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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2013年第10期
在自然环境中，当一种微生物感知到异己微生
物信号分子时，为适应外界环境变化常会做出一些
应答反应，如开始合成或加速合成某种代谢产物、
形成生物膜或子实体等［1］，以维持种群的生存优
势。利用微生物的这种种间相互作用（interspecies
interactions），引入异己微生物通常可以诱导微生物
的代谢调控。Pérez 等［2］研究报道，当天蓝色链霉
菌（Streptomyces coelicolor）和黄色黏球菌（Myxococcus
xanthus）固态共培养时，捕食性的黄色黏球菌可诱
收稿日期 ：2013-03-31
基金项目 ：山东省科技发展计划（2012GSF12107）
作者简介 ：李亚伟，女，硕士研究生，研究方向 ：生物制药工程 ；E-mail ：lyw10431@163.com
通讯作者 ：刘新利，男，博士，教授，研究方向 ：微生物资源开发 ；E-mail ：vip.lxl@163.com
诱导纤维堆囊菌高产埃博霉素的种间
微生物筛选及鉴定
李亚伟 赵林 郝永伟 唐秀丽 杨继坤 高玉振 刘新利
（齐鲁工业大学，济南 250353）
摘 要 ： 微生物之间存在相互作用，引入异己微生物通常可以诱导某微生物的代谢调控。筛选到一株能促进纤维堆囊菌高
产埃博霉素的微生物，鉴定为烟曲霉 Aspergillus fumigatus M03。该菌株的有机粗提物可以诱导纤维堆囊菌埃博霉素 A 和 B 的产量
分别提高 72.3% 和 59.7%，其适量菌体水相粗提物也有相同的诱导作用，使埃博霉素 A 和 B 的产量分别提高 25.6% 和 24.7%。该
菌株的菌体水相粗提物高温失活后对埃博霉素合成的诱导作用消失，添加浓度增加时出现抑制作用。该菌株发酵液对埃博霉素的
合成没有促进作用，且随着浓度的增加抑制作用增强。
关键词 ： 种间相互作用 诱导 代谢调控 烟曲霉 纤维堆囊菌 埃博霉素
Screening and Identification of Interspecies Microorganisms Inducing
Overproduction of Epothiones in Sorangium cellulosum
Li Yawei Zhao Lin Hao Yongwei Tang Xiuli Yang Jikun Gao Yuzhen Liu Xinli
（Qilu University of Technology，Ji’nan 250353）
Abstract: Introducing other microorganisms generally can induce microorganisms to regulate their metabolism which is based on
interspecies interactions. This research screened a strain of fungus named as Aspergillus fumigatus M03 that can induce Sorangium cellulosum to
overproduce epthilones. The yields of epothilone A and B can be enhanced 72.3% and 59.7% respectively by the organic crude extracts from A.
fumigatus M03. Appropriate amount of its intracellular aqueous crude extracts also can improve the yields of epothilone A and B each by 25.6%
and 24.7%, whereas the capability of improving disappears when the crude extracts are dealt with high-temperature, and inhibition of epothilones
biosynthesis will show when the concentration of the crude extracts is high in fermentation broth of Sorangium cellulosum. The fermentation broth
of A. fumigatus M03 does not promote biosyntheses of epothilones, but tends to inhibit them as the concentration increases.
