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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2013年第5期
Epothilone B 是由德国生物技术研究中心首次
从纤维堆囊菌分离得到的十六元大环内酯类化合
物［1］，该物质能促进微管蛋白聚合，水溶性好，其
活性是紫杉醇的 2 000-3 000 倍［2-4］。目前，美国、
瑞士等国开始从事相关研究，而我国主要是山东大
学、华南理工等机构做了一些相关研究。2007 年
由美国施贵宝公司开发的 Epothilone B 内酰胺衍生
物 Ixabepilone 获得 FDA 批准在美国上市，这是第
一个上市的 Epothilones 衍生物，每毫克大约 70 美
元［5］。目前纤维堆囊菌 So.ce 90 菌的产量低，虽然
收稿日期 ：2012-11-05
基金项目 ：河南科技大学青年科学基金项目（2012QN003）
作者简介 ：王大红，男，博士，讲师，研究方向 ：发酵工程和微生物制药 ；E-mail ：wangdahong2003@163.com
基因组重排选育 Epothilone B 高产菌株
王大红1  刘飞2
（1. 河南科技大学食品与生物工程学院，洛阳 471023 ；2. 南阳师范学院生命科学与技术学院，南阳 473061）
摘 要 : 以纤维堆囊菌 AHB125 经过紫外诱变和 2% 乙酸钠抗性筛选出来的 SC4-14 和 SC4-56 为出发菌株，采用基因组重
排技术选育 Epothilone B 高产菌株，并探索该技术在菌种选育中的基本规律。通过 4 轮基因组重排成功选育出了 5 株遗传稳定的
Epothilone B 高产菌株，其中 1 株重排菌株 F4-28 Epothilone B 产量达到 67.4 mg/L，是原始菌株纤维堆囊菌 AHB125 Epothilone B 产
量的 8 倍，是两亲本菌株 Epothilone B 产量的 4-5 倍，并且 F4-28 的发酵周期比 SC4-56 短 1 d。因此，基因组重排技术可有效的选
育出 Epothilone B 高产菌株。
关键词 : Epothilone B 纤维堆囊菌 AHB125 基因组重排
Breeding of High Epothilone B-producing Strains by
Genome Shuffling
Wang Dahong1 Liu Fei2
（1. College of Food and Bioengineering，Henan University of Science and Technology，Luoyang 471023 ；2. School of Life Science and
Technology，Nanyang Normal University，Nanyang 473061）
Abstract:  The mutation of Sorangium cellulosum AHB125 was induced using the classical UV-mutation method plus selection pressures
of 2% sodium acetate. Two mutants, SC4-14 and SC4-56, were used as original strains to screen and breed high Epothilone B-producing strains
by genome shuffling and explore the basic rule of genome shuffling in strain breeding. Five hereditarily stable strains with high Epothilone B
production were obtained after four cycles of genome shuffling. Strain F4-28 yielded 67.4 mg/L of Epothilone B, which was 8-fold higher than that
of the initial strain S. cellulosum AHB125 and 4 to 5-fold higher than the mutants used as the original strains for genome shuffling. In addition,
the fermentation period of F4-28 was one day shorter than that of SC4-56. The technique of genome shuffling was an efficient method to screen
and breed high Epothilone B-producing strains.
