全 文 ：·研究报告·
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2014年第1期
收稿日期 ：2013-10-14
作者简介 ：作者简介 ：胡翠英，女，硕士，研究方向 ：发酵工程研究 ；E-mail ：13151170848@163.com
节约粮食和提高农副产品的利用率，减少农业
废弃物燃烧带来的环境污染问题，已经引起众多人
的关注，将农业废弃物转为可利用能源成为大家研
究的课题。我国北方每年都有大量玉米芯被焚烧，
如能加以利用，将节约原料成本，故降解此物成为
本研究的目的。但一方面由于半纤维素与木质素等
组成的致密结构，另一方面纤维素本身不能为丙酮
丁醇梭菌直接利用，故需先进行一连串的预处理、
酶解等［1-3］，将纤维素降解为葡萄糖、木糖等单糖。
纤维素酶的提取过程［4，5］较繁琐，酶损失较大，成
本较高，如能直接利用纤维素酶产生菌降解纤维素
为单糖，可省去酶的提取、纯化的过程，减少酶活
三种霉菌产纤维素酶能力分析与培养条件优化
胡翠英  李良智  赵建  钱玮  顾华杰
（苏州科技学院 化学生物与材料工程学院，苏州 215009）
摘 要 ： 对实验室现有 3 种真菌产纤维素酶能力的分析及培养条件优化。比较了 3 种菌在刚果红培养基上的透明圈大小、
并分析产纤维素酶酶活；通过单因素与响应面分析的方法优化毛酶产纤维素酶的培养条件。通过试验得出 3 种真菌均能产纤维素酶，
毛霉能产较多的纤维素酶。毛霉产纤维素酶的最佳条件为：pH 5.0，转速 220 r/min，发酵时间 47 h，发酵温度 35 ℃，纤维素酶活为 6.99
U/mL。毛霉、青霉、曲霉均产纤维素酶，毛霉能降解玉米芯纤维素。
关键词 ： 霉菌 纤维素酶 培养条件 优化
Analysis on Cellulase Producing Abilities of Three Kinds of Fungi and
Optimization of Cultivation Conditions
Hu Cuiying Li Liangzhi Zhao Jian Qian Wei Gu Huajie
（College of Chemistry，Biology and Materials Engineering，Suzhou University of Science and Technology，Suzhou 215009）
Abstract:  We analyzed the cellulose degradation ability of three kinds of fungi （Penicillium, Mucor and Aspergillus） preserved in the
laboratory and optimalized the culture conditions. The transparent ring size of three kinds of fungi training in the congo red medium and in the
corncob congo red medium was observed. The cellulase activity was measured of the three fungi cultured in the CMC-Na medium. Single factor
and response surface methodology were used to optimize the culture condition. The three kinds of fungi all could produce cellulase. The cellulase
activity of Mucor was higher than the other two cultured in the the CMC-Na medium. The optimized conditions were below ：pH was 5.0, the
shaking speed was 220 r/min，fermentation time was 47 h，fermentation temperature was 35 ℃ . The highest CMCase activity was 6.99 U/mL
training on the optimized condition. Penicillium, Mucor and Aspergillus produced cellulase and Mucor could degrade corncob.
Key words:  Fungi Cellulase Culture condition Optimize
力损失、节约成本。其降解物直接作为产能源菌的
碳源，形成两菌共培养的情形。目前纤维素降解菌
研究［6-9］中多为真菌，且大多为青霉、曲霉、木霉
等。本文的主要研究内容为从实验室现有霉菌中寻
找纤维素降解菌，比较纤维素酶活，优化培养条件，
为进行共培养提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌种 青霉、毛霉、曲霉，来自本实验室。玉
米芯 ：来自山西农村，往年搁置 1 年，风干粉碎过
40 目筛子备用。
1.1.2 主要仪器 纤维素酶活测定采用 723PC 型分