Key words: Interspecies interactions Induction Metabolic regulation Aspergillus fumigatus Sorangium cellulosum Epothilones
导天蓝色链霉菌产生更多的次级代谢产物放线紫红
素，并促使其孢子分化发育成菌丝体；液态共培养时，
黄色黏球菌可促进天蓝色链霉菌放线紫红素的合成
量达其单独培养时的 20 倍之多。Qian 等［3］研究发现，
当杂色云芝（Trametes versicolor）和黄孢原毛平革菌
（Phanerochaete chrysosporium）固体共培养时，其相
互作用区域杂色云芝的漆酶产量和粗酶提取物对苯
并芘的氧化活性都比单独培养时显著增高。
埃博霉素（epothilones）是由纤维堆囊菌（Sor-
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第10期138
angium cellulosum）产生的大环内酯类次级代谢产
物，具有良好的抗肿瘤活性，是一种优异的新型广
谱抗癌药物［4］。纤维堆囊菌代时长达 16 h，较难培养，
埃博霉素产量目前较低［5-7］。为了提高埃博霉素的
产量，生产菌株的诱变选育［8］、Genome shuffling 选
育［9］、发酵条件优化［10］以及埃博霉素基因簇的异
源表达［7，11］等传统方法已有了相关报道，但是对埃
博霉素的产量提高仍没有达到工业化生产的要求。
纤维堆囊菌是黏细菌中具有丰富次级代谢产物
的一个属，自然生境中其表达次级代谢产物的种类
和数量往往与其受到何种外界刺激有关。本研究模
拟自然环境选取多种微生物，以它们的代谢产物粗
提物刺激纤维堆囊菌，考察它们对纤维堆囊菌合成
埃博霉素的影响，以期基于微生物的种间相互作用
寻找到刺激埃博霉素高产的物质，为进一步研究埃
博霉素的合成代谢调控奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌株 纤维堆囊菌 So. 2131 及其它供试菌均
由本实验室保藏。
1.1.2 试剂和仪器 乙酸乙酯（天津大茂）、甲醇（天
津四友）；恒温摇床（太仓市实验设备厂）、高速离
心机（长沙湘鹰）、旋转蒸发仪（郑州长城科工贸有
限公司）、超净工作台（苏州净化）、数显鼓风干燥
箱（上海精宏）、高液相色谱仪（日本岛津）、PCR
仪（美国 ABI）。
1.1.3 培养基 PDA 培养基：马铃薯 200 g；蔗糖 20 g；
琼脂 15 g（发酵培养基不添加）；马铃薯去皮后切成
块，煮沸 30 min，8 层纱布过滤后取滤液，最后用
蒸馏水定容至 1 000 mL，自然 pH 值。121℃、1.01×105
Pa 灭菌 30 min。纤维堆囊菌发酵培养基（EPM）：马
铃薯淀粉 2 g，葡萄糖 2 g，大豆粉 2 g，脱脂奶粉 1 g，
MgSO4·7H2O 1 g，CaCl2 1 g，微量元素液 1 mL
［9］，
VB12 0.5 mg，pH7.2，灭菌前加入 2% 的 XAD-16 大
孔吸附树脂。
1.2 方法
1.2.1 真菌有机相粗提物的制备 将 9 种供试真菌
接种到盛有 50 mL PDA 培养基，28℃，160 r/min 振
荡培养 4-7 d，过滤分离发酵液和菌体。发酵液用等
体积的乙酸乙酯萃取 3 次，合并萃取液，旋转蒸发
浓缩至干 ；菌体用无菌水冲洗 3 次，40℃烘干，50
mL 甲醇萃取 3 次，合并萃取液，旋转蒸发浓缩至干；
用适量甲醇溶解发酵液和菌体萃取物，合并两种溶
液，粗提物终浓度 30 g/L。
1.2.2 真菌水相粗提物的制备 过滤分离真菌培养
物，菌体挤干水分，用无菌石英砂研磨破碎，加
入 50 倍菌体湿重体积的无菌水，涡旋振荡 10 min，
7 000 r/min 离心 10 min，取上清，-20℃过夜，37℃
水浴融化后 7 000 r/min 再次离心 10 min，上清液即
为真菌水相粗提物。对水相粗提物进行高温灭活的
条件 ：121℃、1.01×105 Pa、20 min。
1.2.3 真菌粗提物刺激纤维堆囊菌的试验 用 0.22
μm 的无菌滤膜过滤粗提物，取 50 μL 加入 50 mL
EMP 培养基，定量接入纤维堆囊菌种子悬液，32℃，
160 r/min 培养 7 d。有机相以添加等体积甲醇为对照，
水相以不添加对照。
1.2.4 埃博霉素提取及检测 用真空泵抽滤纤维堆
