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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2014年第1期
埃博霉素（Epothilones）是黏细菌纤维堆囊菌
产生的大环内酯类次级代谢产物［1］，是一种新型的
抗肿瘤药物。其作用机制与紫杉醇相同，通过促微
管聚合作用从而抑制肿瘤细胞的增殖［2］，并且与紫
杉醇相比，埃博霉素具有毒性更小、水溶性更好［3］、
对紫杉醇耐药性细胞作用更强、抗肿瘤谱更广等优
点，因此埃博霉素被誉为最具有潜力的抗肿瘤新药
之一［4-6］。
收稿日期 ： 2013-08-15
基金项目 ：陕西省教育厅自然科学专项（12JK1023），国家自然科学基金项目（20906058）
作者简介 ：龚国利，男，副教授，硕士生导师，研究方向 ：生物制药技术 ；E-mail ：gongguoli@sust.edu.cn
响应面法优化纤维堆囊菌 SoF5-76 产埃博霉素 B
发酵培养基
龚国利 王娜 刘丽丽
（陕西科技大学 生命科学与工程学院，西安 710021）
摘 要： 以纤维堆囊菌SOF5-76为试验菌株，用响应面分析法对其产埃博霉素B的培养基进行优化，以提高埃博霉素B的产量。
在单因素试验的基础上，利用 Plackett-Burman 筛选出对埃博霉素 B 产量有显著影响的 3 个因素为马铃薯淀粉、脱脂奶粉和无水氯
化钙，在此基础上通过最陡爬坡试验逼近最佳响应面区域 ；再运用 Box-Behnken 试验设计和响应面分析法进行回归分析，确定重
要因素的最优浓度。得到最佳发酵培养基为 ：马铃薯淀粉 3.9 g/L、脱脂奶粉 2.2 g/L、无水氯化钙 1.3 g/L、葡萄糖 1 g/L，豆饼粉 1.5
g/L，七水硫酸镁 2.5 g/L，EDTA-Fe3+ 3 mL/L，微量元素（TE）0.5 mL/L，VB12 1 mL/L。在此最优条件下发酵埃博霉素 B 的产量为
29.95 mg/L，与模型预测值接近，发酵产量比优化前提高了 1.1 倍。
关键词 ： 埃博霉素 B 纤维堆囊菌 发酵培养基 响应面法优化
Medium Optimization for Enhanced Production of Epothilone B by
Sorangium cellulosum SoF5-76 Using Response Surface Methodology
Gong Guoli Wang Na Liu Lili
（College of Life Science and Engineering，Shaanxi University of Science and Technology，Xi’an 710021）
Abstract: The response surface methodology（RSM）was employed to optimize the medium composition for Epothilone B produced
by Sorangium cellulosum SoF5-76. On the basis of one-variable-at-a-time design, using Plackett-Burman design, potato starch, skimmed milk
powder and calcium chloride were screened out of 9 factors as main affecting variables of Epothilone B production, and then steepest ascent
method was used to approach their maximum response regions, followed by Box-Behnken design, multiple regression analysis and response
surface analysis. The optimum medium formula determined was composed of potato starch 3.9 g/L, skim milk powder 2.2 g /L, chlorine calcium 1.3
g/L, glucose 1 g/L, soybean powder 1.5 g/L, magnesium sulfate 2.5 g/L, EDTA-Fe3 + 3 mL/L, trace elements 0.5 mL/L, VB12 1 mL/L. Under this
optimal conditions, Epothilone B production reached up to 29.95 mg/L and increased 1.1 times in average as compared with preliminary culture
and consistent with the maxmum predicted value.
