有限稀释法筛出阳性杂交瘤细胞株，按照常规
方法制备腹水［12］，利用 Protein G 亲和层析柱纯化
mAb。
1.2.4.3 腹水 mAb 效价测定及抗体亚型鉴定 （1）
腹水 mAb 的效价测定 ：以自己表达重组蛋白及购
买的商业化重组人 GPC3 蛋白为检测原，采用间接
ELISA 法进行测定。（2）抗体亚型的鉴定 ：按照亚
型检测试剂盒说明书进行测定。
1.2.5 单克隆抗体 SDS-PAGE 及 Western blot 分析
1.2.5.1 与重组蛋白特异性分析 参照文献［13］
的方法进行，取适量菌体样本及纯化的蛋白进行
SDS-PAGE 电泳，电泳结束后以恒压 100 V，将蛋白
在湿转缓冲液（20 mmol/L Tris，190 mmol/L 甘氨酸，
20%（V/V）甲醇）中转移至 PVDF 膜上 ；将转好
的膜浸入封闭液（含 5%（M/V）脱脂奶粉的 TBST
（10 mmol/L Tris，150 mmol/L NaCl，0.05%Tween）
中，室温轻摇封闭 1 h ；以索要抗 GST 抗体及自己
2014年第3期 179程华等 ：磷脂酰肌醇蛋白聚糖 3 的原核表达及单克隆抗体制备
制备的单抗 1F3 为一抗，用封闭液按 1∶2 000 稀
释，室温轻摇孵育 2 h ；TBST 洗膜 4 次，每次孵育
10 min ；以 HRP 标记的羊抗鼠 IgG 为二抗，用封闭
液按 1∶10 000 稀释，室温轻摇孵育 1 h ；TBST 洗
膜 4 次，每次孵育 10 min ；DAB 显色试剂盒显色。
1.2.5.2 与商业化重组蛋白及细胞株内蛋白特异性
分 析 取 适 量 商 业 化 GPC3 重 组 蛋 白，HepG2 细
胞株和 Sp2/0 细胞株总蛋 白 进 行 SDS-PAGE 电 泳，
Western blot 过程同上，其中以购买商业化抗 GPC3
多抗及自己制备的单抗 1F3 为一抗。
2 结果
2.1 GPC3基因的克隆及重组表达质粒的构建
以含 GPC3 基因的质粒为模版，用 PCR 方法扩
增到了 1 条 GPC3 基因片段，长 803 bp（图 1），结
果与预期大小相一致。回收经 EcoR I 和 BamH I 双
酶切的片段，连入 pGEX-2T 载体，构建成表达质粒
pGEX-2T-gpc3。转化 E.coli DH5α，挑选阳性克隆，
提取质粒，进行 EcoR Ι 和 BamH Ι 双酶切，结果
（图 1，图 2）与预期大小相一致。质粒 pGEX-2T-
gpc3 经测序鉴定，结果表明插入片段与已经发表的
全序列中该片段完全一致，且以正确的方向插入到
表达载体的克隆位点。
2.2 融合蛋白的诱导表达和纯化
将构建的重组表达质粒 pGEX-2T-gpc3 转化入
E coli BL21（DE3） 表 达 菌 株 后， 以 终 浓 度 为 0.5
mmol/L 的 IPTG 于 37℃诱导蛋白表达，培养 4 h 后，
菌体经超声波破碎，使用纯化试剂盒对重组蛋白进
行纯化。将经过纯化的融合蛋白及菌体破碎产物
进 行 SDS-PAGE 电 泳， 结 果 见 图 3。 经 IPTG 诱 导
后，转入空质粒 pGEX-2T 的细菌总蛋白中出现了一
个分子量约为 26 kD 的蛋白条带，而转入重组质粒
pGEX-2T-gpc3 的细菌总蛋白中出现了一个分子量约
为 58 kD 的蛋白条带，即重组质粒是在原有 26 kD
的基础上连入了约 32 kD 的预期外源蛋白。
M 1 2 3
900 803700
2662
4942
bpbp