囊菌发酵液，收获树脂，蒸馏水冲洗 3 次，40℃烘
干，用 5 mL 四氯化碳振荡萃取 12 h，萃取液浓缩至
干，加入 0.5 mL 甲醇溶解，0.45 μm 的有机滤膜过滤，
待液相分析。HPLC 检测条件 ：C8-色谱柱（Inertsil®，
5 μm，4.6×250 mm）；流动相 ：70% 甲醇 -水 ；流速 ：
1 mL/min ；检测波长 ：249 nm ；柱温 ：35℃ ；上样量 ：
20 μL。
1.2.5 真菌的形态学观察与分子生物学鉴定［12］ 从
试管斜面上挑取微量菌丝，点种在 PDA 琼脂平板上，
28℃培养，每天观察其菌落形态。挑取菌落边缘的
菌丝体和子实体制成水浸片在光学显微镜下观察，
拍照。
提取真菌的总 DNA，使用真菌通用引物 NS1
（5-GTAGTCATATGCTTGTCTC-3） 和 NS8（5-TCC-
GCAGGTTCACCTACGGA-3）进行 18S rDNA 的 PCR
扩增。PCR 扩增条件 ：94℃预变性 10 min ；94℃变
性 30 s，55 ℃退火 30 s，72℃延伸 1 min，30 个循
环 ；最后 72℃延伸 5 min。得到的 PCR 产物送上海
生工生物工程公司测序，将 18S rDNA 序列与 NCBI
的 GenBank 数据库中的已有序列进行 Blast 比对，利
用 MEGA 5.05 绘制系统发育树。
2013年第10期 139李亚伟等 ：诱导纤维堆囊菌高产埃博霉素的种间微生物筛选及鉴定
2 结果
2.1 真菌有机相粗提物对合成埃博霉素的影响
试验制得 9 种真菌有机相粗提物，添加于纤
维堆囊菌的发酵培养基，收获吸附有埃博霉素的树
脂，制备埃博霉素的甲醇粗提液，定量检测埃博霉
素的产量，考察 9 种真菌对纤维堆囊菌合成埃博霉
素的影响。结果（图 1）显示，M03 的有机相粗提
物可以使埃博霉素 A 和 B 的产量分别提高 72.3% 和
59.7%（图 2），而 M02 则使其产量降低至空白对照
的 53.4% 和 42.7%，其它 7 种真菌分别对埃博霉素
的合成调控造成了不同程度的促进或抑制。
素合成产生抑制作用。如图 3-B 所示，M03 的发酵
液在较低浓度下对埃博霉素合成影响并不明显，而
当添加浓度增大时，抑制作用会逐渐显现。将 M03
的胞内水相粗提物高温加热灭活，其对埃博霉素的
合成的促进作用消失（图 4）。
ControlM01 M02 M03 M04 M05 M06 M07 M08 M09
0.0
0.4
0.8
1.2
1.6
2.0
Ep
ot
hi
lo
ne
s T
ite
r Ra
tio
to
C
on
tro
l
Fungus Name
EpoA
EpoB
图 1 真菌有机相粗提物对埃博霉素 A 和 B 产量的影响
2.2 M03水相粗提物对合成埃博霉素的影响
考察 M03 的发酵液、胞内水相粗提物和高温灭
活的胞内水相粗提物对纤维堆囊菌埃博霉素合成代
谢的影响，如图 3-A 所示，终浓度为 2%（V/V）的
M03 胞内水相粗提物可诱导埃博霉素 A 和 B 的产率
分别提高 25.6% 和 24.7%，过量添加时则对埃博霉
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 min
0.00
0.25
0.50
0.75
1.00
1.25
1.50
1.75
2.00
2.25
2.50
2.75
3.00 UV x100,000 ࣐M03ԓ䉒⢙
オⲭሩ➗
EpoB
EpoA
图 2 M03 有机相粗提物影响埃博霉素 A 和 B 产量的
HPLC 图谱
Control 0.5 1.0 2.0 3.0 --
0.0
0.4
0.8
1.2
1.6
A
Ep
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l EpoA
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Volume of Addition mL
B
Control 0.5 1.0 2.0 3.0 --
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l EpoA
EpoB
Volume of Addition mL
A ：菌体水相粗提液 ；B ：发酵液
图 3 M03 菌体水相粗提液和发酵液对埃博霉素 A 和 B 合