Key words: Epothilone B Sorangium cellulosum Fermentation medium Response surface methodology optimization
目前有很多种化学法可以合成埃博霉素 B，但
是反应条件苛刻，成本高，合成路线长，产率低，
污染环境，而发酵法则可以克服上述缺点。为了实
现埃博霉素的大规模生产，生物发酵是理想的途径。
但是目前该法产量低，不稳定，受培养条件和环境
等因素的影响较大，所以在发酵生产过程中，主要
通过菌种选育和优化发酵工艺条件来提高埃博霉素
的产量。
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第1期172
本研究以纤维堆囊菌 SOF5-76 为试验菌株，该
菌株是由本实验室从土壤中筛选，经基因重组技术
选育获得的遗传稳定的高产菌株之一，经过为期 1
年的观察，此菌株产量较其他菌株（SoF5-09）稳定，
埃博霉素产量不稳定是其研究的一大难题。虽然实
验室前期已采用正交法研究了另一高产菌株 SoF5-
09 的发酵工艺［7，8］，分别对埃博霉素 B 的发酵培养
基和培养条件进行优化，使埃博霉素产量分别达到
27.5 mg/L、33.5 mg/L。由于菌株的特异性，且试验
菌株稳定性较好，因此对其发酵合成埃博霉素 B 的
营养条件进行优化具有一定的意义。诸景光等［6］曾
采用响应面法对埃博霉素发酵工艺进行优化，筛选
出的重要因素皆为培养条件相关的因素，不能实现
对营养条件系统优化的目的。本研究则着重考虑营
养条件对埃博霉素产量的影响，对其进行系统的优
化。目前，统计学试验设计已经成功应用于一些培
养基组分和培养条件的优化［9-13］，本研究采用统计
学试验设计对纤维堆囊菌发酵培养基进行系统的优
化，旨在提高埃博霉素 B 产量，且为其规模化生产
奠定试验基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌种 纤维堆囊菌 SoF5-76（Sorangium cellu-
losum SoF5-76）由本实验室从土壤中筛选，经过基
因组重组技术选育获得，埃博霉素 B 产量为 14.2
mg/L［14］。
1.1.2 培养基 CNST 培养基：KNO3 0.05%，Na2HPO4
0.025%，MgSO4 7H2O 0.1%，FeCl3 0.001%，琼脂 2%，
微量元素液 1 mL/L，pH7.2。1×105 Pa 高压蒸汽灭
菌 20 min。
M26 培养基 ：土豆淀粉 8.0 g/L，大豆蛋白胨 2.0
g/L，葡萄糖 2.0 g/L，酵母粉 2.0 g/L，MgSO4·7H2O
1.0 g/L，CaCl2 1.0 g/L，EDTA-Fe
3+ 1 mL/L，微量元素
1 mL/L，以 KOH 调节 pH 值为 7.2。
初始发酵培养基 ：糊精 0.3%，蔗糖 0.07%，葡
萄糖 0.02%，豆饼粉 0.17%，七水硫酸镁 0.17%，无
水氯化钙 0.3%，EDTA-Fe3+ 2 mL/L，微量元素（TE）
0.5 mL/L，pH7.2，树脂 XAD-16 2%。1×105Pa 高压
蒸汽灭菌 20 min［13］。
1.1.3 试剂 EPothilone B 标准品购于 Singma 公司 ；
XAD-16 树脂购于德国 Sigma 公司 ；马铃薯淀粉、脱
脂奶粉、豆饼粉为食品级，市场购买，其余试剂均
为分析纯。
1.1.4 仪器 Waters-2487-2420-1525 高效液相色谱
仪，美国 waters 公司。
1.2 方法
1.2.1 培养方法 种子培养 ：将保藏在固体斜面培
养基的菌种接入放有已灭菌滤纸片的 CNST 平板上，
倒置于恒温培养箱中在 30℃条件下培养 5-7 d 后，
转接于 M26 培养基中，装液量为 50 mL/250 mL 三角