M ：DNA 分子量标准 ；1 ：PCR 产物 ；2 ：重组质粒 pMD18-T-gpc3
的 EcoR Ι 和 BamH Ι 双酶切产物 ；3 ：重组质粒 pGEX-2T-gpc3
的 EcoR Ι 和 BamH Ι 双酶切产物
图 1 PCR 扩增产物及重组质粒的酶切鉴定结果
M 1 2
7500
bp bp
3465
5000 5745
3000
4000
M ：DNA 分子量标准 ；1 ：重组质粒 pGEX-2T-gpc3 ；
2 ：重组质粒 pMD18-T-gpc3
图 2 重组质粒电泳结果
M 1 2 3 4
97.2
kD kD
66.4
44.3
29.0
58
20.1
26
M ：蛋白质分子量标准 ；1 ：经 IPTG 诱导的 BL21（DE3）/ pGEX-2T-gpc3 菌
体总蛋白 ；2 ：BL21（DE3）/ pGEX-2T-gpc3 总蛋白经亲和柱纯化后产物 ；
3 ：BL21（DE3）/ pGEX-2T 总蛋白经亲和柱纯化后产物 ；4 ：经 IPTG 诱导
的 BL21（DE3）/ pGEX-2T
图 3 GST-gpc3 融合蛋白表达的 SDS-PAGE 电泳分析
2.3 单克隆抗体的获得、效价测定及亚型鉴定
重组蛋白作为抗原，经过免疫、融合及筛选过程，
最终获得一株抗重组蛋白的单克隆抗体 1F3。以自
己表达重组蛋白及购买的商业化重组人 GPC3 蛋白
为检测原，采用间接 ELISA 法测定单抗效价，两者
均为 1∶5.12×105，抗体亚型为 IgG1 型。
2.4 单克隆抗体特异性检测
以索取的抗 GST 单抗及制备的小鼠腹水为一抗
进行 Western blot 分析鉴定。在 PVDF 膜上，空载
质粒 pGEX-2T 有一条分子量约为 26 kD 的带，重组
质粒呈现分子量约为 58 kD 的显色带，而未经诱导
的菌体空白对照则没有任何显色带出现。表明 GST-
gpc3 融合蛋白表达正确。
以购买商业化抗 GPC3 多抗及自己制备的单抗
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第3期180
1F3 为一抗。进行 Western blot 分析鉴定，结果见图 5。
购买的商业化重组人 GPC3 蛋白及 HepG2 细胞株蛋
白提取液中都可以看到在 66 kD 的位置上有带，而
Sp2/0 细胞株总蛋白则没有任何显色带出现，表明作
者制备的单抗特异性较好。
细胞癌发现，有 143 例（74.8%）表达 GPC3 mRNA，
154 例非肿瘤肝组织仅有 5 例（3.2%）表达 GPC3
mRNA。Nakatsura 等［16］用 Western blot 和 ELISA 法
对多种肝病患者和正常人血清中分泌性的 GPC3 蛋
白进行了定性测定，结果发现在 40 例 HCC 患者中
有 16 例（40%）GPC3 呈阳性，而 13 例肝硬化患者、
34 例慢性肝炎患者、60 例正常均呈阴性。Capurro
等［17］用 ELISA 法检测血清中的 GPC3，结果发现在
34 例 HCC 患者中有 18 例（53%）GPC3 浓度明显升高，
而在 20 例肝硬化合并慢性肝炎的患者中仅有 1 例
GPC3 浓度升高。如果联合检测血清 AFP、GPC3，
诊断肝癌的敏感度为 82%。
利用原核表达蛋白，免疫动物获得特异性抗体
是一种有效、方便的途径。为了获得具有自主知识
产品的抗 GPC3 抗体，本研究构建了原核表达载体
pGEX-2T-gpc3，经过高效表达、提取和纯化等过程
获得了高纯度重组 GPC3 蛋白。pGEX 系统是一种