Key words:  Epothilone B Sorangium cellulosum AHB125 Genome shuffling
在发酵过程中通过补料方式或不断更新吸附树脂可
以提高 Epothilones 类似物的产量，但是毫克级的产
量给 Epothilones 的开发及应用带来了很大困难［6］。
因此，菌种的筛选、选育及发酵条件的探索仍然是
Epothilone B 研究者需要研究的重点目标之一。
基因组重排（genome shuffling）是一种基于原
生质体融合，并对原生质进行递推式融合的新型体
内分子育种方法。2002 年，Zhang 等［7］首次系统地
提出了基因组重排的概念并成功地将该技术运用于
快速提高弗氏链霉菌合成泰乐菌素的能力。随后，
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第5期156
Gendy 等［8］采用基因组重排技术选育绫霉素的产生
菌 Nocardia sp. ALAA 2000，选育后绫霉素比起始菌
株提高了 19 倍。Xu 等［9］利用该技术使 Trichoderma
viride 产纤维素酶的能力提高了 1.97 倍。随着基因
组重排技术的不断发展和成熟，通过基因组重排提
高代谢产物产量的例子不断出现，表明该项技术作
为新代谢产物开发的途径具有一定的应用前景。本
研究旨在采用基因组重排技术改良 Epothilone B 产生
菌，选育出高产 Epothilone B 的优良变异菌株，研究
结果具有一定的理论和实际意义。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌株 亲本菌株 SC4-14 和 SC4-56 是由纤维
堆囊菌 AHB125（S. cellulosum AHB125）经过紫外诱
变和 2% 乙酸钠抗性筛选出来并保存的 Epothilone B
高产菌株［10］。
1.1.2 培养基和溶液 斜面培养基、种子培养基和
发酵培养基参见参考文献［10］。
再生固体培养基（g/L）：蔗糖 171.5，MgCl2 4.273，
酪 胨 3.0， 酵 母 浸 膏 1.0，CaCl2 1.0， 琼 脂 粉 16.0，
pH7.2-7.4。
HEPES 缓 冲 液 ：HEPES 20 mmol/L，MgCl2 20
mmol/L，蔗糖 0.5 mol/L，pH6.8，灭菌备用。
溶菌酶溶液 ：称取 0.1 g 溶菌酶，加入 HEPES
缓冲液溶解并定容至 10 mL，过滤除菌，4℃保存，
使用时稀释。
35% PEG4000 溶 液（W/V）：PEG4000 定 容 于
100 mL HEPES 缓冲液。
1.2 方法
1.2.1 Epothilone B 的 发 酵 与 测 定 Epothilone B 的
发酵与测定见参考文献［10］。Epothilone B 的测定
采用 HPLC 法，通过 Epothilone B 的保留时间和光
吸收曲线对基因组重排后的高产菌株发酵产物中的
Epothilone B 进行定性。
1.2.2 原生质体的制备及再生 菌体培养至对数生
长期（48 h）时，加入终浓度为 0.01 mol/L EDTA 和
1% 甘氨酸，继续培养 4 h，取一定量培养好的菌液，
1 000 r/min 离心 5 min，取上清液 5 000 r/min 再离心
10 min 并收集菌体，HEPES 缓冲液洗涤 2 次，将菌
体保存在 5 mL HEPES 缓冲液中。然后加入溶菌酶
液并混匀，使其终浓度为 5 mg/mL，37℃水浴保温
酶解破壁 1 h，定时镜检。酶解后，3 000 r/min 离心
10 min 并收集原生质体，用等体积的 HEPES 液重悬，
振荡混匀，离心弃上清，再用 HEPES 液洗涤 1 次，
等体积重悬，与冷却至 45℃左右的上层再生固体培
养基混匀，倾入已孵育过夜的再生固体培养基上，
30℃培养 5-7 d，观察再生情况。
1.2.3 原生质体的灭活 紫外线灭活 ：将原生质体
溶液移入无菌培养皿中，置于已预热稳定的 15 W 紫
外灯下，垂直距离为 30 cm，分别照射 60、70、80、
90、100、110 和 120 s 进行灭活，经 HEPES 缓冲液
10 倍系列稀释后，涂布于再生平板上，30℃避光培
养 5-7 d，检查灭活效果。
热灭活 ：将原生质体溶液置于无菌离心管中，
置于温度分别为 55、60、65 和 70℃水浴锅中，保
温 10、15、20、25 和 30 min 进行灭活，经 HEPES
缓冲液 10 倍系列稀释后，涂布于再生平板上，30℃
避光培养 5-7 d 后，观察结果，检查灭活效果。
1.2.4 基因组重排 对亲本株 SC4-14 的原生质体进
行热灭活，对亲本株 SC4-56 的原生质体进行紫外
灭活，将灭活的原生质体用 35% PEG4000（含 0.02
mol/L CaCl2）在 37℃条件下随机融合 20 min。然后
用 5 倍体积的 HEPES 缓冲液稀释，并 3 000 r/min 离
心 5 min，收集原生质体后稀释并涂布于再生培养基
上再生，30℃培养 3-7 d，全部再生菌落即为 F1 代
融合菌群 ；将生长旺盛的融合子菌落转接到液体培
养基中，培养 24 h，检测发酵液中 Epothilone B 的
含量，产量提高的突变株为第 1 轮融合株 F1，再将
产量较高的优良菌株（F1）进行下一轮原生质体制
备、灭活、融合与筛选，所得突变株即 F2。如此