瓶，在 30℃、170 r/min 的条件下摇床培养 72 h 后，
得到作为发酵培养的种子液。
发酵培养 ：以 5%（V/V）接种量将所得种子
液接种到发酵培养基中进行摇床培养，发酵体系为
300 mL 三角瓶装液量为 50 mL，在 30℃、170 r/min
的条件下摇床培养 5 d。
1.2.2 埃博霉素 B 提取及含量测定 埃博霉素 B 提
取 ：发酵结束后，过滤收集树脂，用 10 倍体积甲醇
振荡浸提 24 h 后，弃去树脂，甲醇浸提液放入真空干
燥箱中烘干，再加入 500 μL 甲醇复溶，转移到离心
管中。
埃博霉素 B 检测 ：采用 HPLC 定量分析。液相
色 谱 条 件 ：色 谱 柱 ：YWG，C18，10 μm，250×4.6
mm ；Waters-2487 高效液相色谱仪 ；UV 紫外检测器 ；
检测波长 ：249 nm，流动相 ：甲醇∶水 =65∶35（体
积比）；上样体积 ：20 μL，时间 ：30 min，流速 ：1
mL/min。埃博霉素 B 的定量采用本实验室用的标准
曲线。方程为 ：y=0.132x +0.0035。
采用 HPLC 检测埃博霉素 B 所得的峰面积，根
据标准曲线换算成埃博霉素 B 产量。
1.2.3 Plackett-Burman 设 计 Plackett-Burman 设 计
用来确定对埃博霉素 B 产量有显著影响作用的因子
以及去除一些可有可无的因子。每个因子设置高低
两个水平，分别用“+”、“-“表示，设定高水平为
低水平的 2 倍。根据前期单因子试验的结果，影响
埃博霉素 B 产量的因素有单因子试验初步确定的最
佳碳源（马铃薯淀粉、葡萄糖）、氮源（豆饼粉、脱
脂奶粉、乙酸铵）、生长因子 VB12、无机盐（七水
2014年第1期 173龚国利等 ：响应面法优化纤维堆囊菌 SoF5-76 产埃博霉素 B 发酵培养基
硫酸镁、无水氯化钙）铁离子（EDTA-Fe3+）。 选用
N=12 的 Plackett-Burman 设计，考察上述 9 个因素对
埃博霉素 B 产量影响的重要性。
1.2.4 最陡爬坡试验 由于响应面拟合多项式模型
只有在考察的紧接邻域里才充分近似真实情形，所
以应先使得显著因素的水平尽量逼近最佳区域再建
立有效的拟合方程，最陡爬坡试验可以实现。根据
Plackett-Burman 试验结果，对筛选出的显著因素的
变化方向、步长作了相应的设计。
1.2.5 Box-Behnken 试验 逼近最大响应区域后，应
用 Box-Behnken 设计对显著因子进行优化，寻找菌
种发酵使得 EpoB 产量达到最大的最优条件。根据
最陡爬坡试验结果，确定显著因子的高、中、低水平，
表征为 1、0、-1，使用 SAS9.2 软件试验设计及响应
面分析。
2 结果
2.1 Plackett-Burman设计筛选重要影响因素
自变量编码和水平因素见表 1，Plackett-Burman
试验设计结果见表 2。使用 SAS9.2 软件对试验结果
进行回归分析得到了回归方程以及各影响因子的显
著性（表 3）。由表 3 可知，马铃薯淀粉（A）、脱脂
奶粉（D）和无水氯化钙（G）为影响埃博霉素 B 产
量的显著因素，除了确定这 3 个重要影响因子之外，
还据此对初始发酵培养基做出相应的改变和调整，
氮源中由于乙酸铵对埃博霉素 B 产量的影响甚小，
故在后续试验发酵培养基去掉这一成分，其余不显
著的变量的取值结合效应的正负和节约正本的原则，
进行调整。
表 1 Plackett-Burman 试验设计水平及编码
变量 代号
水平
-1 1
马铃薯淀粉 A 2 4
葡萄糖 B 1 2
豆饼粉 C 1 2
脱脂奶粉 D 1 2
乙酸铵 E 0.5 1
MgSO4�7H2O F 1.7 3.4
CaCl2 G 3 6
EDTA-Fe3+ H 2 4
VB12 J 1 2
2.2 最陡爬坡试验
根据 Plackett-Burman 试验分析的结果，结合试