高效的原核表达系统，该系统具有以下特点 ：（1）
GST 不影响后面融合序列的活性。（2）能够将目的
蛋白与可溶的谷胱甘肽巯基转移酶联合表达，获得
可溶性的重组蛋白。（3）使用 GST 亲和纯化层析柱，
能够对表达产物进行纯化，且纯度非常高，有利于
后续试验的进行。本研究使用 GST-gpc3 融合蛋白作
为免疫原进行抗体制备，获得的抗体中可能兼有抗
GST 的抗体。为了消除这些抗体，排除假阳性的干
扰，同时设立了 GST ELISA 作为对照，结果证明获
得的最终抗体只与 GST-gpc3 反应，不与 GST 反应，
抗体具有很好的特异性。
4 结论
本 研 究 成 功 构 建 了 原 核 表 达 载 体 pGEX-2T-
gpc3，经过高效表达、提取和纯化等过程获得了高
纯度重组 GPC3 蛋白。以该蛋白为免疫原，免疫
BALB/c 小鼠，经过细胞融合和筛选获得 1 株抗该重
组蛋白的单克隆抗体。该抗体具有较强的特异性和
高效价，可用于 GPC3 蛋白的功能和应用研究。
参 考 文 献
［1］ Pilia G, Hughes-Benzie RM, MacKenzie A, et al. Mutations in GPC3,
a glypican gene, cause the Simpson-Golabi-Behmel overgrowth
66.4
kD
M 1 2 3 4
kD
44.3
29.0
26
58
M ：蛋白质分子量标准 ；1 ：经 IPTG 诱导的 BL21（DE3）/ pGEX-2T（一抗
为抗 GST 单抗）；2 ：经 IPTG 诱导的 BL21（DE3）/ pGEX-2T-gpc3 菌体总
蛋白（一抗为抗 GST 单抗）；3 ：未经 IPTG 诱导的 BL21（DE3）/ pGEX-2T-
gpc3 菌体总蛋白（一抗为抗 GST 单抗）；4 ：经 IPTG 诱导的 BL21（DE3）/
pGEX-2T-gpc3 菌体总蛋白（一抗为抗重组蛋白单抗 1F3）
图 4 GST-gpc3 融合蛋白在 E coli BL21（DE3）中表达的
Western blot 分析
72
kD
1 2 3 4 5 6
55
GPC3
1 ：商业化重组人 GPC3（一抗为抗 GPC3 多抗）；2 ：商业化重组人 GPC3（一
抗为单抗 1F3）；3 ：Sp2/0 细胞株总蛋白（一抗为抗 GPC3 多抗）；4 ：Sp2/0
细胞株总蛋白（一抗为单抗 1F3）；5 ：HepG2 细胞株总蛋白（一抗为抗
GPC3 多抗）；6 ：HepG2 细胞株总蛋白（一抗为单抗 1F3）
图 5 人 GPC3 蛋白及 HepG2、Sp2/0 细胞株总蛋白
Western blot 分析
3 讨论
我国对肝癌的早期诊断中应用最多的检测指标
是甲胎蛋白（AFP）。吴孟超等［14］检测了 5 343 例
肝癌病例中甲胎蛋白的水平，阳性率为 69.4%。表
明甲胎蛋白是目前诊断肝癌极为重要的血清标志物
之一，但是，同时仍有 3 成以上的错、漏检率。寻
找新的肝癌特异性标志物是提高临床早期诊断的重
要途径之一。
最近，磷脂酰肌醇蛋白聚糖 3 作为一种新的
肝癌肿瘤标志物被国内外研究人员提出。1996 年，
Pilia 等［1］首先克隆出了 Glypican-3 基因。Hsu 等［15］
应用差异显示方法研究了 197 例原发性和继发性肝
2014年第3期 181程华等 ：磷脂酰肌醇蛋白聚糖 3 的原核表达及单克隆抗体制备
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（责任编辑 李楠）