反复进行 4 轮循环原生质体融合、再生，不同融合
子代标记为 F1、F2、F3 和 F4，同时以原始菌株做
对照。
1.2.5 突变菌株遗传稳定性的测定 将生产能力较
高的几株菌接种至固体培养基中传代 10 次并进行发
酵试验，检测 Epothilone B 的含量，选择遗传稳定性
较好、产量稳定的重组菌株作为高产重组菌株。
1.2.6 发酵过程曲线的测定 将亲本菌株与基因重
排后的菌株种子液以 10% 接种量接种于发酵培养基，
2013年第5期 157王大红等 ：基因组重排选育 Epothilone B 高产菌株
分别于发酵的第 1、2、3、4、5、6、7 和 8 天取样，
分别测定其菌体生长曲线和 EpothiloneB 含量，绘制
其发酵过程曲线。其中生长曲线采用分光光度计测
定在 OD600 下的吸光值，EpothiloneB 含量测定采用
HPLC 法。
2 结果
2.1 原生质体的制备和再生
在试验过程中需要对原生质体制备的影响条件
进行考察。经过前期的研究确定溶菌酶最终质量浓
度为 4 mg/mL、酶解温度为 37℃、酶解时间为 60
min，在此条件下原生质体的形成率和再生率最高。
2.2 原生质体灭活
2.2.1 热灭活原生质体 从表 1 可见，当菌株 SC4-
14 原生质体在 70℃恒温水浴中处理 20 min 时，原生
质体致死率达到 100%。但当温度超过 65℃时，原
生质体容易黏结成团，不利于原生质体的融合。因此，
本试验确定 60℃、处理 25 min 作为 Epothilone B 产
生菌原生质体热灭活的条件。
2.3 基因组重排
为获得更多重排的正突变基因组合，选用两
个 亲 株 SC4-14 和 SC4-56 作 为 基 因 重 排 的 出 发 亲
本， 这 2 个 亲 本 是 由 S. cellulosum AHB125 经 过 紫
外诱变和 2% 乙酸钠抗性筛选而获得的。经过 4 轮
基因组重排试验后，获得 62 株生长速度较快的菌
株，对得到的重排菌株进行产量测定，得到 8 株产
量相对较高的重组菌株。从图 2 中可以看出，原
始菌株 S. cellulosum AHB125 Epothilone B 的产量为
8.2 mg/L，制备原生质体的两株亲本菌株 SC4-14 和
SC4-56 的 Epothilone B 产量分别为 13.6 mg/L 和 14.5
mg/L。获得的 8 株高产菌株其 Epothilone B 的产量
都是 SC4-14 和 SC4-56 菌株的 2 倍以上，并且菌落
形态和颜色与起始菌株相比没有发生明显变化。其
中 F4-13（58.8 mg/L） 和 F4-28（67.4 mg/L）的产量
最高，Epothilone B 的产量是 SC4-14 菌株产量的 4.3
倍和 5.0 倍，是 SC4-56 菌株产量的 4.1 倍和 4.6 倍，
是原始菌株纤维堆囊菌 AHB125 Epothilone B 产量的
8 倍。
表 1 热灭活时间和温度对 SC4-14 原生质体致死率的影响
热灭活温度（℃）
热灭活时间 （min）
10 15 20 25 30
55 12.3% 25.2% 47.3% 65.6% 88.5%
60 37.2% 56.4% 83.3% 100% 100%
65 52.6% 70.8% 100% 100% 100%
70 79.5% 92.1% 100% 100% 100%
2.2.2 紫外线灭活原生质体 从图 1 可以看出，当
紫外线照射 SC4-56 的原生质体时间为 110 s 时，原
生质体致死率为 100%。因此，选用紫外线照射 110
s 作为 Epothilone B 产生菌原生质体紫外灭活的处理
时间。
0
20
40
60
80
100
60
㠤↫
⦷%

ᰦ䰤s70 80 90 100 110 120
图 1 紫外线灭活时间对 SC4-56 原生质体致死率的影响
0
10
20
30
40
50
60
70
80
AH
B1
25
㧼Ṛ㕆ਧS
C4
-14
SC
4-5
6
F4
-6
F4
-13
F4
-25
F4
-28
F4
-31
F4
-39
F4
-45
F4
-56
Ep
ot
hi
lo
ne
B
ӗ䟿
mg
/L

图 2 基因组重排筛选结果
2.4 遗传稳定性试验
将筛选出的 8 株高产菌株连续传代 10 次后，进
行摇瓶发酵试验，以摇瓶的产量作为筛选的指标，
结果（表 2）显示，传代后的菌株发酵产量没有明
显下降，表明筛选到的重排菌株的高产性状遗传特
性较稳定。F4-6、F4-45 和 F4-56 的产量有明显下降，
其遗传稳定性差 ；而其它 5 株的遗传性稳定性较好，
其中 F4-28 的产量最高，Epothilone B 的产量一直稳
定在 67 mg/L 左右。
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第5期158
2.5 菌株SC4-56和F4-28在10 L发酵罐中的发酵过
程比较
将亲本菌株之一 SC4-56 和重排菌株 F4-28 在 10
L 发酵罐上分别进行发酵试验，其发酵过程曲线如
图 3 所示。两种菌株在发酵过程中的生长曲线大致
相似，都在第 3 天达到菌体的最大值，但重排菌株
F4-28 的细胞密度要大于亲本菌株，并提前进入衰亡
期。在 Epothilone B 积累过程中，两者在发酵罐中的
产量都比在摇瓶中要高约 10%，SC4-56 在第 6 天产
物达到最大值（18.5 mg/L），而 F4-28 在发酵的第 5