2014年第1期 183胡翠英等 ：三种霉菌产纤维素酶能力分析与培养条件优化
光光度计（上海欣茂），发酵溶剂分析用气相色谱
仪 GC112A 型（上海精科），FID 检测器，PEG 毛细
管柱。
1.1.3 试剂与培养基 柠檬酸、柠檬酸钠、CMC-Na、
纤维素酶、3，5-二硝基水杨酸。
菌 种 培 养 基 ：葡 萄 糖 30 g、NaNO3 2 g、K2H-
PO4·3H2O 1 g、 KCl 0.5 g 、MgSO4·7H2O 0.5 g、
FeSO4·7H2O 0.01 g，蒸馏水 1 000 mL，加热至溶解，
121 ℃高压灭菌 20 min。
纤 维 素 刚 果 红 琼 脂 培 养 基 ：K2HPO4·3H2O
0.5 g、MgSO4·7H2O 0.25 g、纤维素粉 1.88 g、刚果红
0.2 g、琼脂 15 g、明胶 2 g，蒸馏水 1 000 mL，加热
至溶解，121 ℃高压灭菌 20 min。
玉米芯粉刚果红琼脂培养基 ：将纤维素刚果红
琼脂培养基中的纤维素粉换成预处理玉米芯粉。
液体产酶培养基 ：蛋白胨 3 g、酵母膏 0.2 g、
（NH4）2SO4 2 g、KH2PO4 4 g、CaCl2·7H2O 0.3 g、
MgSO4·7H2O 0.3 g、CMC-Na 10 g、蒸馏水 1 000 mL
中，加热至溶解，121 ℃高压灭菌 20 min。
1.2 方法
1.2.1 玉米芯预处理 称取 15 g 玉米芯粉，加入
120 mL 蒸馏水，滴加 3% 的硫酸，调 pH 2-3，25℃
处理 48 h，70℃处理 10 h，高温 110℃处理 0.5 h，
过滤，干燥备用。
1.2.2 纤 维 素 酶 产 生 菌 鉴 定 在 菌 种 培 养 基 上，
37℃，200 r/min 培养 24 h。吸取稀释好的菌液于刚
果红鉴定平板上，28℃恒温培养 2-3 d，转到 4℃冰箱，
有利于释放菌体中的纤维素酶，观察透明圈。挑取
单菌落做成斜面。
1.2.3 测定纤维素酶活 挑取透明圈较大的菌落，
接种于产酶培养基中，200 r/min，37℃，培养 24 h，
离心，取得粗酶液，测定总酶活。测定方法 CMC-
Na 酶活，见文献［9］。每分钟水解底物产生 1 μmol
还原糖的酶量，定义为一个酶活单位（U）。
酶活计算公式：酶活力（U/mL）= 还原糖量 /30*Ew
其 中，30 为 水 浴 保 温 时 间，Ew 为 粗 酶 液 的
体积。
1.2.4 优化产酶培养条件 采用单因素试验，改变
pH（分别为 2、4、6、8、10）、摇床转速（分别为
100、150、200、250、300 r/min）、培养温度（分别
为 20℃、30℃、40℃、50℃）、发酵时间（分别为
24、48、72、96、120 h）等培养条件。根据单因素
的试验结果，进行响应面分析，优化试验结果。
2 结果
2.1 比较3种菌的纤维素降解能力
通过计算刚果红培养基上透明水解圈与菌落直
径的比值、产酶培养基中菌种产酶活力分析 3 种菌
的纤维素降解能力。表 1 为 3 种菌分别在碳源为纤
维素粉或经预处理的玉米芯粉培养基上透明圈与菌
落直径比。结果表明，青霉、毛霉、曲霉均可在纤
维素粉培养基和玉米芯粉培养基上生长，但在纤维
素粉培养基上的菌落直径较大，3 种菌对玉米芯的
利用能力较弱。毛霉的 D/d 值较其它两种菌大，相
对而言毛霉产纤维素酶活较大。图 1 比较了不同真
菌产酶的 CMCase 酶活力，进一步说明毛霉总酶活
较高，达到 3.28 U/mL，因此后续优化试验以毛霉为
研究对象。
表 1 不同菌株在刚果红培养基上透明圈直径比
Strains Diameter of transparent ring（D/cm） Diameter of colony（d/cm） D/d
Penicillium（the medium without corncob powder） 1.25 0.95 1.32
Mucor（the medium without corncob powder） 0.85 0.50 1.70
Aspergillus（the medium without corncob powder） 0.63 0.51 1.24
Penicillium（the medium with corncob powder） 0.28 0.26 1.08
Mucor（the medium with corncob powder） 0.82 0.48 1.71
Penicillium（the medium with corncob powder） 0.27 0.20 1.35
2.2 单因素试验
不同 pH 条件下酶活力中心可解离基团的结构
不同，由图 2 可知，酶活力随 pH 的升高先升高后
下降，且经 F 检验得出毛霉产纤维素酶的最适初始
pH 值为 4-6 之间，其酶活力约为 3.7 U/mL。
转速是影响好氧菌生长的重要参数。从图 3 可
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第1期184
看出，酶活随着转速的提高呈现先上升后下降的趋
势，且经 F 检验，摇床转速在 200 r/min 左右，有较
好的产纤维素酶能力，可达到 2.1 U/mL。
图 1 不同菌种纤维素酶活
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
Aspergillus Penicillium Mucor
