全 文 ：May2008
· 52·
生物加工过程
ChineseJournalofBioprocessEngineering
第6卷第3期
2008年5月
响应面法优化福鸽霉素发酵培养基
董国秀，陶文沂
(江南大学 工业生物技术教育部重点实验室，无锡214122)
摘要：采用Plackett．Burman设计法，对影响纤维堆囊茵SoceMWXAB一125产生福鸽霉素的9个因素进行了筛选。
结果表明，影响该茵产生福鸽霉素的主要营养因素为马铃薯淀粉、CaCI：和脱脂奶粉。在此基础上，采用响应面法对其
中3个显著因子的最佳水平范围进行研究，利用Design-Expert软件进行二次回归分析得知，马铃薯淀粉、CaCl：和脱脂
奶粉的质量浓度分别为8．05、2．72和lO．00∥L时，福鸽霉素的产量从67叫r／L提高到119．98ms／L。
关键词：发酵；福鸽霉素；响应面法；纤维堆囊茵
中图分类号：Q815 文献标识码：A 文章编号：1672—3678(2008)03—0052—05
Optimizationofmediumforphoxalonefermentationby
responsesurfacemethodology
DONGGuo-xiu，TAOWen—yi
(KeyLaboratoryofIndustrialB otechnologyofMinistryofEducation，
JiangnanUniversity，Wuxi214122，China)
Abstract：Plackett—Burmandesignwassedtoevaluatetheffectofninefactorsrelatedophoxalonefer-
mentationbySorangiumcellulosum．Bystatisticregressionanalysis，theignificantfactorsaffectingphox-
alonef rmentationwerep tatostarch，CaCl2andskimmilk．Responsesurfacem thodologywasusedto
optimizethethreefactorsandfindoutherelationshipsamongthefactors．ByusingDesign-Expeastatis-
ticmethodsthequadraticregressionmodelquationwasolvedandtheoptimalconcentrationsofthevari—
ablesweredetermined鹊：potatostarch8．05s／L，CaCl22．72s／L，andskimmilk10．00s／L．The
yieldofphoxalonewasincreasedfrom67to119．98ms／L．
Keywords：fermentation；Phoxalone；responsesurfacemethodology；Sorangiumcellulos m
近年来，从粘细菌各个属的代谢产物中均发现了
具有生物活性的新物质，其中20世纪90年代初期
Reichenbach等⋯报道从粘细菌纤维堆囊菌Soce90的
发酵产物中分离出新的16元环大环内酯Epothilones。
体外细胞毒性实验表明，其活性是紫杉醇的2000—
3000倍，引起了生物学家和药物学家广泛重视旧J。
福鸽霉素(Phoxalone)是从纤维堆囊菌Soce次
生代谢产物中分离纯化出来的，结构为1，7，12，13一
四羟基一14．甲氧基-8，10一二甲基一6一苯基-5，15．二氧．
双环9，3，1十五烷4一酮，它对多个肿瘤细胞模型具
有很高的抗癌活性，同时对人正常肝细胞具有较低
的毒性。
采用Plackett—Burman设计，筛选出对微生物合
成福鸽霉素起显著作用的培养基成分，旨在通过
收稿13期：2007-08-24
作者简介：董国秀(1982一)，女，山东东营人，硕士研究生，研究方向：微生物制药。
联系人：陶文沂，教授，博士生导师，E-mail：wyta01946@163．eA)m
万方数据
2008年5月 董国秀等：响应面法优化福鸽霉素发酵培养基 -53·
Box．Behnken响应面设计对发酵培养基进行优化，
以提高福鸽霉素产量，为进一步研究打下基础。所
有实验设计、数据处理及模型建立皆采用Design-
Expert软件进行。
1材料与方法
1．1实验菌株
纤维堆囊菌SoceMWXAB一125，本实验室分离、
保藏，编号为No．2047。
1．2培养基和培养条件
1．2．1培养基
种子培养基(g／L)：马铃薯淀粉10．0，葡萄糖