验的实际需要，在最陡爬坡试验中对埃博霉素 B 产
量影响显著的因素的变化方向、步长作了相应的设
计，具体取值和试验结果见表 4。由表 4 可知，埃
博霉素 B 产量的变化趋势是先上升后下降，其中从
中心点开始到 3Δ 之间都显著增加，在 0+3Δ 水平
上达到最大值，3Δ 以后埃博霉素 B 产量开始下降，
表 2 Plackett-Burman 试验设计结果及响应值
Run A B C D E F G H J 埃博霉素 B（mg/L）
1 1 -1 1 -1 -1 -1 1 1 1 16.82
2 1 1 -1 1 -1 -1 -1 1 1 22.04
3 -1 1 1 -1 1 -1 -1 -1 1 13.34
4 1 -1 1 1 -1 1 -1 -1 -1 24.47
5 1 1 -1 1 1 -1 1 -1 -1 20.23
6 1 1 1 -1 1 1 -1 1 -1 18.35
7 -1 1 1 1 -1 1 1 -1 1 18.07
8 -1 -1 1 1 1 -1 1 1 -1 19.73
9 -1 -1 -1 1 1 1 -1 1 1 20.11
10 1 -1 -1 -1 1 1 1 -1 1 17.16
11 -1 1 -1 -1 -1 1 1 1 -1 12.02
12 -1 -1 -1 -1 -1 -1 -1 -1 -1 13.36
表 3 Plackett-Burman 试验中各因素的效应分析
变量 因素 t Pr>|t| 主次顺序
A 马铃薯淀粉 12.6729 0.0062 2
B 葡萄糖 -4.2921 0.0502 4
C 豆饼粉 3.3094 0.0804 5
D 脱脂奶粉 18.9755 0.0028 1
E 乙酸铵 1.2086 0.3503 8
F MgSO4�7H2O 2.6317 0.1191 6
G CaCl2 -4.3147 0.0497 3
H EDTA-Fe3+ 1.3780 0.3021 7
J VB12 -0.3501 0.7597 9
表 4 最陡爬坡试验设计与结果
试验号 步长
变量水平（g/L）
埃博霉素 B（mg/L）
马铃薯淀粉 脱脂奶粉 CaCl2
Δ 0.5 0.5 0.5
1 0 2 1 3 20.16
2 0+1Δ 2.5 1.5 2.5 24.51
3 0+2Δ 3 2 2 26.35
4 0+3Δ 3.5 2.5 1.5 29.47
5 0+4Δ 4 3 1 26.89
6 0+5Δ 4.5 3.5 0.5 19.37
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第1期174
由此判断出最佳发酵条件在 0+3Δ 水平附近，故以
0+3Δ 水平为后续试验的中心点。
2.3 Box-Behnken试验设计及响应面分析
2.3.1 二次回归模型拟合及方差分析 以马铃薯淀
粉、脱脂奶粉和氯化钙 3 个重要因素为自变量，以
埃博霉素 B 产量为响应值。各因素编码水平见表 5，
试验设计及结果见表 6。
表 5 Box-Behnken 试验因素水平及编码
变量（g/L）
代码 水平
未编码 编码 -1 0 1
马铃薯淀粉 x1 X1 3 3.5 4
脱脂奶粉 x2 X2 2 2.5 3
CaCl2 x3 X3 1 1.5 2
X1=（x1-3.5）/0.5，X2=（x2-2.5）/0.5，X3=（x3-1.5）/0.5，Xi 为 编 码 值，xi
为真实值
表 6 Box-Behnken 试验设计及结果
Run X1 X2 X3 埃博霉素 B（mg/L）
1 -1 -1 0 23.79
2 -1 1 0 25.17
3 1 -1 0 30.52
4 1 1 0 26.68
5 0 -1 -1 29.65
6 0 -1 1 28.16
7 0 1 -1 25.36
8 0 1 1 26.23
9 -1 0 -1 24.23
10 1 0 -1 29.37