㧼⿽
䞦⍫
ᙗU
/m
L
图 2 初始 pH 对纤维素酶活的影响
图 3 摇床转速对纤维素酶活的影响
图 5 培养温度对纤维素酶活的影响
酶活随培养时间长短不同而不同。图 4 体现为
酶活力在培养 48 h 时最高，在培养时间低于 48 h 的
范围内，酶活力随时间的增大而变大，培养 48 h 时
酶活最大为 4.985 U/mL。培养时间超过 48 h 后，酶
活力随时间的增大而逐渐变小，这应该与底物浓度
降低以及代谢产物抑制有关。
同样，每种微生物都有一个最适宜纤维素酶
保持酶活的温度范围。图 9 中酶活力在培养温度在
40℃时最高，在低于 40℃范围内，随温度的升高而
变大，但是在大于 40℃的范围内，随温度的升高而
逐渐变小。说明温度在 40 ℃左右比较适合毛霉产生
纤维素酶并保持酶活。
图 4 培养时间对纤维素酶活的影响
2.3 响应面分析
为使发酵条件优化，在对 2.3 试验结果分析的
基础上设置响应面试验，选用 pH（x1）、转速（x2）、
培养时间（x3）、培养温度（x4）四种因素三水平设计。
基本依据 2.3 结果中较佳条件向两边扩充。试验设
计及试验结果见表 2，变量分析见表 3。
如果 P<0.05，则说明模型中项的影响是显著的，
在这个模型中 x3 即培养时间是模型的显著项。失拟
项反应的是实验数据与模型不相符的情况，它的值
为 1.87，与整个模型的 99.14 比起来较小，表示不
符合的数据相对于纯误差不显著，即这个模型是比
较符合实际数据。
根据 Matlab 与 Design expert 所做的分析，得二
次拟合回归方程 ：
酶 活 ＝ 5.81-0.0908×x1-0.0608×x2-0.2433×
x3+0.1533×x4-0.1125×x12+0.0100×x22-5.0512×
x32+0.2613×x42-0.2350×x1×x2-0.0650×x1×x3-
0.3075×x1×x4-0.0125×x2×x3+0.0150×x2×x4-
0.0425×x3×x4
对模型进行方差分析得 R2=0.991 4，说明方程
有较好的拟合度，方程与实际情况比较相符，并能
作出相对准确的预测。
图 6 中 3 个响应面图说明 4 个因素对酶活影响
趋势与单因素试验结果相同，4 个因素中发酵时间
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
4.0
0 2 4 6 8 10 12
pH
䞦⍫
ᙗU
/m
L
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
0 50 100 150 200 250 300 350䖜䙏r/min
䞦⍫
ᙗU
/m
L
0
1
2
3
4
5
6
0 20 40 60 80 100 120 140ษޫᰦ䰤h
䞦⍫
ᙗU
/m
L
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
1.4
1.6
1.8
0 15 30 45 60
䞦⍫
ᙗU
/m
L
ษޫć
2014年第1期 185胡翠英等 ：三种霉菌产纤维素酶能力分析与培养条件优化
表 2 三水平因子试验设计及试验结果
x1 x2 （r/min） x3 （h） x4 （oC） Enzyme activity（U/mL）
1 2 200 48 30 5.74
2 6 250 48 50 6.55
3 10 200 24 40 0.95
4 6 150 48 50 6.24
5 6 200 24 50 1.33
6 2 200 48 50 6.67
7 2 200 72 40 0.55
8 6 250 72 40 0.45
9 10 200 48 30 6.04
10 10 200 72 40 0.76
11 6 150 72 40 0.6
12 10 250 48 40 4.80
13 6 200 24 30 1.19
14 6 200 72 30 0.54
15 6 200 48 40 6.08
16 10 200 48 50 5.74
17 6 250 24 40 1.14
18 6 150 24 40 1.24
19 6 150 48 30 5.72
20 10 150 48 40 5.79
21 6 200 72 50 0.51
22 2 250 48 40 5.89
23 6 200 48 40 5.54
24 6 250 48 30 5.97
25 2 150 48 40 5.89
26 2 200 24 40 0.78
表 3 三水平因子变量分析表
Source Sum of squares Degree of freedom Mean square F P
x1 0.099 0 1 0.099 0 0.787 0 0.392 5
x2 0.044 4 1 0.044 4 0.353 0 0.563 5
x3 0.710 5 1 0.710 5 5.647 6 0.035 0
x4 0.282 1 1 0.282 1 2.242 5 0.160 1
x1×x2 0.220 9 1 0.220 9 1.755 8 0.209 8
x1×x3 0.016 9 1 0.016 9 0.134 3 0.720 4
x1×x4 0.378 2 1 0.378 2 3.006 3 0.108 5
x2×x3 0.000 6 1 0.000 6 0.005 0 0.945 0