2．0，酵母粉2．0，脱脂奶粉4．0，CaCl21．0，MgS04·
7H，O1-0，Fe(Ⅲ)一Na．EDTA0 008；
发酵培养基(g／L)：马铃薯淀粉10．0，葡萄糖
2．0，酵母粉2．0，脱脂奶粉4．0，CaCl21．0，MgSO．·
7H201．0，Fe(11I)．Na—EDTA0．008，XAD一16大孔树
脂20．0，甘油5．O。
Plackett．Burman实验发酵培养基按照表l配
制，pH为7．4。
响应面实验发酵培养基按照表2配制。
1．2．2培养方法
种子液培养72h后，以体积分数10％的接种量
接人盛有50mL发酵培养基的三角瓶中，于30℃、
160r／min摇床上培养7d。
1．3福鸽霉素含量测定
采用高效液相色谱(HPLC)法，色谱条件：惠普
1 100系列，采用AgilentXDB．C18色谱柱，流动相为
甲醇与水混合物(y(甲醇)：y(水)=65：35)，柱温
为25℃，波长为254nm，流速1．0mL／min，进样量
5斗L。用福鸽霉素纯品作对照。
1．4实验设计
1．4．1 Plackett—Burman实验设计
Plackett．Bunnan设计法口1是一种两水平的实验
设计方法，通过Ⅳ次实验至多可研究(Ⅳ一1)个变量
(Ⅳ一般为4的倍数)，每个因素取高低两个水平，对
某个因素高低水平的差值不能过大，以防掩盖了其他
因素的重要性H]。本实验中设定高水平为低水平的
2倍。本实验根据发酵培养基配方的9种组分进行
12次实验(N=12)。该实验的实验设计、数据分析及
模型建立均采用Design—Expert软件进行，响应值为福
鸽霉素产量。自变量、编码和水平因素见表1。
表1 Plackett．Burman实验因素水平及编码
TableThetwolevelsofvariablesus dinthe
Plackett—Burmandesign
1．4．2响应面实验设计
响应面方法是多变量系统寻优的试验策略。
首先确定对发酵最可能具有影响的营养和培养条
件，然后用Placer—Burman或部分因子设计进行筛
选，去掉对发酵影响不显著的因素，对保留的因素
用响应面方法进行优化，建立的模型(通常为二次
多项式)用于预测获得最大期望响应的水平。响应
面方法已成功应用于许多生物过程培养基和操作
条件的优化【4曲J。
筛选出影响产生福鸽霉素的关键影响因子后，
采用Box—Behnken设计法，对其关键因子进行迸一
步研究，以获得影响该菌产福鸽霉素的最佳培养
基。由Plackett．Burman实验结果可知，关键因子为
马铃薯淀粉、CaCl：和脱脂奶粉，因此在该阶段将这
3个因子作为考虑变量，每个因素取3个水平，以
(一1，0，1)编码，见表2。
表2 Box．Behnken实验因素水平及其编码
Table2 Levelsofvariablesus dinthe
Box—Behnkendesign
1．4．3验证实验‘4】
每个实验均进行2次，对应的响应值取2次实
验结果的平均值。
万方数据
·54· 生物加工过程 第6卷第3期
2结果与讨论
2．1 影响产生福鸽霉素的关键因素的确定
利用Design．Expert软件对Plackett—Burman实
验结果进行方差分析，结果见表3。一般的，Pr>F
值小于0．05表明模型或参数有显著影响。由表3
中可以看出，模型Pr>F值为0．0258<0．05，表明
模型显著。其中马铃薯淀粉、葡萄糖、CaCl：、
MgSO。·7H：O、脱脂奶粉和甘油是有意义的模型参
数(Pr>F值均小于0．05)。根据影响度(Effect)和
模型贡献率(Contribution％)综合评价，选取3个具
有正效应的重要因子：马铃薯淀粉、CaCl：和脱脂奶
粉。本实验将通过响应面分析法作进一步的研究。
表3 Plackett—Burman实验各因素的影响效果
Table3 Screeningof mportantfactorsforPhoxalone
productioninthePlackett-Burmandesign
2．2响应面优化产生福鸽霉素的培养基
2．2．1二次回归模型拟合及方差分析
由Plackett—Burman实验结果知，马铃薯淀粉、
CaCl：和脱脂奶粉对响应值的作用较为突出，因此
Box—Behnken响应面设计被用来考察该3个因子的
相互作用和最佳水平。各因子设定水平及编码值
列于表2中，实验设计及结果见表4。
实验数据使用Design．Expea软件进行二次回
归分析，得到以下方程
YPhoxM。。=+118．06—1．94Xl+4．33蜀+5．47瓦一
&∞五五+1257五五+17．915五瓦一
16．38研一13．67置一14．30冠