11 -1 0 1 27.12
12 1 0 1 28.79
13 0 0 0 29.43
14 0 0 0 30.04
15 0 0 0 29.87
根据表 6 中试验结果，利用 SAS 软件对结果进
行二次回归分析，获得的回归方程为 ：
Y=29.78+1.88125X 1-1 .085X 2+0 .21125X 3-
1 . 6 0 6 2 5 X 1 X 1 - 1 . 3 0 5 X 1 X 2 - 0 . 8 6 7 5 X 1 X 3 -
1.63375X2X2+0.59X2X3-0.79625X3X3
对该模型进行方差分析，结果见表 7，模型系
数显著性检验见表 8。
从表 7 中可以看出模型在 α=0.01 水平上回归显
著（Pr>F 小于 0.01）；失拟项（P=0.0889>0.05），失
拟项不显著，因此模型选择正确，复相关系数的平
方 R2 =0.9541，说明模型可以解释 95.41% 试验所得
埃博霉素 B 产量的变化，表明方程拟合较好，试验
结果和预测值之间具有较好的一致性。Y 的变异系
数 CV 表示试验的精确度，CV 值越高，试验的可靠
性越低，本试验中 CV 值相对较低，说明了试验操
作可靠。
回归方程的回归系数显著性检验表明，模型一
次项 X1 极显著，X2 显著 ；二次项 X1X1、X1X2、X2X2
对响应值有显著的影响，且 X1（土豆淀粉）X2（脱
脂奶粉）有交互作用，交互作用显著，说明土豆淀粉、
脱脂奶粉是该发酵过程的重要影响因素。
2.3.2 响应面分析及最佳培养基成分确定 利用
SAS 软件根据回归方程进行响应面分析，绘制响应
面分析图及其等高线图，结果见图 1-3，考察所拟
合的响应曲面的形状，每个响应面分析图分别代表
着两个独立变量之间的相互作用，此时第 3 个变量
保持在中心点水平不变。从其等高线图可以直观看
出两因素的交互作用，等高线的形状反映出交互作
用效应的强弱，圆形表示两因素交互作用不显著，
等高线形状越接近椭圆形表示交互作用越强。
回归方程存在稳定点，即存在极值点（X1，X2，
X3）使得响应变量 Y 取得最大值。通过岭脊分析（ridge
analysis）得到极大值所对应的各主要因素（X1，X2，
表 7 回归方程的方差分析
方差来源 自由度 总方差 均方差 F 值 Pr>F 值
模型 9 68.4908 7.6101 11.5510 0.0075
残差 5 3.2941 0.6588
失拟项 3 3.0959 1.0320 10.4135 0.0889
纯误差 2 0.1982 0.0991
总和 14 71.7849
R2 =95.41%，R2adj =87.15%，变异系数 CV=2.9380
表 8 回归系数的 t 值检验
参数 参数估计 标准误差 t Pr>|t|
X1 1.8813 0.2870 6.5555 0.0012
X2 -1.0850 0.2870 -3.7809 0.0129
X3 0.2113 0.2870 0.7361 0.4947
X1X1 -1.6063 0.4224 -3.8026 0.0126
X1X2 -1.3050 0.4058 -3.2156 0.0236
X1X3 -0.8675 0.4058 -2.1375 0.0856
X2X2 -1.6338 0.4224 -3.8677 0.0118
X2X3 0.5900 0.4058 1.4538 0.2058
X3X3 -0.7963 0.4224 -1.8850 0.1181
2014年第1期 175龚国利等 ：响应面法优化纤维堆囊菌 SoF5-76 产埃博霉素 B 发酵培养基
与验证试验平均值十分接近，说明了试验值和预测
值之间具有良好的拟合性，模型的有效性，同时
与初始发酵培养基产生的埃博霉素 B（14.2 mg/L）
相比产量提高了 1.1 倍。
3 讨论
目前已有一些关于埃博霉素发酵合成的报道。