成的影响
Control 0.5 1.0 2.0 3.0
0.0
0.4
0.8
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l
Volume of Addtion mL
EpoA
EpoB
图 4 高温处理的 M03 菌体水相粗提液对埃博霉素 A 和 B
合成的影响
2.3 M03的形态学和分子生物学鉴定
在 PDA 琼脂平板上 M03 的菌落平坦干燥，早
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第10期140
期呈白色，随着菌落直径的增大，菌落中间逐渐转
变成墨绿色，气生菌丝不发达，有明显的孢子梗和
孢子囊 ；显微状态下，菌丝有隔膜，约 3-7 μm，分
生孢子梗呈绿色，3-8 μm，孢子头呈绿色穗状，顶
囊烧瓶状，直径约 30-40 μm，分生孢子球型，约
2-3 μm（图 5）。查阅真菌鉴定手册，初步判定该菌
株为烟色曲霉。提取该菌株的总 DNA，并用真菌鉴
定的通用引物对 18S rDNA 进行 PCR 扩增，测序结
果在 NCBI 数据库中进行 Blast 比对，并对 M03 和其
近缘种属菌株构建了基于 18S rDNA 序列的系统发
育树（图 6），判定 M03 菌株为烟曲霉（Aspergillus
funigatus）。
博霉素的代谢调控不同，某些可以诱导埃博霉素的
合成，某些则抑制。真菌粗提物对纤维堆囊菌的生
长状态和营养利用几乎没有影响，堆囊菌生物量也
没有明显变化。因此，诱导埃博霉素合成的因素可
能是真菌有机粗提物中的某些小分子信号物质（如
抗生素、诱导因子等）。当纤维堆囊菌感知到这些小
分子外源信号时，会触发对应的应答机制，调控整
体或局部的代谢途径，改变途径中关键酶的活性，
从而影响代谢产物包括埃博霉素的合成。
3.2 烟曲霉水相粗提物对合成埃博霉素的影响
烟曲霉的高浓度水相粗提物对埃博霉素合成有
较为明显的抑制作用，而适量浓度下会激发埃博霉
素的合成。水相粗提物经高温灭活后促进作用消失，
高浓度时会强烈抑制埃博霉素的合成。
有文献报道，自然环境中，低浓度的抗生素可
能会以各式各样的途径调控微生物细胞内的转录应
答，并可能在协调微生物通讯和相互作用过程中担
任重要角色［13］。烟曲霉能产生具有生物活性的抗生
素类代谢产物［14］。在抗生素类异源信号干扰时，纤
维堆囊菌增加有拮抗作用的埃博霉素的合成，可能
正用于调控自身的代谢途径，启动群体对抗危险环
境的转录应答，以保护种群的安全生存。并且，这
种信号物质的活性可能对埃博霉素的合成调控有重
要的影响。
4 结论
根据黏细菌和真菌间可能存在的相互作用，以
真菌粗提物刺激纤维堆囊菌，分析种间微生物对埃
博霉素合成的影响，证实种间识别及竞争等相互作
用可以诱导埃博霉素的合成。
1 cm 5 μm
5 μm 5 μm
图 5 真菌 M03 的菌落和显微形态
Aspergillus penicillioides IFO8155 (AB002078.1)
Aspergillus terreus(GQ338244.1)
Eurotium amstelodami FRR2792 (AB002076.1)
Aspergillus fumigatus UPSC 1771 (AF548061.1)
M03
Aspergillus flavipes NRRL5504 (AB002061.1)
Aspergillus niger YM33182 (DQ915806.1)
Penicillium decumbens L-06 (EU273880.1)
Aspergillus oryzae RIB40 (AP007173.1)
Aspergillus versicolor NRRL238 (AB002064.1)
Aspergillus sparsus IAM13904 (AB002066.1)
96
76
78
42
69
45
62
50
0.001
图 6 基于 18S rDNA 序列构建的 M03 及其近缘菌株的系统发育树
3 讨论
3.1 真菌有机相粗提物对合成埃博霉素的影响
不同真菌的有机相粗提物对纤维堆囊菌合成埃
2013年第10期 141李亚伟等 ：诱导纤维堆囊菌高产埃博霉素的种间微生物筛选及鉴定
参 考 文 献
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（责任编辑 马鑫）