天达到最大值（75.2 mg/L），比亲本菌株的发酵周期
要短 1 d。因此，重排菌株 F4-28 在发酵生产上更易
于提高发酵罐的利用效率。
突变的积累等缺点，很难大幅度提高 Epothilone B
产量 ；而由于黏细菌的特殊性，通过基因工程提高
Epothilone B 的方法很少被研究［11］。基因组重排技
术是一种多亲本递归式原生质体融合技术，亲本菌
株在全基因组的不同位置上同时发生重组，发生多
交换和多基因重组，最终使不同的正向基因重组到
同一个细胞株中，因此相对容易大幅度提高目的产
物的产量，是改善工业微生物表型的直接而有效的
方法［12］。另外，尤其适用于微生物的代谢途径、编
码生物合成酶的基因以及基因表达调控的机制不清
楚的代谢产物。与传统的理化诱变方法相比，基因
组重排技术可更快速、高效地筛选出表型优良的菌
株，且在筛选库的建立过程中剔除了负突变，弥补
了经典诱变方法负突变的缺陷［13］。
本研究中采用热灭活和紫外灭活两种方式处
理原生质体，然后再融合，这样避免了同种灭活方
式造成的相同部位发生损伤的缺陷，使不同菌株间
染色体不同部位的致死损伤可以得到互补，从而提
高了重组的效率。本研究首次尝试采用基因组重排
技术改良纤维堆囊菌 AHB125，获得一株遗传性能
稳定的高产菌株 F4-28，Epothilone B 的产量达到了
67.4 mg/L，是原始菌株纤维堆囊菌 AHB125 的 8 倍，
是两亲本菌株 SC4-14 和 SC4-56 的 5 倍。因此，采
用基因组重排技术是一种有效的提高 Epothilone B
产量的方法。虽然本研究取得了很大的进步，但是
Epothilone B 的产量与目前已报道菌株 S. cellulosum
So0157-2 的产量（104 mg/L）相比还有较大差距［14］。
这主要是因为本研究所用的菌株来源与其不同，纤
维堆囊菌 AHB125 是由本实验室研究人员从自然界
菌株
传代次数
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
F4-6 49.8 50.3 48.5 42.4 40.6 37.1 35.5 21.6 13.4 10.6
F4-13 575.2 59.4 57.3 63.6 62.7 60.1 60.8 57.5 58.8 57.3
F4-25 51.6 52.5 52.7 52.5 53.8 54.2 52.8 51.6 53.5 51.8
F4-28 66.8 67.5 65.2 66.2 68.4 64.2 65.5 71.2 70.8 65.3
F4-31 45.3 47.8 45.5 46.2 46.9 46.7 47.2 45.7 46.8 46.0
F4-39 45.4 46.6 46.3 47.4 45.5 45.8 47.2 46.8 46.2 45.8
F4-45 41.3 41.6 36.3 32.6 20.5 13.2 11.1 11.8 12.2 13.5
F4-56 39.4 30.2 25.7 15.1 12.9 12.4 11.6 11.4 12.9 11.0
表 2 重组菌株的 Epothilone B 产量（mg/L）
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
1.4
1.6
0 ਁ䞥ᰦ䰤d
0
10
20
30
40
50
60
70
80
O
D
60
0
Ep
ot
hi
lo
ne
B
(m
g/
L)
1 2 3 4 5 6 7 8 9
-△- ：SC4-56 的 OD600 值 ；-▲- ：F4-28 的 OD600 值 ；-□- ：SC4-56 Epothilone
B 产量 ；-■- ：F4-28 Epothilone B 产量
图 3 SC4-56 和 F4-28 在 10 L 发酵罐中的发酵过程曲线
3 讨论
采用物理、化学方法来提高 Epothilone B 产量
的传统诱变育种方法存在诱变效率低、筛选工作量
大、周期长、重复诱变过程造成一些无关的或负向
2013年第5期 159王大红等 ：基因组重排选育 Epothilone B 高产菌株
中分离并鉴定的，其初始产量很低，并且前期的菌
种选育研究的较少，而 S. cellulosum So0157-2 已经
过多次诱变。因此，在下一步的工作中，应该把基
因组重排与其它诱变育种技术联合使用，Epothilone
B 的产量可能会更高。同时，本研究也再次证明了
基因重排技术在菌种选育中的有效性及高效性，同
时为应用该技术选育高产 Epothilone B 菌株和研究
Epothilone B 的代谢调节奠定了基础。
4 结论
采用基因组重排的方法对 Epothilone B 产生菌
纤维堆囊菌 SC4-14 和 SC4-56 进行菌株选育，获得 5
株目标物质产量较高并且遗传性能稳定的变异菌株，
其中最优菌株 F4-28 的 Epothilone B 产量达到了 67.4
mg/L，是两亲本菌株 SC4-14 和 SC4-56 的 5 倍，通
过比较该菌株与亲本菌株之一 SC4-56 的发酵过程，
F4-28 的 Epothilone B 产量在第 5 天达到最大值，比
SC4-56 的发酵周期少 1 d，可以缩短发酵周期。
参 考 文 献
［1］ Gerth K, Bedorf N, Hofle G, et al. Epothilones A and B ：