x2×x4 0.000 9 1 0.000 9 0.007 2 0.934 0
x3×x4 0.007 2 1 0.007 2 0.057 4 0.814 7
x12 0.067 5 1 0.067 5 0.536 5 0.477 9
x22 0.000 5 1 0.000 5 0.004 2 0.949 2
x32 136.080 7 1 136.080 7 1 081.620 9 < 0.000 1
x42 0.364 0 1 0.364 0 2.893 3 0.114 7
Model 174.614 5 14 12.472 5 99.135 9 < 0.000 1
Residual 1.509 7 12 0.125 8
Lack of fit 1.360 0 10 0.140 0 1.870 0 0.398 2
Pure error 0.150 0 2 0.073 0
Cor Total 176.124 3 26
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第1期186
是最大的影响因素。对方程求偏导为 =0，得出最佳
条件为 ：pH 5.0，转速 222 r/min，发酵时间 47.4 h，
发酵温度 35.4℃。
为验证模型的符合度，做了验证试验，配制 pH
为 5.0 的产酶培养基，准备 4 个 250 mL 的摇瓶，倒
入 50 mL 配制好的产酶培养基，放置于温度 35 ℃，
220 r/min，培养 47 h，测定酶活。验证试验酶活力
为 6.99U/mL，方差不显著，符合预期，所以模型可信，
且所得值是本篇论文中最高值。
图 6 pH、转速、发酵时间、培养温度对滤纸酶活的响应
面图
6
-1
-0.5
0
0.5
1
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0
0.5
5
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3y
x3 x1
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3
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x2
x3
y
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0
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0
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1
0
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2
3
4
5
6
7
x3
x4
y
利用考马斯亮蓝法测得蛋白质含量为 6.81 μg/
mL，得酶比活 1.03×106。实验室购买的纤维素酶比
活为 3.00×104，说明在酶的提取纯化过程中，损失
酶活。所以，如能进一步提高酶蛋白的产量，省略
酶的提取纯化过程，直接用于纤维素降解，降解产
物直接被产能源的菌利用，可节约成本。
3 讨论
纤维素是由 D- 葡萄糖以 β-1，4 糖苷键组成的
大分子，Wood 等［10-11］研究表明刚果红与 D- 葡萄
糖的 β-1，4 糖苷键、D- 葡萄糖的 β-1，3 糖苷键等
有较强的作用，显示红色。随着纤维素的降解，红
色减弱形成透明圈，因此刚果红染料可用于鉴定纤
维素酶的存在［12-14］。通常透明圈大小与菌落直径的
比值同纤维素酶活间有一定关系，比值较大，则酶
活相对较高［12，14，15］。试验室 3 种真菌青霉、毛霉、
曲霉，均可产生纤维素酶，其中毛霉纤维素酶活相
对较高。青霉属、曲霉属中也有产纤维素酶活较高
的菌种，如许玉林等［17］得到的草酸青霉，习兴梅等［18］
得到的黑曲霉等。本实验室现有的青霉、曲霉相对
较弱。
影响产纤维素酶的培养条件中，毛霉产纤维素
酶的最适培养基初始 pH5.0，与相关文献中真菌产
纤维素酶的最适 pH 范围相似［6，12］。可见毛霉为非
嗜酸或嗜碱类细菌，中性偏酸的培养条件较适合其
纤维素酶的生产。摇床转速 220 r/min，毛霉为好氧菌，
摇床转速对毛霉的生长较重要，转速太低，溶氧不
足 ；转速太高，对毛霉剪切力较大［16］。每种微生物
都有一个最适宜生长的温度范围［16］，本试验中温度
为 35℃。
从试验结果分析，毛霉产酶活并不是很高，且
完全降解纤维素仅靠 1 种微生物是难实现的，所以
菌株的协同效应在纤维素降解中尤为重要。在选择
菌种时应充分考虑菌株之间的协同作用，防止拮抗
作用的发生。试验初步探讨了毛霉的产酶效果，对
纤维素的高效降解具有一定的理论指导意义，至于
菌株的产酶机理还有待于进一步研究。
4 结论
通过对纤维素总酶活的测定与比较，得出毛霉
产酶活最高。通过对毛霉产酶条件的单因素试验与
2014年第1期 187胡翠英等 ：三种霉菌产纤维素酶能力分析与培养条件优化
响应面分析优化，得出较佳条件 ：pH 5.0，转速 222
r/min，发酵时间 47.4 h，发酵温度 35.4 度条件下产
酶活最高为 6.99 U/mL。
参 考 文 献
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（责任编辑 李楠）