韩莉莉等［3］采用单因子法研究培养基组成对埃博
霉素产量的影响，使埃博霉素 B 产量达到 7 mg/L
左右，比原始条件提高了 2.88 倍 ；本实验室前期
通过正交实验优化纤维堆囊菌 SoF5-09 产埃博霉素
B 发酵培养基，埃博霉素 B 产量为 27.5 mg/L，提
高了 74%［7］；诸景光等［6］采用响应面法优化埃博
霉素的发酵条件，埃博霉素产量为 14.12 mg/L，提
高了 18%。曹文瑞等［15］通过多步骤响应面法优化
So0157-2 合成埃博霉素营养条件，使埃博霉素 B 产
量达到 82 mg/L，比优化前提高了 7.2 倍，充分表明
了响应面法优化纤维堆囊菌野生菌合成埃博霉素营
养条件的有效可行性。国外则更多的关注埃博霉素
合成基因的易源表达及其临床研究，关于发酵工艺
方面报道较少。Lau 等［16］采用半连续发酵法以及添
加吸附树脂等方法试图提高异源菌株合成埃博霉素
产量 ；Regentin 等［4］对比了本源菌和异源宿主发酵
合成埃博霉素过程中对铵离子、磷酸盐以及铁离子
的耐受程度。然而埃博霉素产量的不稳定性及产量
有待进一步提高的问题仍是目前备受关注的焦点。
由于纤维堆囊菌易受外界环境条件的影响，且表现
出明显的菌株特异性，为了提高纤维堆囊菌 SoF5-
76 发酵产埃博霉素 B 的水平以降低生产成本，本
研究从营养条件着手，在单因素试验的基础上通过
Plackett-Burman 设计从可能影响埃博霉素 B 产量的
9 个因素中筛选出 3 个显著因素，并通过响应面法
对其水平进行了优化，最终得到纤维堆囊菌 SoF5-76
的最佳发酵培养基。在此最优条件下，埃博霉素 B
产量（29.95mg/L）比优化前（14.2 mg/L）提高了 1.1 倍。
横向比较，本试验优化水平还有提高的空间，且本
试验菌株的产量较稳定。得到的优化培养基相比初
始培养基增加了 VB12 和脱脂奶粉两个成分。VB12 作
为生长因子有利于菌体的生长，上述试验表明脱脂
奶粉是影响埃博霉素 B 产量的重要因素，这可能是
25
2
Fixed levels：X3=1.5
3 X1
X2
30
Y
图 1 Y= f（X1，X2）响应面立体分析图
25
1
3 X
1
X3
30
Y
图 2 Y= f（X1，X3）响应面立体分析图
25.6
1
3 X
2
X3
29.6
Y
图 3 Y= f（X2，X3）响应面立体分析图
X3）的编码值分别为（0.747817，-0.57091，-0.33886），
即马铃薯淀粉、脱脂奶粉、无水氯化钙的最佳浓度
为 3.8739 g/L、2.2145 g/L、1.3306 g/L，此时埃博霉
素 B 产量达到最高为 31.1036 mg/L。
2.4 模型的验证
在以上确定的最优条件下进行 3 次平行验证试
验，同时将优化前培养基作为对照。优化培养基埃博
霉素 B 的平均产量为 29.95 mg/L，预测结果 31.1036
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第1期176
因为脱脂奶粉含有一些有利于菌体生长或埃博霉素
B 产生的氨基酸类，氨基酸可以提供大环内酯类抗
生素生物合成过程中所需要的前体物质。据文献报
道［17］，前体氨基酸能促进大环内酯类抗生素合成，
但是没有有关埃博霉素的报道，后续工作将基于埃
博霉素 B 的生物合成途径对埃博霉素 B 的发酵工艺
进一步优化，预期将获得更高的发酵水平。
4 结论
对埃博霉素产量有显著影响的 3 个因素为马铃
薯淀粉、脱脂奶粉和无水氯化钙 ；在此最优条件下，
埃博霉素 B 产量可达到 29.95 mg/L，发酵产量比优
化前提高了 1.1 倍。用响应面法优化纤维堆囊菌产
埃博霉素 B 的发酵培养基是有效可行的。
参 考 文 献
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