式中置、五和瓦分别代表马铃薯淀粉、CaCI：和脱
脂奶粉。
通过进行方差分析来验证模型及各参数的显
著度见表5。
表4 Box—Behnken实验设计表及其实验结果
Table4 Box-Behnkenexperimentsd signmamx
andresultsofPhoxaloneproduction
表5响应面方差分析
Table5 ANOVAofRSAforPhox,doneproduction
万方数据
2008年5月 董国秀等：响应面法优化福鸽霉素发酵培养基 ·55·
从方差分析可以看出，模型Pr>F值小于
0．0001，表明该模型是高度显著的。同时模型中
的参数x2，x3，xi，x；，x；，xlx2，xlx3，x2x3都是
显著的(Pr>F值小于0．05)。模型失拟项(Lack
ofFit)表示模型预测值与实际值不拟合的概
率¨0|。表5中模型失拟项Pr>F值为0．12020>
0．05，因此模型失拟项不显著，说明模型中不需要
引入更高次数的项，模型选择合适。同时，模型的
相关系数尺2为0．9799，大于0．9，模型拟合程度
很好。变异系数反映模型的置信度，变异系数越
低模型的置信度越高，本实验的变异系数为
4．21％，说明模型方程能够很好地反映真实的实
验值。所以，可以使用该模型来分析响应值的
变化。
产
■
●
旦X
懈
瓣
疆
赠
鲫
牝 2
．F●
2．2．2响应面交互作用分析与优化
为了进一步研究相关变量之间的交互作用以
及确定最优点，通过Design．Expert软件绘制响应面
曲线图来进行直观的分析，见图1—3。图l一3分
别显示了3组以福鸽霉素产量为响应值的趋势图，
从等高线图可以直观地反映出两变量交互作用的
显著程度。图1—3中等高线均呈椭圆形，表明各图
中两因素交互作用显著。
从图1-3及软件分析，得到福鸽霉素产量预测值
最大时的组分质量浓度：马铃薯淀粉8．05∥L，CaCl：
2．72g／L，脱脂奶粉10．00g／L，预测值为120．46mg／L。
在优化条件下对实验结果进行验证实验，得到
福鸽霉素的产量为119．98mg／L，与理论预测值基
本吻合，这表明模型是合理有效的。
4 6 8 10 12
p(马铃薯淀粉)／(g·L-1)
图1 马铃薯淀粉与CaCl：交互影响福鸽霉素的曲面和等高线
Fig．1ResponsesurfaceplotandcontourplotoftheffectsofpotatostarchandCaCl2On山ePhoxaloneproduction
，
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P(马铃薯淀粉)他-L-1)
图2马铃薯淀粉与脱脂奶粉交互影响福鸽霉素的曲面和等高线
Fig．2Responsesurfaceplotandcontourplot0ftlleffectsofportostarchandskimmilkonthePhoxfloneproduction
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万方数据
· 56· 生物加工过程 第6卷第3期
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p(CaCl：)／(g‘L-‘)
图3 CaCI：与脱脂奶粉交互影响福鸽霉素的曲面和等高线
Fig．3ResponsesurfaceplotandcontourplotoftheffectsofCaCl2andskimmilkonthePhoxaloneproduction
3结论
培养基的组成、浓度会影响到微生物的生长与
代谢产物的积累。为了提高福鸽霉素产率，该研究
首先采用Plackett．Burman设计对福鸽霉素生物合
成影响的诸多因子进行了评价，实验表明马铃薯淀
粉、CaCl：、脱脂奶粉对福鸽霉素合成均有促进作用。
在Plackett—Burman实验基础上，采用Box．Be．
hnken实验设计，通过响应面法对主要影响因子进
行优化与评价，得到影响福鸽霉素的二次多项式回
归模型，利用统计学方法对该模型进行显著性检
验，在马铃薯淀粉、CaCl：、脱脂奶粉质量浓度分别为
8．05、2．72、10．00g／L时，可得到最大福鸽霉素产
量，预测值为120．46mg／L，在此条件下对实验结果
进行验证实验，得到福鸽霉素的产量为
119．98ms／L，与理论预测值基本吻合，与优化前福
鸽霉素产量67ms／L相比提高显著。由此可见，应
用响应面法进行优化不仅经济有效，而且科学合理。
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