antifungal and cytotoxic compounds from Sorangium cellulosum
（Myxobacteria）：production, physico-chemical and biological
properties ［J］. Journal Antibiotics, 1996, 49（3）：560-563.
［2］ Whitney H, Juwen D, Quincy Q. The microtubule inhibiting
agent epothilone B antagonizes glioma cell motility associated
with reorganization of the actin-binding protein α-actinin 4 ［J］.
Oncology Reports, 2011, 25（3）：887-893.
［3］ Kumar A, Heise H, Blommers M, et al. Interaction of Epothilone B
（Patupilone） with microtubules as detected by two-dimensional
solid-state NMR spectroscopy ［J］. Angewandte Chemie, 2010, 49
（41）：7504-7507.
［4］ Danishefsky S. On the potential of natural products in the discovery
of pharma leads ：A case for reassessment ［J］. Natural Product
Reports, 2010, 27 ：1114-1116.
［5］ Harichand-Herdt S, O’Regan RM. Identifying subsets of metastatic
breast cancer patients likely to benefit from treatment with the
Epothilone B analog Ixabepilone ［J］. American Journal of Clinical
Oncology, 2010, 33（6）：561-567.
［6］ Frykman S, Tsuruta H, Lau J, et al. Modulation of epothilone
analog production through media design ［J］. Journal of Industrial
Microbiology Biotechnology, 2002, 28（1）：17-20.
［7］ Zhang YX, Perry KA, Vinci V, et al. Genome shuffling leads to rapid
phenotypic improvement in bacteria ［J］. Nature, 2002, 6872 ：
644-646.
［8］ Gendy M, Bondkly A. Genome shuffling of marine derived bacterium
Nocardia sp. ALAA 2000 for improved ayamycin production ［J］.
Antonie van Leeuwenhoek, 2011, 99（4）：773-780.
［9］ Xu F, Jin H, Li H, et al. Genome shuffling of Trichoderma viride for
enhanced cellulase production ［J］. Annals of Microbiology, 2012,
62（2）：509-515.
［10］ 王大红 , 原江锋 , 郭文杰 . 产 Epothilone B 纤维堆囊菌的选育
与发酵优化［J］. 生物技术 , 2012, 22（3）：70-72.
［11］ Julien B, Shah S. Heterologous expression of epothilone biosynthetic
genes in Myxococcus xanthus ［J］. Antimicrobial Agents and
Chemotherapy, 2002, 46（9）：2772-2778.
［12］ Petri R, Claudia SD. Dealing with complexity ：evolutionary
engineering and genome shuffling ［J］. Current Opinion in
Biotechnology, 2004, 15（4）：298-304.
［13］ 张旭 , 张惠文 , 徐明恺 . 基因组重排技术选育乳链菌肽高产菌
株［J］. 中国生物制品学杂志 , 2010, 23（10）：1065-1073.
［14］ Gong G, Sun X, Liu X, et al. Mutation and a high-throughput
screening method for improving the production of Epothilones of
Sorangium ［J］. Journal of Industrial Microbiology Biotechnology,
2007, 34（9）：615-623.
（责任编辑 马鑫）